高三生物一輪復習課件：第37講發(fā)酵工程

第37講發(fā)酵工程考點一考點二傳統(tǒng)發(fā)酵技術發(fā)酵工程及其應用考點三微生物的基本培養(yǎng)技術考點四微生物的選擇培養(yǎng)與計數第十單元：生物技術與工程考點一傳統(tǒng)發(fā)酵技術【復習目標】1.發(fā)酵的概念及傳統(tǒng)發(fā)酵技術。2.腐乳、泡菜的制作。3.果酒、果醋的制作。復習指導閱讀選必3教材P4~8內容，解決以下問題：(3min)1.什么是發(fā)酵？2.傳統(tǒng)發(fā)酵技術的菌種來源？類型？實質？應用？3.制作腐乳利用了哪些微生物？這些微生物來自哪里？為什么腐乳具有味道鮮美、易于消化吸收的特點？4.制作泡菜用何菌種？該菌種來自哪里？代謝類型、種類以及發(fā)酵原理？簡述泡菜制作流程及相關操作的目的。5.果酒和果醋制作的原理分別是什么？制作流程？需要注意哪些問題？如何評價是否制作成功？1.發(fā)酵的概念一、發(fā)酵與傳統(tǒng)發(fā)酵技術指人們利用________，在適宜條件下，將原料通過_____________轉化為人類所需要的產物的過程。微生物的代謝微生物不同的微生物具有產生不同代謝產物的能力。2.傳統(tǒng)發(fā)酵技術菌種來源：直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次發(fā)酵保存下來的面團、鹵汁等發(fā)酵物中的微生物。類型：________發(fā)酵和________發(fā)酵。生產條件不易控制，易受雜菌污染，生產效率較低，產物不單一等。應用：果酒、果醋、泡菜、醬油等的制作。缺點：實質：______________條件下的物質氧化分解。固體半固體有氧或無氧(2)參與發(fā)酵的微生物，如________、______和______等，其中起主要作用的是______。二、制作腐乳(1)原料：含水量為70%的豆腐。酵母菌曲霉毛霉毛霉豆腐上的白毛—毛霉匍匐菌絲直立菌絲特點：代謝類型：生殖類型：適宜溫度：分布廣泛，具有發(fā)達的菌絲異養(yǎng)需氧型孢子生殖15～18℃含水量過高不易成形，過低不利于毛霉生長。二、制作腐乳蛋白質小分子肽+氨基酸蛋白酶味道鮮美，易于消化吸收，又便于保存。脂肪甘油+脂肪酸脂肪酶(3)發(fā)酵原理：(4)特點：(2)參與發(fā)酵的微生物，如________、______和______等，其中起主要作用的是______。(1)原料：含水量為70%的豆腐。酵母菌曲霉毛霉毛霉含水量過高不易成形，過低不利于毛霉生長。讓豆腐長出毛霉直接利用空氣中的毛霉孢子（15～18℃，一定濕度）目的：讓毛霉等產生蛋白酶和脂肪酶。加鹽腌制加鹵湯裝瓶鹵湯包括酒和香辛料酒（12%）：抑制微生物生長，并使腐乳具有獨特香味；香辛料：調味，防腐殺菌。密封腌制*鹵湯中酒的含量在12%左右的原因：過高會延長腐乳成熟的時間，過低不足以抑制微生物生長，可能導致豆腐腐敗。方法：隨豆腐層數加高增加鹽用量，接近瓶口表面，鋪厚一點目的：析出豆腐中的水分、抑制微生物生長二、制作腐乳(5)制作腐乳方法步驟前期不密封，是要讓毛霉菌大量繁殖，從而形成外面一層皮；后期密封，主要是以增強口感為主，要控制毛霉的增長。三、泡菜的制作1.菌種：乳酸菌（原核生物）異養(yǎng)厭氧型空氣、土壤、植物體表、人或動物腸道內乳酸鏈球菌、乳酸桿菌乳酸鏈球菌（球狀）

乳酸桿菌（桿狀）2.原理：在無氧的情況下能將葡萄糖分解成乳酸。C6H12O62C3H6O3（乳酸）+能量酶a.菌種分布：b.代謝類型：c.菌種種類：發(fā)酵期間，乳酸會___________，當它的質量百分比為____________時，泡菜的口味、品質最佳。不斷積累0.4%~0.8%用清水和食鹽配制質量百分比為5%-20%的鹽水，并將鹽水煮沸，冷卻待用。將冷卻好的鹽水緩緩倒入壇中，使鹽水沒過菜料，蓋好壇蓋。配制鹽水原料處理、蔬菜裝壇加鹽水封壇發(fā)酵向壇蓋邊緣的水槽中注滿水，并在發(fā)酵過程中注意經常向水槽中補充水；根據室內溫度控制發(fā)酵時間。將新鮮蔬菜洗凈，切成塊狀或條狀，混合均勻，晾干后裝入泡菜壇內；裝至半壇時，加入蒜瓣、生姜及其他香辛料，繼續(xù)裝至八成滿。過高：乳酸發(fā)酵受抑制，泡菜風味差。過低：雜菌易繁殖，導致泡菜變質。殺菌、除氧不影響乳酸菌的生命活動泡菜發(fā)酵初期，大腸桿菌、酵母菌等較為活躍，產生較多的CO2，防止發(fā)酵液溢出壇外；防止因太滿使鹽水未完全淹沒菜料而導致菜料變質腐爛；留有一定空間，方便拿取泡菜。創(chuàng)造無氧環(huán)境三、泡菜的制作3.制作流程：泡菜上的一層白膜，是酵母菌生長繁殖形成的。

亞硝酸鹽為強氧化劑，能夠把血液中的低鐵血紅蛋白轉變?yōu)楦哞F血紅蛋白，從而導致缺氧性中毒癥狀。在泡菜的腌制過程中會有亞硝酸鹽產生。一般不會危害人體健康。但是，總量達到0.3～0.5g時會引起中毒；達到3g時會死亡。①亞硝酸鹽

在適宜的pH、溫度和一定的微生物作用下，亞硝酸鹽會轉化為亞硝胺。亞硝胺具有致癌作用，對動物具有致畸和致突變作用。②亞硝胺氧化維生素C、E和酚類物質亞硝胺硝酸鹽亞硝酸鹽還原細菌等微生物(硝酸還原菌產生硝酸鹽還原酶)(強致癌物)知識拓展發(fā)酵時期乳酸菌乳酸亞硝酸鹽發(fā)酵前期發(fā)酵中期發(fā)酵后期變化曲線少(O2抑制乳酸菌活動)少增加（硝酸鹽還原菌的作用）最多（乳酸積累，抑制其他菌活動）增多達到最多后開始下降（硝酸鹽還原菌受抑制，部分亞硝酸鹽被分解）泡菜腌制過程中乳酸菌、乳酸和亞硝酸鹽的變化減少(乳酸積累，pH下降，抑制乳酸菌活動)繼續(xù)增多，最后保持穩(wěn)定下降至保持相對穩(wěn)定（硝酸鹽還原菌被完全抑制）（1）制作的泡菜“咸而不酸”的原因：_________________________________________________________________________?？赡苁鞘雏}濃度過高、發(fā)酵溫度過低抑制乳酸菌的活性，導致泡菜未能正常發(fā)酵（2）乳酸菌是厭氧菌，發(fā)酵時需控制嚴格的無氧環(huán)境。嘗試說出泡菜制作過程中制造無氧環(huán)境的措施：___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。

