3.2基因工程的基本操作程序（第二課時）高二下學期生物人教版（2019）選擇性必修3

第3章3.1重組DNA技術的基本工具本節(jié)聚焦1、基因工程的基本操作程序主要包括哪幾個步驟？2、基因工程操作的每一步涉及的技術和方法有哪些？【三點提醒】①在PCR過程中實際加入的為dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。②引物既可以是DNA單鏈，也可以為RNA單鏈。細胞內的DNA進行復制時，也需要引物，一般為RNA片段；PCR引物一般為DNA片段。③真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應緩沖溶液中一般要添加Mg2＋。探究?實踐：DNA片段的擴增及電泳鑒定思考：能不能直接將目的基因導入受體細胞，為什么？如果不能，如何避免該結果的發(fā)生呢？游離的DNA片段進入受體細胞，一般會直接被分解，且游離的DNA片段不能穩(wěn)定遺傳。構建基因表達載體（核心工作）1.構建基因表達載體的目的：2.基因表達載體的組成思考：要各個元件有什么作用？（1）使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代；（2）使目的基因能夠在受體細胞中表達和發(fā)揮作用。二、基因表達載體的構建——核心步驟02目的基因：主要指編碼蛋白質的基因復制原點：DNA復制的起始位點終止子：本質：一段有特殊序列結構的DNA片段位置：基因的下游功能：終止轉錄四環(huán)素抗性基因、熒光蛋白基因等二、基因表達載體的構建——核心步驟啟動子：本質：一段有特殊序列結構的DNA片段位置：基因的上游功能：RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA標記基因：作用為鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來（1）二者都有標記基因和復制原點兩部分DNA片段。（2）表達載體在載體基礎上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結構。?注意：載體≠表達載體：目的基因應插入啟動子和終止子之間的部位，并且不能破壞啟動子、終止子、復制原點、標記基因?啟動子與起始密碼子相同嗎？終止子與終止密碼子相同嗎？不同啟動(終止)轉錄啟動(終止)翻譯作用位于DNA上位于mRNA上位置DNA片段三個相鄰堿基本質啟動(終止)子啟始(終止)密碼子DNA片段基因1基因2基因3放大終止子非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子補充：基因的結構轉錄RNA聚合酶識別和結合位點結束轉錄mRNA翻譯蛋白質原核細胞的基因結構(補充內容）非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結合位點啟動子終止子①不編碼蛋白質。：編碼蛋白質,連續(xù)不間斷編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細胞的基因結構②調控遺傳信息表達,上游有啟動子，下游有終止子真核細胞的基因結構（補充內容）編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結合位點內含子外顯子啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游真核細胞的基因結構編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質的序列內含子：不能編碼蛋白質的序列：有調控作用,上游有啟動子，下游有終止子非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內含子1個或2個兩個黏性末端（平末端）質粒（載體）DNA分子（含目的基因）獲得目的基因，帶有兩個切口兩個黏性末端（平末端）DNA連接酶重組DNA分子（重組質粒）同種限制酶（或產(chǎn)生相同末端的限制酶）二、基因表達載體的構建——核心步驟3.構建過程：如果使用一種限制酶進行切割目的基因和質粒，共有幾種情況？載體與目的基因反向連接載體與目的基因正向連接目的基因與目的基因之間的連接目的基因自身環(huán)化載體自身環(huán)化載體與載體之間的連接思考討論1.只用一種限制酶切割的時候會出現(xiàn)什么現(xiàn)象？（1）自身環(huán)化：（2）反向連接：2.如何防止目的基因和載體的自身環(huán)化以及目的基因的反向連接？質粒重新環(huán)化目的基因自身環(huán)化質粒與目的基因反向連接雙酶切思考討論3.雙酶切時是否能用EcoRⅠ和BamHⅠ？為什么？四環(huán)素抗性基因EcoRⅠHindⅢBamHⅠ不能因為BamHⅠ會破壞質粒的抗性基因，無法進行重組DNA篩選。同時BamHⅠ切割位點在目的基因上，也會破壞目的基因。EcoRⅠHindⅢBamHⅠ【核心歸納】圖解限制酶的選擇原則（1）不破壞目的基因原則；（2）保留標記基因、啟動子、終止子、復制原點原則；（3）確保出現(xiàn)相同黏性末端原則。將目的基因與載體結合，構建好基因表達載體后，下面該進行什么操作？基因工程第三步：將目的基因導入受體細胞思考常用方法將目的基因導入植物細胞將目的基因導入動物細胞將目的基因導入微生物細胞農桿菌轉化法花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+處理法我國科學家獨創(chuàng)三、將目的基因導入受體細胞②在植物授粉后一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通過花粉管通道進入胚囊。①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；花粉管通道法導入外源DNA適用生物：開花植物（1）花粉管通道法（我國獨創(chuàng)）三、將目的基因導入受體細胞1.目的基因導入植物細胞★轉化：指目的基因進入受體細胞內，并在受體細胞內穩(wěn)定維持和表達的過程。此處“轉化”與肺炎鏈球菌轉化實驗中的“轉化”含義相同，實質都是基因重組。（2）農桿菌轉化法三、將目的基因導入受體細胞1.目的基因導入植物細胞（2）農桿菌轉化法①農桿菌能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數(shù)單子葉植物沒有侵染能力。（可轉移的DNA）②農桿菌細胞內含有Ti質粒，當它侵染植物細胞后，能將Ti質粒上的T-DNA轉移到被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的染色體DNA上。三、將目的基因導入受體細胞1.目的基因導入植物細胞原理：方法：①將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與農桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉化細胞，并再生成植株；②可以將花序直接浸沒在含有農桿菌的溶液一段時間，然后培植植株并獲得種子，再進行篩選、鑒定等，22目的基因Ti質粒表達載體農桿菌植物細胞植物細胞染色體DNA新性狀植株構建轉入導入插入表達三、將目的基因導入受體細胞1.目的基因導入植物細胞過程：（2）農桿菌轉化法1.農桿菌轉化法中，目的基因是否就是T-DNA，如果不是，T-DNA與目的基因是什么關系？T-DNA不是目的基因，但它將來會被整合到宿主細胞染色體的DNA上，只要將目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以隨T-DNA進入宿主細胞并整合到宿主細胞的染色體上。2.農桿菌轉化法中，目的基因只能進入植物的一個體細胞中，但基因工程最終要的是一個轉基因植株，如何實現(xiàn)這一目標？

