微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用（第二課時）課件-高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第1章發(fā)酵工程第2節(jié)微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用第2課時微生物的選擇培養(yǎng)和計數(shù)

美國黃石國家公園的熱泉尋找耐高溫的DNA聚合酶PCR是一種在體外DNA復(fù)制的技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。水生棲熱菌能在70-80℃高溫條件下生存，而絕大多數(shù)微生物在此條件下不能生存。耐高溫的酶耐高溫生物體高溫環(huán)境（熱泉、火山口）尋找尋找1.篩選原因：2.篩選思路：·科學(xué)實(shí)例：3.啟示：1.在被石油污染的土壤中可以篩選

微生物2.在冰川凍土層可以篩選

微生物3.以纖維素為唯一碳源培養(yǎng)——分離_________________尋找目的菌種時要根據(jù)它對

的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。生存環(huán)境分解石油耐寒纖維素分解菌冰川凍土層被石油污染的土壤4.原理：實(shí)驗(yàn)室篩選微生物原理：人為提供_____________________的條件（包括________、________和________等），同時__________________________有利于目的菌生長營養(yǎng)溫度PH抑制或阻止其他微生物的生長那么，如何從眾多的微生物中篩選出單一菌種？自然界中微生物數(shù)量繁多，種類龐雜，要想從中分離出需要的特定微生物并不容易，尤其當(dāng)要分離的微生物在混合菌群中不是優(yōu)勢種群時，僅通過一般的平板劃線法或稀釋涂布平板法很難實(shí)現(xiàn)。稀釋涂布平板法呈現(xiàn)的雜菌群選擇培養(yǎng)基應(yīng)運(yùn)而生。

人為提供有利于目的菌生長的條件（包括營養(yǎng)、溫度和PH等），同時抑制或阻止其他微生物的生長。

在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基稱為選擇培養(yǎng)基一、選擇培養(yǎng)基1.概念：2.原理：培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分是否完全分類：（1）基本培養(yǎng)基：只能保證某些微生物的野生型菌株正常生長，是

含有營養(yǎng)要求最低成分的合成培養(yǎng)基。（2）完全培養(yǎng)基：在基本培養(yǎng)基中加入一些富含氨基酸、維生素和堿基等天然物質(zhì)，可用來滿足絕大多數(shù)微生物的生長需要的培養(yǎng)基。（3）補(bǔ)充培養(yǎng)基：在基本培養(yǎng)基中有針對性加進(jìn)某一種或某幾種營養(yǎng)成分，以滿足相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型菌株生長的需要的培養(yǎng)基。一、選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基：怎樣選擇出抗氨芐青霉素能力的細(xì)菌？培養(yǎng)基中加氨芐青霉素沒有氨芐青霉素抗性的細(xì)菌具有抗氨芐青霉素能力的細(xì)菌沒有抗氨芐青霉素能力的菌落被淘汰一、選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基：怎么證明選擇出抗氨芐青霉素能力的細(xì)菌?若基礎(chǔ)培養(yǎng)基或完全培養(yǎng)基中生長的菌落數(shù)

該選擇培養(yǎng)基，則該選擇培養(yǎng)基具有選擇性。多于應(yīng)該設(shè)置基礎(chǔ)培養(yǎng)基（如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）或完全培養(yǎng)基