①選擇氣密性好的泡菜壇。②鹽水煮沸后冷卻待用。③裝壇時壓實，鹽水沒過全部菜料。④蓋上壇蓋后要在壇蓋邊沿的水槽中注滿水；發(fā)酵期間不宜開蓋，并注意在發(fā)酵過程中經常向水槽中補充水

存放時間過長、變質的蔬菜中含有大量的亞硝酸鹽，亞硝酸鹽在特定的條件下會轉變成亞硝胺，亞硝胺有致癌作用新考案P323（1）（2023·山東卷）以泡菜壇為容器制作泡菜時蓋好壇蓋后，向壇蓋邊沿的水槽中注滿水是為了使氣體只能從泡菜壇排出而不能進入。()√提示蓋好壇蓋后，向壇蓋邊沿的水槽中注滿水是為了排氣減壓、隔絕空氣、防止雜菌污染。（2）在配制泡菜水時，應將清水煮沸冷卻后再配制質量分數為5%~20%的鹽水。()×新考案P3231.（2023·山東卷）以下是以泡菜壇為容器制作泡菜時的4個處理：①沸鹽水冷卻后再倒入壇中；②鹽水需要浸沒全部菜料；③蓋好壇蓋后，向壇蓋邊沿的水槽中注滿水；④檢測泡菜中亞硝酸鹽的含量。下列說法正確的是()。CA.①主要是為了防止菜料表面的醋酸桿菌被殺死B.②的主要目的是用鹽水殺死菜料表面的雜菌C.③是為了使氣體只能從泡菜壇排出而不能進入D.④可檢測到完整發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量逐漸降低新考案P324泡菜的制作考向1項目制作果酒制作果醋菌種植物體表面天然的酵母菌(真核)空氣中的醋酸菌（原核生物）代謝類型

型

型發(fā)酵原理溫度發(fā)酵溫度為_______℃，釀酒酵母最適生長溫度約為____℃最適生長溫度為__________℃氧氣異養(yǎng)兼性厭氧異養(yǎng)需氧1.制作原理與發(fā)酵條件有氧條件酵母菌有氧呼吸大量繁殖：無氧條件酵母菌進行酒精發(fā)酵：C6H12O6+6O2+6H2O6CO2+12H2O+能量酶C6H12O62C2H5OH+2CO2+能量酶當氧氣、糖源充足時：當缺少糖源時：酶C2H5OH＋O2

CH3COOH＋H2O+能量C6H12O6＋2O2

2CH3COOH＋2CO2＋2H2O+能量酶前期需氧，后期無氧一直需要充足的氧氣四、果酒和果醋的制作2830～3518～30①先讓酵母菌進行有氧呼吸，快速繁殖，耗盡O2后，再進行酒精發(fā)酵；②防止發(fā)酵過程中產生的CO2造成發(fā)酵液溢出。將溫度控制在18～30℃進行發(fā)酵，在發(fā)酵過程中，每隔12h左右將瓶蓋擰松一點（注意：不是打開瓶蓋）,此后再擰緊瓶蓋。發(fā)酵時間為10～12d?？赏ㄟ^從發(fā)酵瓶口取樣來對發(fā)酵的情況進行檢測。排出氣體防止氧氣進入和雜菌污染將發(fā)酵瓶、榨汁機等器具用洗潔精清洗干凈，并用體積分數為70%的酒精消毒，晾干備用。取新鮮葡萄，用清水沖洗1-2次，再去除枝梗和腐爛的籽粒，瀝干。用榨汁機榨取葡萄汁，將葡萄汁裝入發(fā)酵瓶（注意：要留有大約1/3的空間），蓋好瓶蓋。果酒發(fā)酵器具消毒沖洗葡萄榨汁裝瓶去除表面灰塵、污物防止野生菌種數量減少，影響發(fā)酵避免葡萄破損，減少被雜菌污染的機會2.制作流程2.制作流程將溫度控制在18～30℃進行發(fā)酵，在發(fā)酵過程中，每隔12h左右將瓶蓋擰松一點（注意：不是打開瓶蓋），此后再擰緊瓶蓋。發(fā)酵時間為10～12d?？赏ㄟ^從發(fā)酵瓶口取樣來對發(fā)酵的情況進行檢測。將發(fā)酵瓶、榨汁機等器具用洗潔精清洗干凈，并用體積分數為70%的酒精消毒，晾干備用。取新鮮葡萄，用清水沖洗1-2次，再去除枝梗和腐爛的籽粒，瀝干。用榨汁機榨取葡萄汁，將葡萄汁裝入發(fā)酵瓶（注意：要留有大約1/3的空間），蓋好瓶蓋。果酒發(fā)酵器具消毒沖洗葡萄榨汁裝瓶果醋發(fā)酵當葡萄酒制作完成后，打開瓶蓋，蓋上一層紗布，進行葡萄醋的發(fā)酵。發(fā)酵溫度為30～35℃，時間為7～8d?？諝庵械拇姿峋鷷M入果酒發(fā)酵液中大量繁殖；又減少空氣中的塵土污染。[思考1]在制作果酒和果醋的過程中，發(fā)酵液分別有哪些變化？其中最明顯的變化發(fā)生在發(fā)酵后多少天？引起變化的原因是什么？①果酒：發(fā)酵液（會或不會）_____出現(xiàn)氣泡；最明顯的變化：_________；紫色葡萄皮的

進入發(fā)酵液，使葡萄酒呈______色。會花青素深紅10天左右②果醋：一般（會或不會）______出現(xiàn)氣泡；發(fā)酵完成時，在發(fā)酵液的液面會出現(xiàn)一層菌膜，是_________膜。不會醋酸菌[思考2]在制作果酒的過程中，除了酵母菌，是否還有其他微生物生長？它們會對果酒發(fā)酵產生影響嗎？如果有，如何避免這種影響？①制酒過程中，還有_________________等微生物；乳酸菌、醋酸菌②控制乳酸菌數量：

控制醋酸菌數量：(發(fā)酵為醋酸)(使果酒變質)減少O2含量；調節(jié)發(fā)酵溫度、pH調節(jié)發(fā)酵的溫度、pH等；[思考3]怎樣判斷果酒、果醋的制作是否成功呢？①果酒：a.聞

b.品嘗

c.用酸性條件下的重鉻酸鉀溶液檢測（橙色→灰綠色）②果醋：a.聞

b.品嘗

c.使用pH試紙檢測和比較發(fā)酵前后的pH值

d.觀察醋酸菌膜是否形成[思考4]在實際生產中，釀酒大缸并非處于無菌環(huán)境中，但大缸發(fā)酵液很少有雜菌的污染，為什么？在缺氧、呈酸性的發(fā)酵液中，酵母菌可以生長繁殖，而絕大多數其他微生物都因無法適應這一環(huán)境而生長受到抑制。此外，發(fā)酵產物酒精對微生物有毒害作用。通用發(fā)酵裝置充氣口排氣口出料口排出CO2防止空氣中微生物的污染排氣口通過一個長而彎曲的膠管與瓶身連接，其目的是：用來取樣，及時監(jiān)測發(fā)酵進行的情況發(fā)酵前期充氣口打開，輸入無菌空氣讓酵母茵增殖，后期關閉充氣口，進行酒精發(fā)酵；在醋酸發(fā)酵時連接充氣泵進行充氣。(填充棉花或者安裝其他過濾裝置)[P8

練習與應用·拓展應用3]果酒和果醋發(fā)酵改進裝置及其分析

（2）果酒發(fā)酵時先通氣后密封的目的是____________________________________________________。先通氣使酵母菌大量繁殖，后密封使酵母菌進行酒精發(fā)酵

