DB51-T1793-2014-青稞黑穗病檢疫鑒定方法-四川省

ICS61.060DB51Y78四川省地方標(biāo)準(zhǔn)DB51/T1793—2014青稞黑穗病檢疫鑒定方法四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB51/T1793—2014目次前言...............................................................................II12范圍..............................................................................1規(guī)范性引用文件....................................................................13術(shù)語(yǔ)和定義........................................................................14設(shè)備和材料........................................................................15培養(yǎng)基和試劑......................................................................26樣品的采集、運(yùn)輸和保存............................................................2789實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)........................................................................2結(jié)果判定..........................................................................4廢棄物處理和防止污染的措施........................................................4附錄A（規(guī)范性附錄）培養(yǎng)基和試劑....................................................5IDB51/T1793—2014前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A為規(guī)范性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由四川出入境檢驗(yàn)檢疫局提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局批準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中華人民共和國(guó)四川出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所、四川省甘孜藏族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：譚志、劉亞西、楊開(kāi)俊、王際睿、胡江濤、帥培強(qiáng)、于剛。IIDB51/T1793—2014青稞黑穗病檢疫鑒定方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了青稞黑穗病植株的檢疫鑒定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于青稞黑穗病植株的檢疫鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489-2008實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求SN/T1193基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。青稞黑穗病smutdiseaseinhulessBarley青稞堅(jiān)黑穗病菌[Ustilagohordei(Pers.)Lagerh]和散黑穗病菌[Ustilagonuda(Jens.)Rostr]同屬于真菌界[Fungi]，擔(dān)子菌綱[Basidiomycetes]，蕉孢亞綱[Teliosporae]，黑粉菌目[Ustilaginales],黑粉菌科[Ustilaginaceae]，黑粉菌屬[Ustilago]。青稞堅(jiān)黑穗病菌和青稞散黑穗病菌侵染青稞時(shí)，孢子堆生于花器，一般破壞病穗的全部小穗，內(nèi)部全為黑褐色或黑色粉末。青稞黑穗病的病狀特點(diǎn)、病原菌孢子形態(tài)和基于分子生物學(xué)的檢測(cè)是檢疫鑒定青稞堅(jiān)黑穗病菌和青稞散黑穗病菌的依據(jù)。除微生物實(shí)驗(yàn)室和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌、培養(yǎng)、樣品前處理設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：1DB51/T1793—20145培養(yǎng)基和試劑5.1馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）：見(jiàn)附錄A中A.1。5.2馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB）：附錄A中A.2。5.3商品化微生物真菌基因組DNA提取試劑盒。5.4青稞堅(jiān)黑穗病菌擴(kuò)增引物：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGGA-3’5’-CCTCCGCTTATTGATATGC-3’。5.5青稞散黑穗病菌擴(kuò)增引物：5’-TGTGGCTCGCACCTGTCCAAC-3’5’-TTCTCCTTGCGTCGCGCTGT-3’。