作為對照類型條件選擇分離得到的菌種改變培養(yǎng)條件70～80℃的高溫?zé)o氧環(huán)境下培養(yǎng)添加某種化學(xué)物質(zhì)加入青霉素高濃度食鹽特殊碳、氮源石油是唯一碳源營養(yǎng)缺陷不加碳源不加氮源水生棲熱菌酵母菌、霉菌等真菌金黃色葡萄球菌能消除石油污染的微生物自養(yǎng)型微生物固氮菌（青霉素能殺死細(xì)菌、放線菌,對真菌不起作用）厭氧型微生物，兼性厭氧型3.選擇培養(yǎng)基四種常見制備方法或?qū)嵗?、選擇培養(yǎng)基一、選擇培養(yǎng)基思考·討論：選擇培養(yǎng)基配方的設(shè)計尿素[CO(NH2)2]含氮量高，化學(xué)性質(zhì)相對穩(wěn)定，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一種重要的氮肥。尿素施入土壤后，會被土壤中的某些細(xì)菌分解成NH3，NH3再轉(zhuǎn)化成NO3-、NH4+等被植物吸收。而這些細(xì)菌之所以能分解尿素，是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕?，脲酶催化尿素分解產(chǎn)生NH3，NH3可作為細(xì)菌生長的氮源。CO(NH2)2+H2OCO2+2NH3NO3-NH4+脲酶轉(zhuǎn)化被植物吸收尿素分子模型一、選擇培養(yǎng)基思考·討論：選擇培養(yǎng)基配方的設(shè)計除以尿素作唯一氮源外，其他營養(yǎng)成分與普通培養(yǎng)基基本相同。1.如果讓你配制一種培養(yǎng)基，將土壤稀釋液中能分解尿素的細(xì)菌分離出來，培養(yǎng)基的配方該如何設(shè)計？2.該培養(yǎng)基與普通培養(yǎng)基有哪些共同點(diǎn)和不同點(diǎn)？培養(yǎng)基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，才能生長發(fā)育繁殖。P18探究實(shí)踐：能分解尿素的細(xì)菌都是異養(yǎng)型微生物，不能利用CO2來合成有機(jī)物，可用葡萄糖等有機(jī)物作為碳源。一、選擇培養(yǎng)基現(xiàn)學(xué)現(xiàn)用牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g瓊脂20.0g蒸餾水定容到1000mL培養(yǎng)基一KH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g瓊脂15.0g蒸餾水定容到1000mL培養(yǎng)基二1.從物理性質(zhì)來講，兩者屬于_____培養(yǎng)基，判斷依據(jù)是__________________；該類培養(yǎng)基的主要用途為___________________________。2.從用途上來講，____________屬于選擇培養(yǎng)基，目的是為了獲得_____________________。3.兩種培養(yǎng)基共有的培養(yǎng)基成分有：

。培養(yǎng)基一的主要碳源為

，主要氮源為

；培養(yǎng)基二的碳源為

，氮源為

。固體添加了凝固劑瓊脂分離、鑒定、計數(shù)、保存培養(yǎng)基二能分解尿素的微生物碳源、氮源、無機(jī)鹽、水牛肉膏、蛋白胨牛肉膏、蛋白胨葡萄糖尿素編號①②③④⑤成分(NH4)2SO4KH2PO4FeSO4CaCl2H2O含量0.4g4.0g0.5g0.5g100mL例：據(jù)某微生物培養(yǎng)基的配方表回答下列問題1.此培養(yǎng)基按物理性質(zhì)劃分屬于______培養(yǎng)基，理由是______________________

按功能劃分屬于_______培養(yǎng)基，因?yàn)闆]有碳源，只有__________微生物才能生長(利用空氣中的CO2)。2.此培養(yǎng)基含有的微生物的營養(yǎng)成分包括____________________三類，若加入氨基酸，則它可充當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)成分包括_________________________。3.若要觀察微生物的菌落特征，培養(yǎng)基中應(yīng)添加的成分是_________________。4.若用該培養(yǎng)基來分離尿素分解菌，應(yīng)除去表中

成分(填表中序號)，應(yīng)加入_________和_______________的有機(jī)物。液體選擇自養(yǎng)型水、無機(jī)鹽、氮源碳源、氮源、生長因子凝固劑(瓊脂)①尿素不含氮元素沒有凝固劑(瓊脂)一、選擇培養(yǎng)基現(xiàn)學(xué)現(xiàn)用二、微生物的選擇培養(yǎng)僅通過選擇培養(yǎng)基可以知道1g土壤中有多少能分解尿素的細(xì)菌嗎？分離：獲得分解尿素的細(xì)菌的純培養(yǎng)物計數(shù)：測定分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量能利用平板劃線法，進(jìn)行微生物的培養(yǎng)計數(shù)嗎？不能。平板劃線法最開始的劃線區(qū)域，細(xì)菌可能會長成一片，導(dǎo)致無法計數(shù)，此外灼燒接種環(huán)的時候也會殺死一部分細(xì)菌。方法:稀釋涂布平板法如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的細(xì)菌，需要解決哪2個問題？選擇培養(yǎng)：獲得能分解尿素的細(xì)菌的純培養(yǎng)物計數(shù)：土壤菌液進(jìn)行充分稀釋及科學(xué)的微生物數(shù)量測定方法—稀釋涂布平板法?！♂屚坎计桨宸ㄌ荻认♂尅坎计桨逡阅蛩刈鳛槲ㄒ坏吹倪x擇培養(yǎng)基培養(yǎng)基類型：方法：問：由于土壤細(xì)菌的數(shù)量龐大，那么怎么獲得要想得到特定微生物的純培養(yǎng)物呢？答：要對土壤進(jìn)行充分稀釋，然后再將菌液涂布到制備好的選擇培養(yǎng)基上。二、微生物的選擇培養(yǎng)：___________和___________是將菌液進(jìn)行一系列梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)的方法。稀釋度足夠高時，能在培養(yǎng)基表面形成單個菌落。梯度稀釋涂布平板【稀釋度足夠高時，能在培養(yǎng)基表面形成單個菌落】聚集的微生物單個細(xì)胞菌液梯度稀釋單個菌落涂布平板生長繁殖二、微生物的選擇培養(yǎng)1.概念：2.兩個基本操作：3.操作過程：①土壤取樣細(xì)菌宜在酸堿度接近中性的潮濕土壤中生長，絕大部分分布在距地表3~8cm的土壤層。鏟去表層土3cm左右，取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。注意：取土樣時用的鐵鏟和取樣袋在使用前都需要