許多新鮮水果的果皮表面附著有大量的不同種類的野生酵母菌，所以不需要添加酵母菌；果酒中除了酵母菌，還有乳酸菌、醋酸菌等微生物，傳統(tǒng)方法不能將酵母菌有效分離，而乳酸菌可能分解果酒中的糖等，從而使果酒變質，造成果酒的口感和品質下降(1)(2021·山東卷)葡萄酒的制作過程中隨著發(fā)酵的進行發(fā)酵液中糖含量增加?！?2)(2022·湖北卷)在白酒、啤酒和果酒的發(fā)酵初期需要提供一定的氧氣。√(3)在果酒、果醋的發(fā)酵裝置中，充氣口的作用是在酒精發(fā)酵時連接充氣泵進行充氣，排氣口的作用是在酒精發(fā)酵時排出二氧化碳。()×新考案P3232.（2021·遼寧卷）利用菠蘿蜜制作果醋的大致流程為：先在滅菌的果肉勻漿中接種酵母菌，發(fā)酵6天后，再接入活化的醋酸桿菌，發(fā)酵5天。下列有關敘述錯誤的是()。BA.乙醇既是醋酸發(fā)酵的底物，又可以抑制雜菌繁殖B.酵母菌和醋酸桿菌均以有絲分裂的方式進行增殖C.酵母菌和醋酸桿菌發(fā)酵過程中控制通氣的情況不同D.接入醋酸桿菌后，應適當升高發(fā)酵溫度新考案P324果酒和果醋的制作考向2考點二

發(fā)酵工程及其應用【復習目標】1.發(fā)酵工程的概念。2.發(fā)酵工程的基本環(huán)節(jié)。3.啤酒的工業(yè)化生產。4.發(fā)酵工程的應用。復習指導閱讀選必3教材P22~27內容，解決以下問題：(5min)1.發(fā)酵工程的概念？2.發(fā)酵工程的基本環(huán)節(jié)包括哪些？3.啤酒工業(yè)化生產的流程及其操作目的？4.發(fā)酵工程的特點有哪些？5.發(fā)酵工程具體應用在哪些方面？2.基本環(huán)節(jié)：發(fā)酵工程主要包括

，

，培養(yǎng)基的配制、滅菌，接種，發(fā)酵，產品的

等方面。一、發(fā)酵工程的概念1.基本概念：發(fā)酵工程是指利用

的特定功能，通過

，規(guī)模化生產對人類有用的產品。它涉及菌種的選育和培養(yǎng)、產物的分離和提純等方面。微生物現(xiàn)代工程技術菌種的選育擴大培養(yǎng)分離、提純在青霉素生產過程中如果有雜菌污染，某些雜菌會分泌青霉素酶，將青霉素分解掉。生產檸檬酸生產啤酒生產味精黑曲霉啤酒酵母谷氨酸棒狀桿菌在菌種確定之后，要選擇原料制備培養(yǎng)基。在生產實踐中，培養(yǎng)基的配方要經過反復試驗才能確定。接種選育菌種制備培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)滅菌發(fā)酵罐內發(fā)酵分離、提純產物獲得產品性狀優(yōu)良的菌種可以從自然界中篩選出來，也可以通過誘變育種或基因工程育種獲得。發(fā)酵工程中所用的菌種大多數是單一菌種，一旦有雜菌污染，可能導致產量大大下降。因此，培養(yǎng)基和發(fā)酵設備都必須經過嚴格的滅菌。工業(yè)發(fā)酵罐的體積一般為幾十到幾百立方米，接入的菌種總體積需要幾立方米到幾十立方米。所以，在發(fā)酵之前還需要對菌種進行擴大培養(yǎng)現(xiàn)代發(fā)酵工程使用的大型發(fā)酵罐均有計算機控制系統(tǒng)，能對發(fā)酵過程中的溫度、pH、溶解氧、罐壓、通氣量、攪拌、泡沫和營養(yǎng)等進行監(jiān)測和控制；還可以進行反饋控制，使發(fā)酵全過程處于最佳狀態(tài)。這是發(fā)酵工程的中心環(huán)節(jié)。在發(fā)酵過程中，要隨時檢測培養(yǎng)液中微生物的數量、產物的濃度等，以了解發(fā)酵進程。還要及時添加必需的營養(yǎng)組分，要嚴格控制溫度、pH和溶解氧等發(fā)酵條件。環(huán)境條件不僅會影響微生物的生長繁殖，而且會影響微生物代謝物的形成。如果發(fā)酵產品是微生物細胞本身，可在發(fā)酵結束之后，采用過濾、沉淀等方法將菌體分離和干燥，即可得到產品。如果產品是代謝物，可根據產物的性質采取適當的提取、分離和純化措施來獲得產品。二、發(fā)酵工程基本環(huán)節(jié)電動機D1排氣管C3pH計B3冷卻水排出口C2冷卻夾層發(fā)酵液攪拌葉輪D2生物傳感器裝置B4空氣入口A4放料管A2A3閥門A1培養(yǎng)物或營養(yǎng)物質的加入口B1觀察孔B2取樣管B5溫度傳感器和控制裝置冷卻水進入口C1編號主要用途A1-A3A4B1-B5C1、C2C3D1、D2控制培養(yǎng)物以一定速度進入、流出發(fā)酵罐，實現(xiàn)連續(xù)培養(yǎng)控制溶解氧通過肉眼觀察、儀器檢測等監(jiān)控發(fā)酵條件以及發(fā)酵過程，B2處抽取樣品進一步檢測。通過控制冷水流速調節(jié)罐溫調節(jié)罐壓電機帶動葉輪轉動進行攪拌，使微生物與發(fā)酵液混合均勻，加快氧氣溶解以及散熱。發(fā)酵罐示意圖及功能介紹①生產條件________。②原料來源豐富且價格________。③產物________。④廢棄物對環(huán)境的污染___、容易處理等。溫和