5.6PCR檢測(cè)試劑：MgCl2、dNTPs、Taq聚合酶等。5.7PCR產(chǎn)物染色劑GoldenView（GV）。6樣品的采集、運(yùn)輸和保存在田間采集青稞黑穗病植株上的發(fā)病穗，采集宜在病穗外部包膜未破裂時(shí)進(jìn)行。采集人員帶無(wú)菌手套，在離田塊四邊4~10步（米）遠(yuǎn)的各處，隨機(jī)選擇5個(gè)點(diǎn)取樣,每點(diǎn)用無(wú)菌剪刀剪下2個(gè)病穗，置于無(wú)菌采樣袋中。記錄下采集時(shí)間、地點(diǎn)、采集人。所采集病穗采樣袋送回實(shí)驗(yàn)室后，在通風(fēng)處陰干，在干燥條件下保存，1周內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。孢子堆生于花器，一般破壞病穗的全部小穗，抽出時(shí)有白色膜狀包被，膜較堅(jiān)實(shí)，不易碎裂，內(nèi)部全為黑色粉末，但不易飛散，只殘存穗軸和芒。孢子堆生于花器，一般破壞病穗的全部小穗，表面先為白色薄膜所包被，膜易碎裂，內(nèi)部全為黑褐色或黑色的疏松粉末，易飛散，只殘存穗軸和芒，芒變白干枯。2DB51/T1793—20147.2.1樣品制備：從病穗內(nèi)取出少量黑色粉末，以水作浮載劑，制成玻片，在顯微鏡下觀察孢子大小及形態(tài)。7.2.2病穗內(nèi)孢子特征7.2.2.1感染青稞堅(jiān)黑穗病菌病穗內(nèi)孢子特征：孢子呈球形或橢圓形，表面光滑，綠褐色至深褐色，一邊顏色稍淡，直徑4~9μm，萌芽生圓柱型的擔(dān)子，每一細(xì)胞上僅生擔(dān)孢子（小孢子）1個(gè)，但可連續(xù)產(chǎn)生。7.2.2.2感染青稞散黑穗病菌病穗內(nèi)孢子特征：孢子球形或稍長(zhǎng)，褐色，一邊顏色稍淡，表面布滿細(xì)刺，直徑5~9μm（6.5~9×5~6.5μm），萌芽生菌絲。7.3分子生物學(xué)方法檢驗(yàn)7.3.1樣品制備在超凈工作臺(tái)上用接種環(huán)挑取病穗中黑色的孢子于1mL無(wú)菌生理鹽水中，混勻。取100μL涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)3~5天。挑取馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基平板上的菌落，接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB）中，在搖床中以130r/min，28℃恒溫振蕩培養(yǎng)3~5天。取培養(yǎng)液20mL，8000r/min室溫離心5min，棄去上清，取菌體用于提取菌株基因組DNA。采用商品化微生物真菌基因組DNA提取試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書(shū)的操作步驟，提取病原菌基因組DNA。7.3.3青稞堅(jiān)黑穗病菌PCR反應(yīng)體系配制25μL的PCR反應(yīng)體系包括：1.5mMMgCl2；0.2mMdNTPs；0.1mM的前引物（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGGA-3’）；0.1mM的后引物（5’-CCTCCGCTTATTGATATGC-3’）；0.5單位的Taq聚合酶；25ng的基因組DNA。7.3.4青稞散黑穗病菌PCR反應(yīng)體系配制25μL的PCR反應(yīng)體系包括：1.5mMMgCl2；0.2mMdNTPs；0.1mM的前引物（5’-TGTGGCTCGCACCTGTCCAAC-3’）；0.1mM的后引物（5’-TTCTCCTTGCGTCGCGCTGT-3’）；0.5單位的Taq聚合酶；25ng的基因組DNA。用堅(jiān)黑穗病菌和散黑穗病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA作為陽(yáng)性對(duì)照模板擴(kuò)增，用超純水作為陰性對(duì)照模板擴(kuò)增。第一步：95℃預(yù)變性5min；第二步：95℃變性30s，55℃~60℃退火1min，72℃延伸1min；第三步：循環(huán)第二步40~45次；第四步：72℃延伸2min。3DB51/T1793—20142%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，加入溴酚藍(lán)和二甲苯青作為電泳指示劑，Goldenview染色DNA，以100bpLadderDNAMarker為條帶大小參照標(biāo)準(zhǔn)，電壓8V/cm，電泳時(shí)間30min，凝膠分析成像系統(tǒng)觀察，堅(jiān)黑穗病菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物顯示單一條帶，790bp，判定為含有堅(jiān)黑穗病菌基因組DNA；散黑穗病菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物顯示單一條帶，760bp，判定為含有散黑穗病菌基因組DNA。8結(jié)果判定8.1青稞堅(jiān)黑穗病菌病穗外觀癥狀和病原菌孢子形態(tài)符合7.1.2.1和7.2.3.1描述者，即可鑒定為青稞堅(jiān)黑穗病菌。按7.3.3PCR擴(kuò)增后電泳檢測(cè)結(jié)果為含有堅(jiān)黑穗病菌基因組DNA，鑒定為青稞堅(jiān)黑穗病菌。8.2青稞散黑穗病菌病穗外觀癥狀和病原菌孢子形態(tài)符合7.1.2.2和7.2.3.2描述者，即可鑒定為青稞散黑穗病菌。按7.3.4PCR擴(kuò)增后電泳檢測(cè)結(jié)果為含有散黑穗病菌基因組DNA，鑒定為青稞散黑穗病菌。廢棄物處理和防止污染的措施。9廢棄物處理和防止污染的措施檢驗(yàn)過(guò)程中的廢棄物，收集后焚燒處理。檢驗(yàn)過(guò)程中需防止交叉污染，按GB19489-2008實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求和SN/T1193