。操作完成后，一定要

。滅菌洗手3.操作過程：二、微生物的選擇培養(yǎng)②樣品梯度稀釋將10g土樣加入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻。取1mL上清液加入盛有9mL無菌水的試管中，依次等比稀釋。10g1×1090mL無菌水1mL1mL1mL1mL1mL1mL1×1021×1031×1041×1051×1061×1076只試管分別加入9mL無菌水二、微生物的選擇培養(yǎng)③涂布平板a.取0.1mL菌液，滴加到培養(yǎng)基表面。微量移液器b.將涂布器浸在盛有酒精（體積分?jǐn)?shù)70％）的燒杯中。c.將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進(jìn)行涂布。d.用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時可轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使涂布均勻。待涂布的菌液被培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置，放入恒溫箱培養(yǎng)。二、微生物的選擇培養(yǎng)待涂布的菌液被培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置，放入30-37℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)1-2d。問題:當(dāng)目的菌數(shù)量太少時，怎么辦？需要利用選擇培養(yǎng)基對其進(jìn)行富集培養(yǎng)（擴(kuò)大培養(yǎng)），以確?？梢缘牡玫剿枘康木?。④培養(yǎng)與觀察恒溫培養(yǎng)箱二、微生物的選擇培養(yǎng)二、微生物的選擇培養(yǎng)待涂布的菌液被培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置，放入30-37℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)1-2d。問題2：培養(yǎng)時要將一個未接種的培養(yǎng)基和三個已接種的培養(yǎng)基放在一起培養(yǎng)為什么？培養(yǎng)未接種的培養(yǎng)基的作用是對照恒溫培養(yǎng)箱未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫一段時間后，如果無菌落生長，說明培養(yǎng)基制備成功、合格，未受到污染。④培養(yǎng)與觀察二、微生物的選擇培養(yǎng)將涂布器從酒精中取出時，要讓多余的酒精在燒杯中滴盡，然后再放在火焰上灼燒；不要將過熱的涂布器放在盛有酒精的燒杯中，以免引燃酒精。過程中所有操作都應(yīng)在酒精燈火焰旁進(jìn)行10g土樣加入盛有90mL無菌水中后，已稀釋10倍，在計算時，不要忽略；由于使用的是選擇培養(yǎng)基，所以一般情況下，獲得的單菌落即目的菌，但因?yàn)橛行┪⑸锟梢岳媚康木拇x產(chǎn)物來生長繁殖，所以還需要進(jìn)一步驗(yàn)證注意事項(xiàng)：二、微生物的選擇培養(yǎng)主要方法稀釋涂布平板法平板劃線法主要步驟接種工具菌體獲取用途共同點(diǎn)稀釋涂布平板法和平板劃線法的比較系列梯度稀釋操作和涂布平板操作接種環(huán)在固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線涂布器接種環(huán)稀釋度合適的整個平板上都可找到單菌落從最后劃線區(qū)挑取①分離純化菌種，獲得單菌落②用于計數(shù)分離純化菌種，獲得單菌落①都能分離純化菌種；②都在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行二、微生物的選擇培養(yǎng)稀釋102倍稀釋103倍稀釋105倍既然稀釋涂布平板法可以計算活菌數(shù)目，那么是怎么通過稀釋涂布平板法統(tǒng)計活菌的數(shù)目呢？還有哪些統(tǒng)計活菌的方法呢？三、微生物的數(shù)量測定原理：1.稀釋涂布平板法(間接計數(shù)法)當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個單菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。計數(shù)原則：①一般選擇菌落數(shù)為30~300的平板進(jìn)行計數(shù)。②在同一稀釋度下，應(yīng)至少對3個平板進(jìn)行重復(fù)計數(shù)，然后求出平均值。③分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時，要考慮重復(fù)組結(jié)果是否接近，如果相差太大，意味著操作有誤，需重新實(shí)驗(yàn)。三、微生物的數(shù)量測定1.稀釋涂布平板法(間接計數(shù)法)①若平板上菌落數(shù)過多,出現(xiàn)更多的兩個或兩個以上的菌體形成的菌落,結(jié)果不準(zhǔn)確,且計數(shù)較困難。②若平板上菌落數(shù)過少,菌落形成的偶然性大,結(jié)果也不準(zhǔn)確。減少偶然因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的說服力。問題1：稀釋涂布平板法，為什么至少涂布三個平板？問題2：稀釋涂布平板法，為什么選擇菌落數(shù)為30-300的平板進(jìn)行計數(shù)？三、微生物的數(shù)量測定計算公式：1.間接計數(shù)法M：代表稀釋倍數(shù)；C：代表同一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)；V：代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL)每g樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M例：甲同學(xué)做此實(shí)驗(yàn)在稀釋倍數(shù)105獲得3個平板，菌落數(shù)分別是80、90、100，涂布平板時均使用0.1mL菌液，試計算每克土壤中可以分離尿素的細(xì)菌數(shù)目？（80+90+100）/30.1×105=9×107個三、微生物的數(shù)量測定計算公式：1.間接計數(shù)法結(jié)果分析：原因：當(dāng)兩個或多個細(xì)胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目