低廉

專一

小三、發(fā)酵工程的特點因此，發(fā)酵工程在食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、農牧業(yè)等許多領域得到了廣泛的應用，形成了規(guī)模龐大的發(fā)酵工業(yè)。四、發(fā)酵工程的應用1.在食品工業(yè)上的應用食品工業(yè)是微生物最早開發(fā)和應用的領域。一直以來，與發(fā)酵有關的食品工業(yè)的產量和產值都居于發(fā)酵工業(yè)的首位。a.生產傳統(tǒng)發(fā)酵產品實例1：生產醬油大豆黑曲霉(蛋白酶)蛋白質水解成小分子的肽和氨基酸淋洗、調制醬油實例2：釀酒谷物或水果釀酒酵母各種酒類啤酒的工業(yè)化生產流程發(fā)芽焙烤碾磨糖化蒸煮發(fā)酵冷卻大麥種子發(fā)芽，釋放淀粉酶加熱殺死種子胚但不使淀粉酶失活將干燥的麥芽碾磨成麥芽粉淀粉分解，形成糖漿產生風味組分，終止酶的進一步作用，并對糖漿滅菌酵母菌將糖轉化為酒精和CO2殺死啤酒中的大多數微生物，延長它的保存期。消毒終止過濾過濾、調節(jié)、分裝啤酒進行出售。主發(fā)酵：酵母菌繁殖，大部分糖分解和代謝物生成。(生啤)后發(fā)酵：在低溫、密閉的環(huán)境下儲存一段時間，形成澄清、成熟的啤酒。【P25思考·討論】“精釀”啤酒是小規(guī)模釀造產品，發(fā)酵時間長、產量低價格高。它的制作工藝與普通啤酒有所不同，如：一般不添加食品添加劑、不進行過濾和消毒處理等。有人認為飲用“精釀”啤酒比飲用“工業(yè)”啤酒更健康，你怎么看待這問題？我們如何辯證看待大規(guī)模生產與小規(guī)模制作？一方面，這類產品具有多樣化的特點，能夠滿足一些人對獨特口感的需求，或者滿足一些人的時尚追求。另一方面，這類產品是手工作坊式生產的，存在啤酒品質不穩(wěn)定、價格昂貴的問題。四、發(fā)酵工程的應用1.在食品工業(yè)上的應用b.生產各種各樣的食品添加劑增加食物的營養(yǎng)，改善食品的口味、色澤和品質，延長食品的保存期。添加劑類型舉例酸度調節(jié)劑L-蘋果酸、檸檬酸、乳酸增味劑5`-肌苷酸二鈉、谷氨酸鈉著色劑β-胡蘿卜素、紅曲黃色素增稠劑黃原膠、β-環(huán)狀糊精、結冷膠防腐劑乳酸鏈球菌、溶菌酶由谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵可以得到谷氨酸(中性和弱堿性條件下)；谷氨酸經過一系列處理就能制成味精。c.生產酶制劑常見酶制劑：α-淀粉酶、β-淀粉酶、果膠酶、氨基肽酶、脂肪酶。少數由動植物生產，絕大多數通過發(fā)酵工程生產。四、發(fā)酵工程的應用2.在醫(yī)藥工業(yè)上的應用基因工程、蛋白質工程與發(fā)酵工程相結合動植物的基因微生物直接改造微生物轉入微生物病原體的抗原基因轉入發(fā)酵工程藥物藥物疫苗各種抗生素多種氨基酸多種激素多種免疫調節(jié)劑四、發(fā)酵工程的應用3.在農牧業(yè)上的應用a.生產微生物肥料b.生產微生物農藥c.生產微生物飼料利用微生物在代謝過程中產生的有機酸、生物活性物質等來增進土壤肥力、改良土壤結構、促進植株生長；抑制土壤中病原微生物的生長，減少病蟲害的發(fā)生。利用微生物或其代謝物來防治病蟲害。以淀粉或纖維素的水解液、制糖工業(yè)廢料等為原料，通過發(fā)酵獲得的大量微生物菌體，即單細胞蛋白?！锓乐卧谇噘A飼料中添加乳酸菌，可以提高飼料的品質，使飼料保鮮，動物食用后還能提高免疫力。四、發(fā)酵工程的應用3.在農牧業(yè)上的應用發(fā)酵工程正滲透到幾乎所有的工農業(yè)領域，在助力解決糧食、環(huán)境、健康和能源等方面的重大問題上，作出了越來越大的貢獻。利用纖維廢料發(fā)酵生產酒精、乙烯等能源物質。利用嗜熱菌、嗜鹽菌生產洗滌劑；嗜低溫菌有助于提高熱敏性產品的產量。①解決資源短缺和環(huán)境污染問題②對極端微生物（生活在高溫、高壓、高鹽和低溫環(huán)境）的利用(1)分離、提純酵母菌發(fā)酵生產的單細胞蛋白，可采用過濾、沉淀等方法。()√(2)在連續(xù)培養(yǎng)過程中補充的同種培養(yǎng)液和空氣必須先滅菌。()√(3)發(fā)酵罐中微生物的生長繁殖、代謝物的形成速度都與攪拌速度有關。()√(4)（2022·山東卷）在青霉素的工業(yè)化生產過程中，選育出的高產菌株經擴大培養(yǎng)后才可接種到發(fā)酵罐中。()√新考案P3251.（2021·廣東卷）中國科學家運用合成生物學方法構建了一株嗜鹽單胞菌H

，以糖蜜（甘蔗榨糖后的廢棄液，含較多蔗糖）為原料，在實驗室發(fā)酵生產PHA等新型高附加值可降解材料，期望提高甘蔗的整體利用價值。工藝流程如圖?；卮鹣铝袉栴}：（1）為提高菌株H

對蔗糖的耐受能力和利用效率，可在液體培養(yǎng)基中將蔗糖作為__________，并不斷提高其濃度，經多次傳代培養(yǎng)（指培養(yǎng)一段時間后，將部分培養(yǎng)物轉入新配的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)）以獲得目標菌株。培養(yǎng)過程中定期取樣并用_____________的方法進行菌落計數，評估菌株增殖狀況。此外，選育優(yōu)良菌株的方法還有_______________________等。(答出2種方法即可)唯一碳源稀釋涂布平板誘變育種、基因工程育種新考案P325-326發(fā)酵工程及應用考向（2）基于菌株H

嗜鹽、酸堿耐受能力強等特性，研究人員設計了一種不需要滅菌的發(fā)酵系統(tǒng)，其培養(yǎng)基鹽濃度設為60

g?L?1，pH為10，菌株H可正常持續(xù)發(fā)酵60d

以上。該系統(tǒng)不需要滅菌的原因是________________________________________________________________________________________________________________。（答出2點即可）鹽濃度為60

g?L?1的條件下，其他雜菌因失水過多而死亡；pH為10的條件下，其他雜菌的酶變性失活，生長繁殖受抑制（3）研究人員在工廠進行擴大培養(yǎng)，在適宜的營養(yǎng)物濃度、溫度、pH條件下發(fā)酵，結果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中菌株H細胞增殖和PHA

產量均未達到預期，并產生了少量乙醇等物質，說明發(fā)酵條件中____________________可能是高密度培養(yǎng)的限制因素。氧氣（O2或溶解氧）（4）菌株H還能通過分解餐廚垃圾（主要含蛋白質、淀粉、油脂等）來生產PHA，說明其能分泌__________________________。蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等2.（2022·山東卷）青霉菌處在葡萄糖濃度不足的環(huán)境中時，會通過分泌青霉素殺死細菌，以保證自身生存所需的能量供應。目前已實現(xiàn)青霉素的工業(yè)化生產，關于該生產過程，下列說法錯誤的是()。DA.發(fā)酵液中的碳源不宜使用葡萄糖B.可用深層通氣液體發(fā)酵技術提高產量C.選育出的高產菌株經擴大培養(yǎng)后才可接種到發(fā)酵罐中D.青霉素具有殺菌作用，因此發(fā)酵罐不需嚴格滅菌新考案P326發(fā)酵工程及應用考向考點三