得到含有目的基因的植物細胞后進行植物組織培養(yǎng)三、將目的基因導入受體細胞該過程經(jīng)過____次拼接、____次導入①第一次拼接：_______________________________②第二次拼接：______________________________________________________________③第一次導入：__________________________________④第二次導入：__________________________________將目的基因拼接到Ti質粒的T-DNA上

農桿菌將插入目的基因的T-DNA拼接到受體細胞染色體的DNA上（非人工操作）兩兩將含目的基因的Ti質粒重新導入農桿菌農桿菌含目的基因的T-DNA導入受體細胞（非人工操作）拓展—拼接&導入03（1）常用方法：（2）受體細胞:顯微注射法受精卵①體積大，易操作。②易表現(xiàn)出全能性。（3)過程：構建基因表達載體并提純利用顯微注射將基因表達載體注入動物的受精卵中早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植獲得具有新性狀的動物三、將目的基因導入受體細胞2.目的基因導入動物細胞原核細胞（常選擇大腸桿菌）（1）受體細胞：優(yōu)點：繁殖快，多為單細胞，遺傳物質相對較少，易于培養(yǎng)。（2）常用方法：Ca2+處理增加細胞壁的通透性，可使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)（感受態(tài)細胞）。Ca2+感受態(tài)細胞吸收三、將目的基因導入受體細胞3.目的基因導入微生物細胞小結：將目的基因導入受體細胞的方法種類項目植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法

受體細胞

轉化過程目的基因插入Ti質粒的T-DNA上→導入植物細胞→整合到受體細胞的染色體DNA中→表達目的基因表達載體提純→取卵（受精卵）→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物Ca2＋處理細胞→能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)細胞→重組的基因表達載體導入細胞中農桿菌轉化法顯微注射法Ca2＋處理法體細胞或受精卵受精卵原核細胞當堂鞏固1.研究人員將一種海魚的抗凍蛋白基因加整合到土壤農桿菌的Ti質粒上，然后用它侵染番茄細胞，獲得了抗凍的番茄品種。判斷下列相關表述是否正確。（1）將加基因整合到Ti質粒上就是構建基因表達載體。（）（2）構建含有加基因的Ti質粒需要限制酶、DNA連接酶和核酸酶。（）（3）只要檢測出番茄細胞中含有物基因，就代表抗凍番茄培育成功。（）××√將基因表達載體導入受體細胞后，如何判斷導入是否成功？即使導入成功，如何判斷目的基因是否可以正常表達？思考不一定！檢查目的基因進入受體細胞后，是否穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性。