。

因此，統(tǒng)計結(jié)果一般用

而不用活菌數(shù)來表示。菌落數(shù)恰當(dāng)?shù)南♂尪取⑼坎际欠窬鶆蚴浅晒y(tǒng)計菌落數(shù)目的關(guān)鍵。M：代表稀釋倍數(shù)；C：代表同一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)；V：代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL)每g樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M低如圖為“土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計數(shù)”實(shí)驗(yàn)中樣品稀釋示意圖。請據(jù)圖分析，下列說法錯誤的是(

)AA.③號試管的稀釋倍數(shù)為103B.④號試管中稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)得到的菌落平均數(shù)可能為⑤號試管的10倍C.⑤號試管的結(jié)果表明每克土壤中的菌株數(shù)為1.7×109D.將涂布器在酒精燈火焰上灼燒冷卻后，再進(jìn)行涂布三、微生物的數(shù)量測定三、微生物的數(shù)量測定兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)。在對應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果。思考：你認(rèn)為這兩位同學(xué)的實(shí)驗(yàn)需要改進(jìn)嗎?如果需要，如何改進(jìn)?第一位同學(xué)在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)為230。第二位同學(xué)在該濃度下涂布了三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別為21、212和256，該同學(xué)以這三個平板上菌落數(shù)的平均值163作為統(tǒng)計結(jié)果。甲：沒有重復(fù)實(shí)驗(yàn)（至少涂布3個平板）乙：其中一個平板計數(shù)結(jié)果與其他兩個相差太大，操作過程可能出現(xiàn)了錯誤。某同學(xué)在稀釋倍數(shù)為106