微生物的基本培養(yǎng)技術【復習目標】1.培養(yǎng)基的配制。2.無菌技術。3.微生物的純培養(yǎng)。復習指導閱讀選必3教材P9~13內容，解決以下問題：(5min)1.什么是培養(yǎng)基？培養(yǎng)基的種類？培養(yǎng)基的配制有哪些成分組成？2.什么是無菌技術？無菌技術的目的？3.常用的消毒方法與滅菌方法的比較？4.培養(yǎng)物、純培養(yǎng)物的概念？微生物純培養(yǎng)的步驟？5.平板劃線法要注意的問題？1.定義：人們按照微生物對_________的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質。一、培養(yǎng)基的配制營養(yǎng)物質劃分標準培養(yǎng)基種類特點用途物理性質液體培養(yǎng)基不加凝固劑大量繁殖增菌(擴大培養(yǎng))、工業(yè)生產半固體培養(yǎng)基加凝固劑，如瓊脂(在98℃以上熔化，熔化后的溶液溫度需降到44℃以下凝固。)觀察微生物的運動、分類鑒定固體培養(yǎng)基微生物分離、鑒定、活菌計數、保存菌種化學成分天然培養(yǎng)基含化學成分不明確的天然物質工業(yè)生產合成培養(yǎng)基用已知成分的化學物質配制分類、鑒定劃分標準培養(yǎng)基種類特點用途用途選擇培養(yǎng)基加入(或缺少)某種化學物質，允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長培養(yǎng)、分離出特定微生物鑒別培養(yǎng)基加入某種指示劑或化學藥品鑒別不同種類微生物【注意】病毒為非細胞結構生物，只能在活細胞中營寄生生活，目前不能利用人工培養(yǎng)基來培養(yǎng)。一、培養(yǎng)基的配制2.營養(yǎng)構成：一般都含有_____、________、______和______等營養(yǎng)物質。無機鹽碳源氮源水一、培養(yǎng)基的配制CO2、CO32-、HCO3-葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物無機碳源：有機碳源：①碳源功能：主要用于構成細胞物質和一些代謝產物；有機碳既是碳源又是異養(yǎng)微生物的能源物質。NH4＋、NO3-、NH3、N2等牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等無機氮源：有機氮源：②氮源功能：主要用于合成蛋白質、核酸及含氮代謝產物等。固氮微生物：如硝化細菌③水：是微生物生長和代謝必不可少的營養(yǎng)物質。④無機鹽：提供無機營養(yǎng)、調節(jié)酸堿平衡、維持滲透壓。都可以提供碳源、氮源、維生素等，此外牛肉膏還可以提供磷酸鹽。一、培養(yǎng)基的配制⑤培養(yǎng)基還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質以及氧氣的需求。培養(yǎng)厭氧微生物時，需要提供

的條件。培養(yǎng)乳酸桿菌時，需要在培養(yǎng)基中添加

；培養(yǎng)霉菌時，需要將培養(yǎng)基調至

；培養(yǎng)細菌時，需要將培養(yǎng)基調至

；維生素酸性中性或弱堿性無氧生長因子、氨基酸、維生素、堿基等2.營養(yǎng)構成：一般都含有_____、________、______和______等營養(yǎng)物質。無機鹽碳源氮源水為維持pH的相對恒定，可在培養(yǎng)基中加入緩沖劑，常用K2HPO4—KH2PO4。二、無菌技術2.滅菌：是指使用_____的理化方法殺死物體內外_____的微生物，包括芽孢和孢子。獲得純凈的微生物培養(yǎng)物的關鍵是______________，主要包括消毒和滅菌。1.消毒：是指使用較為_____的物理、化學或生物等方法殺死物體_____或內部_________微生物。溫和表面一部分強烈所有滅菌與消毒的區(qū)別在于是否能夠把芽孢和孢子等所有微生物去除。獲得純凈的微生物是研究和應用微生物的前提，也是發(fā)酵工程的重要基礎。防止雜菌污染P10旁欄思考:無菌技術除用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么作用？同時避免細菌污染環(huán)境和操作者被微生物感染。操作的空間、操作者的衣著和手用于培養(yǎng)微生物的器皿、接種用具和培養(yǎng)基類型適用對象操作方法作用煮沸消毒法巴氏消毒法

化學藥物消毒法

紫外線消毒法日常生活用品100℃煮沸5～6min牛奶等不耐高溫的液體63～65℃消毒30min或72～76℃處理15s或80～85℃處理10s～15s生物活體(皮膚、傷口)、水源等如用酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源紫外線照射30min接種室、接種箱，超凈工作臺可以殺死微生物營養(yǎng)細胞和一部分芽孢可以殺死絕大多數的微生物，不破壞營養(yǎng)成分可以使微生物的蛋白質變性，失去正常功能而死亡可以殺死物體表面或空氣中的微生物(紫外線能損傷DNA結構）照射前適當噴灑苯酚或煤酚皂溶液等消毒液體積分數為70%～75%的酒精，濃度過高時，菌體表面蛋白質變性過快，從而凝固成一層保護膜，使乙醇分子不能滲入其中；酒精濃度過低時，酒精的殺菌能力減弱。二、無菌技術①常用的消毒方法相關信息（P10）：生物消毒法是指利用生物或其代謝物除去環(huán)境中的部分微生物的方法。例如有的微生物能夠寄生于多種細菌體內，使細菌裂解，因此可以用它們來凈化污水、污泥。②常用的滅菌方法二、無菌技術a.濕熱滅菌法利用沸水流通蒸汽高壓蒸汽進行滅菌的方法效果最好：高壓蒸汽滅菌100kPa121℃15~30min高壓蒸汽滅菌鍋培養(yǎng)基、無菌水等（需要保持一定的水分）適用對象：若壓力達到設定要求，而鍋內并沒有達到相應溫度，最可能的原因是未將鍋內冷空氣排盡。干熱滅菌箱b.干熱滅菌法滅菌物品放入密閉容器160~170℃1~2h如玻璃器皿、金屬用具。耐高溫和需要保持干燥的物品適用對象：②常用的滅菌方法二、無菌技術c.灼燒滅菌法接種工具涂布器接種環(huán)接種針其他金屬工具接種過程試管口瓶口直接在酒精燈火焰的充分燃燒層（外焰）灼燒三、微生物的純培養(yǎng)（一）培養(yǎng)物、純培養(yǎng)物、純培養(yǎng)概念辨析1.培養(yǎng)物：在微生物學中，將接種于培養(yǎng)基內，在合適條件下形成的含特定種類微生物的群體。2.純培養(yǎng)物：由單一個體繁殖所獲得的微生物群體。（二）純培養(yǎng)的步驟配置培養(yǎng)基滅菌倒平板接種和分離培養(yǎng)3.純培養(yǎng)：獲得純培養(yǎng)物的過程就是純培養(yǎng)。探究

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實踐：酵母菌的純培養(yǎng)1.實驗原理①菌落：分散的微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結構的子細胞群體，這就是菌落。念珠菌顯色培養(yǎng)基大腸桿菌培養(yǎng)基酵母菌培養(yǎng)基金黃色葡萄球菌和枯草桿菌培養(yǎng)基注意：菌落屬于種群；菌落的大小、形狀、隆起程度、光澤度、顏色、透明度等菌落特征是鑒定菌種的重要依據。②純培養(yǎng)的方法：分散或稀釋繁殖單個細胞微生物群單個菌落平板劃線法稀釋涂布平板法1.實驗原理采用平板劃線法和稀釋涂布平板法能將單個微生物分散在固體培養(yǎng)基上，之后經培養(yǎng)得到的單菌落一般是由單個微生物繁殖形成的純培養(yǎng)物。探究

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實踐：酵母菌的純培養(yǎng)探究

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實踐：酵母菌的純培養(yǎng)①

配制培養(yǎng)基第1步：制備培養(yǎng)基2.方法步驟稱取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水1000mL，加熱煮沸至馬鈴薯軟爛，用紗布過濾。向濾液中加入20g葡萄糖、15-20g瓊脂，用蒸餾水定容至1000mL。計算稱量溶化定容②滅菌：培養(yǎng)基：高壓蒸汽滅菌，100kPa、121℃，15～30min；培養(yǎng)皿：干熱滅菌，160～170℃

，滅菌2h。將配好的培養(yǎng)基，轉移到錐形瓶滅菌。③倒平板待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右，在酒精燈火焰附近倒平板。③倒平板第1步：制備培養(yǎng)基2.方法步驟待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右，在酒精燈火焰附近倒平板。1拔出錐形瓶的棉塞。2將瓶口迅速通過火焰。3用拇指和食指將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿（10～20mL），立即蓋上皿蓋。4等待培養(yǎng)基冷卻凝固后，將培養(yǎng)皿倒過來放置。倒平板注意事項：①溫度：50℃左右②操作：在酒精燈火焰附近③冷凝后平板倒置防止雜菌污染培養(yǎng)基。探究