在抗蟲棉的培育過程中，目的基因進入受體細胞后，是否穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性，只有通過檢測與鑒定才能知道Bt基因mRNABt抗蟲蛋白抗蟲棉PCR等技術檢測抗原—抗體雜交技術分子水平抗蟲鑒定（個體水平）四、目的基因的檢測與鑒定概念（1）借助載體上的標記基因可以檢測目的基因是否在受體細胞中穩(wěn)定地存在并遺傳（2）基因探針：一段帶放射性標記的、與目的基因互補的特異核苷酸序列。可以是DNA，也可以是由之轉錄而來的RNA。（3）核酸雜交：可以用于檢測目的基因：將待測DNA與目的基因探針混合，如果發(fā)生了核酸雜交，則說明有目的基因?；パa的兩條核酸單鏈通過復性形成雙鏈的過程。檢測內容及方法:（一）分子水平的檢測檢測棉花的染色體DNA上是否插入了Bt基因或檢測Bt基因①檢測目的基因是否導入——通過PCR等技術檢測提取棉花細胞DNA用與Bt基因相關的引物進行PCR擴增對擴增產(chǎn)物進行檢測四、目的基因的檢測與鑒定基本思路：①制作基因探針，并用PCR擴增；②提取受體細胞全部DNA并用PCR擴增，與基因探針置于同一培養(yǎng)液；③高溫變性處理，使之全部變?yōu)閱捂?，觀察是否出現(xiàn)雜交DNA片段。探針與受體中的DNA分子雜交出現(xiàn)雜交帶：不出現(xiàn)雜交帶：已插入未插入提取棉花細胞DNA用與Bt基因相關的引物進行PCR擴增對擴增產(chǎn)物進行檢測方法2：檢測目的基因是否導入——DNA分子交雜技術變性1、提取目的基因的DNA片段用放射性同位素標記，作為基因探針；2、使探針與轉基因生物基因組雜交，若出現(xiàn)雜交帶，則導入成功。原理：堿基互補配對原則檢測Bt基因是否翻譯出mRNA提取棉花細胞mRNA逆轉錄產(chǎn)生DNA對擴增產(chǎn)物進行檢測用與Bt基因相關的引物進行PCR擴增②檢測目的基因是否轉錄——通過PCR等技術檢測（一）分子水平的檢測如：檢測Bt基因是否翻譯成Bt抗蟲蛋白從棉花中提取蛋白質用相應抗體進行抗原-抗體雜交檢測③檢測目的基因是否翻譯——通過抗原-抗體雜交檢測四、目的基因的檢測與鑒定方法2：檢測目的基因是否轉錄——分子雜交技術1、制作基因探針；2、探針和轉基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明轉錄出了mRNA。變性探針15N15N轉基因生物的mRNA雜交分子（可檢測）原理：堿基互補配對原則③檢測目的基因是否翻譯——通過抗原-抗體雜交檢測從轉基因生物提取出來的蛋白質和相應的抗體進行雜交，如果出現(xiàn)雜交帶，說明目的基因已經(jīng)翻譯。蘇云金芽孢桿菌提取Bt毒蛋白注射小鼠體內抗體標記抗體提取蛋白抗原抗體雜交脫分化檢測目的基因是否表現(xiàn)出相應的性狀檢測抗蟲棉是否具有抗蟲性狀采摘抗蟲棉葉片飼喂棉鈴蟲觀察棉鈴蟲存活情況（二）個體水平的檢測四、目的基因的檢測與鑒定轉基因生物鑒定方法成功標志抗蟲植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產(chǎn)物的轉基因生物飼喂害蟲（抗蟲接種實驗）害蟲死亡病毒（菌）接種實驗未染病鹽水澆灌正常生長噴灑除草劑正常生長提取細胞產(chǎn)物與天然產(chǎn)品進行功能活性比較功能、活性正?？瓜x鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等個體水平檢測：抗性以及抗性程度一、概念檢測練習與應用1.研究人員將一種海魚的抗凍蛋白基因afp加整合到土壤農桿菌的Ti質粒