的培養(yǎng)基中測得平板上菌落數(shù)的平均數(shù)為234，那么每g樣品中的菌落數(shù)是（涂布平板時所用稀釋液的體積為0.1mL)()A.2.34×108B.2.34×109C.234D.23.4B甲同學(xué)做此實(shí)驗(yàn)在稀釋倍數(shù)105獲得3個平板，菌落數(shù)分別是80、90、100，涂布平板時均使用0.1ml菌液，試計算每克土壤中可以分離尿素的細(xì)菌數(shù)目？（80+90+100）/30.1×105=9×107個三、微生物的數(shù)量測定三、微生物的數(shù)量測定利用特定的___________或_____________在________下觀察、計數(shù)，然后再計算__________的樣品中微生物的數(shù)量；細(xì)菌計數(shù)板血細(xì)胞計數(shù)板顯微鏡一定體積*血細(xì)胞計數(shù)板常用對相對較大的酵母菌細(xì)胞、霉菌孢子等；*細(xì)菌計數(shù)板可對細(xì)菌等較小的細(xì)胞進(jìn)行觀察和計數(shù)；設(shè)備簡單，能觀察微生物的形態(tài)特征。__________快速直觀為了避免上述缺點(diǎn)，可以染色后進(jìn)行顯微鏡計數(shù)。①統(tǒng)計結(jié)果一般是______________________不能區(qū)分死菌與活菌→偏大②個體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察。活菌數(shù)和死菌數(shù)的總和2.間接計數(shù)法——顯微直接計數(shù)法原理優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)三、微生物的數(shù)量測定2.間接計數(shù)法——顯微直接計數(shù)法每毫升原液所含細(xì)菌數(shù)＝每小格平均細(xì)菌數(shù)×400×10000×稀釋倍數(shù)計數(shù)區(qū)放大后的計數(shù)室計算方法血細(xì)胞計數(shù)板方格網(wǎng)上刻有9個大方格，其中只有中間的一個大方格為計數(shù)室，供計數(shù)用。中方格小方格（雙線分割）大方格邊長為1mm，深度為0.1mm1個計數(shù)室的體積為0.1mm3。1個計數(shù)室有400個小方格。每個小方格的體積是1/4000mm3。1mL培養(yǎng)液所含菌數(shù)＝每小格平均菌數(shù)×400×104×稀釋倍數(shù)三、微生物的數(shù)量測定三、微生物的數(shù)量測定1、某小組進(jìn)行“探究培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的變化”實(shí)驗(yàn)，利用血細(xì)胞計數(shù)板(16×25型)對酵母菌進(jìn)行計數(shù)。取1mL培養(yǎng)液加99mL無菌水，若觀察到所選4個中方格內(nèi)共有酵母菌400個，則培養(yǎng)液中酵母菌的種群密度為

。1.6×109個/mL2、將樣液稀釋100倍，采用血球計數(shù)板（規(guī)格為1mm×1mm×0.1mm）計數(shù)，觀察到的計數(shù)室細(xì)胞分布見右圖，則培養(yǎng)液中酵母菌細(xì)胞的密度是＿＿＿

＿

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個/mL。1×108

某生物實(shí)驗(yàn)小組將酵母菌接種到裝有10mL液體培養(yǎng)基的試管中，通氣培養(yǎng)并定時取樣計數(shù)，然后繪制增長曲線。圖1是小組成員用血細(xì)胞計數(shù)板觀察到的培養(yǎng)結(jié)果（樣液稀釋10倍，血細(xì)胞計數(shù)板規(guī)格1mm×1mm×0.lmm），圖2曲線a、b是兩批次酵母菌培養(yǎng)的結(jié)果。分析回答問題。（2）在計數(shù)前常采用臺盼藍(lán)染液染色，若細(xì)胞被染成藍(lán)色，則_________（選填“需要”或“不需要”）計數(shù)。計數(shù)時若圖1雙線邊內(nèi)有4個細(xì)胞為藍(lán)色，此時試管中酵母菌數(shù)量約為_________個。不需要5×10820÷16×400×10×10×1000÷0.1=5×108個。三、微生物的數(shù)量測定內(nèi)容直接計數(shù)法間接計數(shù)法主要用具計數(shù)依據(jù)優(yōu)點(diǎn)計算公式缺點(diǎn)結(jié)果細(xì)菌計數(shù)板或血細(xì)胞計數(shù)板涂布器細(xì)菌個數(shù)培養(yǎng)基上菌落數(shù)計數(shù)方便、操作簡單計數(shù)的是活菌每毫升原液含菌株數(shù)＝每小格平均菌株數(shù)×400×10000×稀釋倍數(shù)每克樣品中的菌株數(shù):(C÷V)×M不能區(qū)分死菌與活菌當(dāng)兩個或多個菌體連在一起時,平板上觀察到的只是一個菌落比實(shí)際值偏大比實(shí)際值偏小三、微生物的數(shù)量測定兩種計數(shù)方法的比較（1）從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌（2）統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌絕大多數(shù)微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的選擇培養(yǎng)基，可以從土壤中分離出分解尿素的細(xì)菌。CO(NH2)2脲酶+H2O+CO22NH3實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理探究?實(shí)踐：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計數(shù)細(xì)菌宜在酸堿度接近中性的潮濕土壤中生長，絕大部分分布在距地表3～8cm的土壤層。鏟去表層土3cm左右，取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。無菌操作：鐵鏟和信封都要滅菌，操作完成后，一定要洗手。土壤取樣制培養(yǎng)基樣品稀釋涂布平板觀察培養(yǎng)菌落計數(shù)實(shí)驗(yàn)流程探究?實(shí)踐：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計數(shù)土壤取樣制培養(yǎng)基樣品稀釋涂布平板觀察培養(yǎng)菌落計數(shù)選擇培養(yǎng)基的配方組分含量KH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g瓊脂15.0gH2O定容至1000mL提供無機(jī)鹽凝固劑提供氮源提供碳源思考：制備培養(yǎng)基時除了制備選擇培養(yǎng)基還要制備什么培養(yǎng)基？為什么？牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、對照作用實(shí)驗(yàn)流程探究?實(shí)踐：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計數(shù)土壤取樣制培養(yǎng)基樣品稀釋涂布平板觀察培養(yǎng)菌落計數(shù)1×101mL1mL1mL1mL1mL1mL10210310410510610710g9mL無菌水90mL無菌水實(shí)驗(yàn)流程探究?實(shí)踐：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計數(shù)土壤取樣制培養(yǎng)基樣品稀釋涂布平板觀察培養(yǎng)菌落計數(shù)測細(xì)菌數(shù)：一般用104、105、106稀釋液。測放線菌：一般用103、104、105稀釋液。測真菌數(shù)：一般用102、103、104稀釋液。不同微生物在土壤中含量不同，分離不同的微生物采用不同的稀釋度，以保證獲得菌落數(shù)在30～300之間適于計數(shù)的平板。BAC在初次實(shí)驗(yàn)中，對于稀釋的范圍沒有把握，怎樣做才能保證從中選擇出菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計數(shù)？選用稀釋范圍更大的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)。例如：將1×103～1×107倍稀釋的稀釋液分別涂布到平板上培養(yǎng)，以保證能從中選擇出菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計數(shù)。實(shí)驗(yàn)流程探究?實(shí)踐：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計數(shù)土壤取樣制培養(yǎng)基樣品稀釋涂布平板觀察培養(yǎng)菌落計數(shù)實(shí)驗(yàn)流程選擇培養(yǎng)基（平行重復(fù)）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(作為對照)（用以判斷選擇培養(yǎng)基是否具有選擇作用）整個實(shí)驗(yàn)還要設(shè)置