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實踐：酵母菌的純培養(yǎng)(3)培養(yǎng)基滅菌后需要冷卻到50℃左右時才能倒平板，為什么？用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺溫度下降到剛剛不燙手時即可。(2)在滅菌前，用牛皮紙、舊報紙包緊盛有培養(yǎng)基的錐形瓶的目的是什么？(1)培養(yǎng)基PH要適宜，調PH是在滅菌前還是滅菌后？如果需要調節(jié)培養(yǎng)基的PH，應該在定容完成后，滅菌之前進行操作。思維提升計算稱量溶化定容調PH滅菌倒平板瓊脂在98℃以上熔化，在44℃以下凝固。高于50℃會燙手，溫度過低瓊脂會凝固。①在滅菌時能避免水蒸汽凝結時浸濕棉塞。②在取出培養(yǎng)基錐形瓶時也起到隔絕空氣中雜菌污染的作用。(5)

在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？(6)平板冷凝后，為什么要將平板倒置？既可以避免培養(yǎng)基中的水分過快蒸發(fā)，保持培養(yǎng)基的水分；又可防止皿蓋上的冷凝水落入培養(yǎng)基造成污染。(4)倒平板時，為什么將錐形瓶瓶口迅速通過火焰？通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。因為空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。思維提升探究

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實踐：酵母菌的純培養(yǎng)第2步：接種和分離酵母菌2.方法步驟接種：指在無菌條件下將微生物或含菌材料轉移到適合其生長繁殖的培養(yǎng)基中的過程。接種工具：接種針——用于穿刺接種；接種環(huán)——用于斜面接種或平板劃線接種；涂布器——用于涂布平板接種；接種的方法：平板劃線法、稀釋涂布平板法、穿刺接種法、斜面接種法。通過接種環(huán)在固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基表面。經過數次劃線后培養(yǎng)，可以分離得到單菌落。1將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)的金屬絲燒紅。2在火焰旁冷卻接種環(huán)。同時，拔出裝有酵母菌培養(yǎng)液的試管的棉塞。將試管口通過火焰。34在火焰附近用接種環(huán)蘸取一環(huán)菌液。防止溫度太高殺死菌種。平板劃線法的具體操作5將試管口通過火焰，并塞上棉塞。在火焰附近將皿蓋打開一條縫隙，用接種環(huán)在培養(yǎng)基表面基表面迅速劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。6灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一次劃線的末端開始作第二次劃線。重復以上操作，作第三、四、五次劃線。注意不要將最后一次的劃線與第一次的劃線相連。7①接種環(huán)只蘸一次菌液，但要在培養(yǎng)基不同位置連續(xù)劃線多次。②劃線首尾不能相接。③每次劃線前后灼燒接種環(huán)進行滅菌。④劃線操作結束后，仍需灼燒接種環(huán)。12345⑤劃線后，培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)。第2步：接種和分離酵母菌2.方法步驟平板劃線法的注意事項探究

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實踐：酵母菌的純培養(yǎng)思考：完成圖示操作，接種環(huán)需灼燒滅菌幾次？6[思考](1)為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環(huán)，為什么？灼燒時期目的取菌種前每次劃線前接種結束后殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者殺死上次劃線時殘留菌種，使下一次劃線的菌種直接來源上次劃線的末端，從而使每次劃線時菌種數目逐漸減少，直至得到單個細胞。殺死接種環(huán)上原有微生物(2)在作第二次以及其后的劃線操作時，總是從上一次劃線的末端開始劃線的原因是？劃線后，線條末端酵母菌的數目比線條起始處要____，每次從上一次劃線的末端開始，能使酵母菌的數目隨著劃線次數的增加而逐步________，最終能得到由單個細胞繁殖而來的菌落。少減少(3)為什么最后一次劃線與第一次的劃線不能相連？最后一次劃線已經將酵母菌稀釋成單個的細胞，如果與第一次劃線相連則增加了細菌的數目，達不到純化的效果。(4)在觀察時發(fā)現(xiàn)第一區(qū)有菌落生長，而第二區(qū)域無菌落生長，可能是哪個操作失誤造成的？①接種環(huán)灼燒后未冷卻直接進行劃線；②劃線未從第一區(qū)域的劃線末端開始。完成平板劃線后，待菌液被培養(yǎng)基吸收，將接種后的平板和一個未接種的平板倒置，放入28℃左右（培養(yǎng)溫度因酵母菌種類的不同而稍有差異）的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~48h。在實驗室中，切不可吃東西、喝水，離開實驗室時一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培養(yǎng)基在丟棄前一定要進行滅菌處理，以免污染環(huán)境。警示未接種的平板作為對照組，若其上有菌落生長，則說明培養(yǎng)基被污染或者滅菌不徹底。第3步：培養(yǎng)酵母菌2.方法步驟探究

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實踐：酵母菌的純培養(yǎng)探究

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實踐：酵母菌的純培養(yǎng)①在接種酵母菌的培養(yǎng)基上可觀察到獨立的菌落，這些菌落在顏色、形狀和大小上相似，酵母菌菌落一般表面光滑，多呈乳白色。3.實驗結果分析②若在培養(yǎng)基中觀察到不同形態(tài)的菌落，原因可能是？菌液不純，混入其他雜菌；或在實驗操作過程中被雜菌污染。平板劃線時最后一次的劃線為何不能與第一次的劃線相連？___________________________________________________________________________________________________。最后一次劃線已經將細菌稀釋成單個的細菌，若與第一次的劃線相連，則增加了細菌數目，達不到純化的目的(1)為了防止污染，接種環(huán)經火焰滅菌后應趁熱快速挑取菌落。()×(2)為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實驗操作應在酒精燈火焰附近進行。()√新考案P3281.（2022·湖北卷）滅菌、消毒、無菌操作是生物學實驗中常見的操作。下列敘述正確的是()。DA.動、植物細胞DNA的提取必須在無菌條件下進行B.微生物、動物細胞培養(yǎng)基中需添加一定量的抗生素以防止污染C.為防止蛋白質變性，不能用濕熱滅菌法對牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進行滅菌D.可用濕熱滅菌法對實驗中所使用的微量離心管、細胞培養(yǎng)瓶等進行滅菌新考案P329培養(yǎng)基的配制與無菌技術考向12.(2023·山東卷)平板接種常用在微生物培養(yǎng)中。下列說法正確的是()。DA.不含氮源的平板不能用于微生物培養(yǎng)B.平板涂布時涂布器使用前必須進行消毒C.接種后未長出菌落的培養(yǎng)基可以直接丟棄D.利用以尿素為唯一氮源的平板能分離出合成脲酶的微生物新考案P329微生物的純培養(yǎng)考向2考點四

微生物的選擇培養(yǎng)與計數【復習目標】1.選擇培養(yǎng)基的配制。2.微生物的選擇培養(yǎng)。3.微生物的數量測定。4.土壤中分解尿素的細菌的分離與計數。復習指導閱讀選必3教材P16~19內容，解決以下問題：(5min)1.選擇培養(yǎng)基的定義？種類？2.微生物選擇培養(yǎng)的具體過程？3.稀釋涂布平板法計數的原理？要求？缺點？4.顯微鏡直接計數法的優(yōu)點和缺點。5.實驗：土壤中分解尿素的細菌的分離和計數。1.實驗室中微生物篩選原理:2.選擇培養(yǎng)基:在微生物學中，將允許_____________________，同時_____或_____其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。類型條件分離得到的菌種營養(yǎng)不加碳源不加氮源石油是唯一碳源添加某種化學物質加入青霉素高濃度食鹽改變培養(yǎng)條件零下低溫耐低溫的細菌酵母菌、霉菌等真菌金黃色葡萄球菌能分解石油的微生物自養(yǎng)型微生物固氮微生物人為提供有利于______________的條件（包括_____、_____和_____等），同時____________其他微生物的生長。特定種類的微生物生長抑制阻止目的菌生長營養(yǎng)溫度PH抑制或阻止一、選擇培養(yǎng)基牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g瓊脂20.0g蒸餾水定容到1000mL培養(yǎng)基一KH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g瓊脂15.0g蒸餾水定容到1000mL培養(yǎng)基二1.從物理性質來講，兩者屬于_____培養(yǎng)基，判斷依據是__________________；該類培養(yǎng)基的主要用途為___________________________。2.從用途上來講，____________屬于選擇培養(yǎng)基，目的是為了獲得_____________________。3.兩種培養(yǎng)基共有的培養(yǎng)基成分有：

。固體添加了凝固劑瓊脂分離、鑒定、計數、保存培養(yǎng)基二能分解尿素的微生物碳源、氮源、無機鹽、水[現(xiàn)學現(xiàn)用]由于土壤中細菌的數量龐大，要想得到能分解尿素的細菌的純培養(yǎng)物，必須要對土樣進行充分稀釋，然后再將菌液涂布到制備好的選擇培養(yǎng)基上，也就是要采用__________________。如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的細菌，僅有選擇培養(yǎng)基是不夠的，還需要對土樣進行適當處理及科學的測定微生物數量的方法。稀釋涂布平板法選擇培養(yǎng)基+稀釋涂布平板單菌落將菌液進行一系列梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到固體培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物被分散成單個細胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個菌落。稀釋涂布平板法：二、微生物的選擇培養(yǎng)——稀釋涂布平板法1×101mL1mL1mL1mL1mL1mL9mL無菌水90mL無菌水10g①鏟取土樣，將樣品裝入紙袋中。注意：取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的紙袋在使用前都要滅菌。取1mL上清液加入盛有9mL無菌水的試管中，依次等比稀釋。②將10g土樣加入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻，制成菌液。1.梯度稀釋菌液1×1021×1031×1041×1051×1061×107二、微生物的選擇培養(yǎng)——稀釋涂布平板法③取0.1mL菌液，滴加到培養(yǎng)基表面。⑥用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時可轉動培養(yǎng)皿，使涂布均勻。注意：多余的酒精在燒杯中滴盡，然后再放在火焰上灼燒。④將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。⑤將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進行涂布。2.涂布平板移液槍恒溫培養(yǎng)箱稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍空白對照3.菌落培養(yǎng)待涂布的菌液被培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置(同時放一個未接種的培養(yǎng)基)，放入30~37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1~2d。二、微生物的選擇培養(yǎng)——稀釋涂布平板法（1）利用尿素固體培養(yǎng)基可迅速殺死其他微生物，而保留利用尿素的微生物?！粒?）在尋找目的菌株時，要根據它對生存環(huán)境的要求，到相應環(huán)境中去尋找。√

圖A圖B(1)獲得圖A效果和圖B效果的接種方法分別是什么？稀釋涂布平板法平板劃線法(2)某同學在純化土壤中的細菌時，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基上的菌落連成了一片，最可能的原因是什么？應當怎樣操作才可避免此種現(xiàn)象？_________________________________________________________________________________________________________________________________。最可能的原因是菌液濃度過高或劃線時在劃下一區(qū)域前未將接種環(huán)灼燒滅菌；采取的措施是增大稀釋倍數或每次劃新區(qū)域前先將接種環(huán)灼燒滅菌新考案P329-330三、微生物的數量測定1.稀釋涂布平板計數法（活菌計數）原理當樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個單菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌，通過統(tǒng)計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。原則②同一稀釋度下，至少對3個平板進行重復計數，然后取其平均值。(重復實驗，減少誤差)。——間接計數法①一般選擇菌落數在30~300的平板進行計數。分析實驗結果時，要考慮重復組結果是否接近，如果相差太大，意味著操作有誤，需重新實驗。缺點統(tǒng)計的菌落數往往比活菌的實際數目少。

這是因為當兩個或多個細胞連在一起，平板上觀察到的只是一個菌落。因此，統(tǒng)計結果一般用菌落數而不用活菌數來表示。計算公式:每g樣品中的菌落數＝(C÷V)×MM代表稀釋倍數C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL)例：甲同學做此實驗在稀釋倍數105獲得3個平板，菌落數分別是80、90、100，涂布平板時均使用0.1mL菌液，試計算每克土壤中可以分離尿素的細菌數目？（80+90+100）/30.1×105=9×107個——間接計數法1.稀釋涂布平板計數法（活菌計數）三、微生物的數量測定方法平板劃線法稀釋涂布平板法純化原理接種工具單菌落的獲得用途接種效果圖相同點通過連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散將菌液進行一系列的等比稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到固體培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)，以得到單菌落。接種環(huán)涂布器從最后劃線區(qū)挑取稀釋度合適的整個平板上都可找到單菌落分離純化菌種，獲得單菌落①分離純化菌種，獲得單菌落②用于計數①都能分離純化菌種

②都在固體培養(yǎng)基上進行的平板劃線法vs稀釋涂布平板法三、微生物的數量測定2.顯微鏡直接計數（細菌總數計數）原理利用特定的細菌計數板或血細胞計數板，在顯微鏡下觀察、計數，然后再計算一定體積的樣品中微生物的數量，統(tǒng)計的結果一般是活菌數和死菌數的總和。優(yōu)點缺點——直接計數法細菌計數板：血細胞計數板：較薄，對細菌等較小的細胞進行觀察和計數。較厚，用于相對較大的酵母菌細胞、霉菌孢子等的計數?？焖?、直觀、設備簡單；能觀察微生物的形態(tài)特征。①不能區(qū)分死菌和活菌，統(tǒng)計結果會偏大；②不適于對運動細菌的計數。③個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察。血細胞/細菌計數板某同學擬從人體皮膚表面分離出葡萄球菌時，可用取樣后的棉拭子在固體培養(yǎng)基上涂布。()×（1）（2022·海南卷）采集園內土壤樣本探究校內植物園土壤中的細菌種類時，土壤溶液稀釋倍數越低，越容易得到單菌落。()×（2）稀釋涂布平板法和平板劃線法均能得到單菌落，都可用于細胞計數。()×新考案P330四、土壤中分解尿素的細菌的分離和計數1.提出問題①如何分離土壤中能分解尿素的細菌？②如何計算每克土壤樣品中有多少分解尿素的細菌？2.基礎知識①