個空白對照平板：未接種的

。培養(yǎng)基，以驗(yàn)證培養(yǎng)基中是否含有雜菌。2選擇培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨探究?實(shí)踐：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計數(shù)土壤取樣制培養(yǎng)基樣品稀釋涂布平板觀察培養(yǎng)菌落計數(shù)培養(yǎng)條件：不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。

細(xì)菌一般在30～37℃的溫度下培養(yǎng)1～2d。觀察：每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目，選取

時的記錄作為結(jié)果。

。結(jié)果：一般來說，在相同的培養(yǎng)條件下，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征，如形狀、大小和顏色等。注意事項(xiàng)：本實(shí)驗(yàn)使用的平板和試管較多，為了避免混淆，最好在使用前做好標(biāo)記。例如，在標(biāo)記培養(yǎng)皿（皿底）時應(yīng)該注明組別、培養(yǎng)日期和平板上培養(yǎng)樣品的稀釋度等。實(shí)驗(yàn)流程菌落數(shù)目穩(wěn)定防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致菌落數(shù)目遺漏探究?實(shí)踐：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計數(shù)土壤取樣制培養(yǎng)基樣品稀釋涂布平板觀察培養(yǎng)菌落計數(shù)當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時，選取菌落數(shù)在30~300的平板進(jìn)行計數(shù)，同一稀釋度下至少計數(shù)3個平板，求出平均值，并根據(jù)所對應(yīng)的稀釋度計算出樣品中細(xì)菌的數(shù)目。設(shè)計如下表格記錄并計數(shù)。稀釋度104105106123平均值123平均值123平均值每個平板的菌落數(shù)實(shí)驗(yàn)流程探究?實(shí)踐：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計數(shù)①結(jié)合對照組，分析培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出一些菌落。如果沒有菌落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。如果完全培養(yǎng)基上的菌落數(shù)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，說明選擇培養(yǎng)基篩選出了一些尿素分解菌。如果得到了兩個或多個菌落數(shù)為30～300的平板，說明稀釋度合適，操作比較成功，能夠進(jìn)行菌落的計數(shù)。如果用同一土樣進(jìn)行的操作，數(shù)據(jù)應(yīng)該比較接近。如果差異很大，就需從操作是否規(guī)范、培養(yǎng)基配制是否合理等方面查找原因。②你是否獲得了某一稀釋度下菌落數(shù)為30～300的平板?在這一稀釋度下，是否至少有2個平板的菌落數(shù)接近?③你統(tǒng)計的每克土樣中能分解尿素的細(xì)菌的菌落數(shù)是多少?與其他同學(xué)統(tǒng)計的結(jié)果