CO(NH2)2+H2OCO2+2NH3NO3-NH4+分解尿素的細菌分泌脲酶轉化被植物吸收[資料卡]常見的分解尿素的微生物：芽孢桿菌、小球菌、棒狀桿菌等細菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。四、土壤中分解尿素的細菌的分離和計數1.提出問題①如何分離土壤中能分解尿素的細菌？②如何計算每克土壤樣品中有多少分解尿素的細菌？2.基礎知識組分含量KH2PO41.4Na2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g瓊脂15.0gH2O定容至1000mL②配制培養(yǎng)基[思考2]為什么還要制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基？作為對照，判斷選擇培養(yǎng)基是否具有選擇作用。完全培養(yǎng)基（如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）選擇培養(yǎng)基（以尿素為唯一氮源）[思考1]KH2PO4和Na2HPO4的作用是什么？①提供無機鹽；②調節(jié)pH土壤取樣樣品稀釋涂布平板微生物的觀察培養(yǎng)四、土壤中分解尿素的細菌的分離和計數3.實驗設計取樣地點要求：取樣部位：注意事項：鐵鏟和取樣紙袋在使用前都需要滅菌；操作完成后，一定要洗手。距地表約3~8cm土壤層。酸堿度接近中性的潮濕土壤。土壤取樣樣品稀釋涂布平板微生物的觀察培養(yǎng)四、土壤中分解尿素的細菌的分離和計數3.實驗設計不同微生物在土壤中含量不同，分離不同的微生物采用不同的稀釋度，以保證獲得菌落數在30～300、適于計數的平板。測細菌數：一般用104、105、106稀釋液測放線菌：一般用103、104、105稀釋液測真菌數：一般用102、103、104稀釋液[思考]在初次實驗中，對于稀釋的范圍沒有把握，怎樣做才能保證從中選擇出菌落數在30～300的平板進行計數？選擇一個比較寬的范圍，如將1×103～1×107倍稀釋的稀釋液分別涂布到平板上培養(yǎng)。土壤取樣樣品稀釋涂布平板微生物的觀察培養(yǎng)四、土壤中分解尿素的細菌的分離和計數3.實驗設計選擇培養(yǎng)基(重復實驗)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(作為對照)用以判斷選擇培養(yǎng)基是否具有選擇作用。還要有兩個空白對照，即未接種的選擇培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，以驗證培養(yǎng)基中是否含有雜菌。使用的平板和試管較多，為避免混淆，最好在使用前做好標記。如注明組別、樣品稀釋度、培養(yǎng)日期等。四、土壤中分解尿素的細菌的分離和計數土壤取樣樣品稀釋涂布平板微生物的觀察培養(yǎng)3.實驗設計培養(yǎng)條件：不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。細菌一般在30-37℃的溫度下培養(yǎng)1-2d。結果：一般來說，在相同的培養(yǎng)條件下，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征，如形狀、大小和顏色等。觀察：每隔24h統(tǒng)計一次菌落數目，選取菌落數目穩(wěn)定時的記錄作為結果。有些微生物能利用其他微生物的代謝產物生長繁殖，得到的菌落不一定是目的菌，還需要進一步的鑒定。[思考]得到的菌落一定是分解尿素的細菌嗎？防止因培養(yǎng)時間不足而導致遺漏菌落的數目。CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3

脲酶原理：脲酶催化尿素分解成氨→培養(yǎng)基堿性增強→遇酚紅指示劑變紅①液體培養(yǎng)基可以直接看液體的變色情況；②固體培養(yǎng)基上可以觀察菌落周圍是否出現(xiàn)紅色環(huán)帶，紅色環(huán)帶直徑與菌落直徑比值越大，說明分解能力越強。土壤中分解尿素的細菌的鑒定4.鑒別培養(yǎng)基四、土壤中分解尿素的細菌的分離和計數比較某一種菌的分解能力時，直接看透明圈大??；而比較多種菌的分解能力時，需要比較透明圈直徑與菌落直徑的比值。幾種纖維素分解菌在剛果紅培養(yǎng)基上形成的透明圈(1)你打算到什么環(huán)境中去尋找纖維素分解菌？為什么？原理：纖維素與剛果紅染料反應生成紅色復合物，而當纖維素被纖維素分解菌分解后，復合物就無法形成，培養(yǎng)基中會出現(xiàn)以這些菌為中心的透明圈。透明圈直徑與菌落直徑比值越大，說明分解能力越強。[P20拓展應用1]分離并鑒定“纖維素分解菌”纖維素剛果紅紅色復合物纖維素酶紅色消失現(xiàn)透明圈纖維素分解菌透明圈直徑與菌落直徑比值越大，說明分解能力越強。(2)現(xiàn)在要從土壤中分離并鑒定纖堆素分解菌，請你給出詳細的實驗方案。纖維素豐富的環(huán)境，如樹林中多年落葉形成的腐殖土等。用“纖維素為唯一碳源”的選擇培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基加入剛果紅進行鑒別。伊紅—亞甲藍培養(yǎng)基鑒別大腸桿菌1.（2023·廣東卷）研究者擬從堆肥中取樣并篩選能高效降解羽毛、蹄角等廢棄物中角蛋白的嗜熱菌。根據堆肥溫度變化曲線（如圖）和選擇培養(yǎng)基篩選原理來判斷，下列最可能篩選到目標菌的條件組合是()。DA.a點時取樣、尿素氮源培養(yǎng)基B.b點時取樣、角蛋白氮源培養(yǎng)基C.b點時取樣、蛋白胨氮源培養(yǎng)基D.c點時取樣、角蛋白氮源培養(yǎng)基新考案P331微生物的選擇培養(yǎng)（高頻）考向12.（2023·北京卷）自然界中不同微生物之間存在著復雜的相互作用。有些細菌具有溶菌特性，能夠破壞其他細菌的結構使細胞內容物釋出。科學家試圖從某湖泊水樣中分離出有溶菌特性的細菌。（1）用于分離細菌的固體培養(yǎng)基包含水、葡萄糖、蛋白胨和瓊脂等成分，其中蛋白胨主要為細菌提供______和維生素等。氮源（2）A菌通常被用作溶菌對象。研究者將含有一定濃度A菌的少量培養(yǎng)基傾倒在固體培養(yǎng)平板上，凝固形成薄層。培養(yǎng)一段時間后，薄層變渾濁（如圖），表明__________________________。A菌能在培養(yǎng)基中生長繁殖（3）為分離出具有溶菌作用的細菌，需要合適的菌落密度，因此應將含菌量較高的湖泊水樣______后，依次分別涂布于不同的渾濁薄層上。培養(yǎng)一段時間后，能溶解A菌的菌落周圍會出現(xiàn)________。采用這種方法，研究者分離、培養(yǎng)并鑒定出P

菌。稀釋溶菌圈（4）為探究P菌溶解破壞A菌的方式，請?zhí)岢鲆粋€假設，該假設能用以下材料和設備加以驗證（主要實驗材料和設備：P菌、A菌、培養(yǎng)基、圓形濾紙小片、離心機和細菌培養(yǎng)箱）。__________________________________________________________。假設P菌通過分泌某種化學物質使A菌溶解破裂3.下圖為“土壤中分解尿素的細菌的分離與計數”實驗中樣品稀釋示意圖。據圖分析正確的是()。BA.3號試管中的菌落稀釋倍數為103B.采集的土樣不需要經過高溫滅菌處理C.5號試管的結果表明每克土壤中的菌株數為1.7×107

個D.該實驗方法統(tǒng)計得到的結果往往會比實際活菌數目要高新考案P332微生物的數量測定考向24.(2022·全國甲卷)某同學從被石油污染的土壤中分離得到A和B兩株可以降解石油的細菌，在此基礎上采用平板培養(yǎng)法比較二者降解石油的能力，并分析兩個菌株的其他生理功能。實驗所用的培養(yǎng)基成分如下。培養(yǎng)基Ⅰ：K2HPO4，MgSO4，NH4NO3

，石油。培養(yǎng)基Ⅱ：K2HPO4，MgSO4，石油。操作步驟：①將A、B菌株分別接種在兩瓶液體培養(yǎng)基Ⅰ中培養(yǎng)，得到A、B菌液。②液體培養(yǎng)基Ⅰ、Ⅱ中添