【源版】Waters-600-HPLC操作培訓(xùn)

Waters600HPLC操作培訓(xùn)制作人:馬志爽

左右泵頭進氣口總閥泵的單向閥的進口和出口進樣閥壓力傳感器泵出口泵梯度運行控制界面設(shè)置快速操作方法程序方法程序表格泵設(shè)置界面等度洗脫界面梯度洗脫最初界面梯度程序控制界面梯度操作界面程序事件界面泵的配置界面一、操作功能畫面說明Setup：設(shè)定pump硬件系統(tǒng)配制2.Direct：等度（Isocratic）操作設(shè)定

FLOWRATE:流動相流速設(shè)定（范圍隨著硬件規(guī)格而定）COMPOSITION：流動相調(diào)配比例（A＋B＋C＋D＝100％）CURRENT：目前狀態(tài)比例；New：變更狀態(tài)比例；SPARGE：氦氣法裝置流量（0－100）TEMPERATURE：設(shè)定色譜柱加熱裝置溫度（室溫～90℃）；PRESSURE：顯示系統(tǒng)壓力值；SWITCH：外接裝置之控制開關(guān)；STOPFlow：停止Pump流速。3.OperateMethod：執(zhí)行梯度（GRADIENT）功能操作4.ProgramMethod-編輯梯度表（GradientTable）5.ProgramMethod-編輯事件表（EventTable）二、基本操作說明（ISOCRATIC）1.打開氦氣鋼瓶，設(shè)定輸出壓力為50～90psi（使用In－line脫氣機者，請忽略此步驟）；2.將溶劑輸送塑料管置于溶劑瓶內(nèi)液面下（請注意輸送塑料管之代號），打開電源開關(guān)至ON（1）的位置，出現(xiàn)如下開機畫面：3.按一下“setup”功能鍵，即進入Pumpsetup畫面。4.移動光標(biāo)設(shè)定欲使用溶劑瓶A，B，C或D的氦氣法脫氣裝置開關(guān)，使其為ENABLE（按“1”，Enter→ENABLE打開；按“0”，Enter→DISABLE關(guān)閉）5.如果有使用色譜柱加熱裝置，設(shè)定上限溫度數(shù)值（應(yīng)低于溶劑沸點）；6.設(shè)定系統(tǒng)壓力上限數(shù)值為4000psi；7.按一下”Direct“功能鍵，即進ISOCRATIC畫面。8.設(shè)定氦氣脫氣裝置（SPARGE）流量為100，此時可見到溶劑瓶內(nèi)有氣體吹出之狀態(tài)，維持約30min后，可降低至30以節(jié)省氦氣；9.將Pump中間之參比閥（ReferenceValve）扳手往右扳開，設(shè)定Pump流速1.0mL/min，Enter，啟動Pump流速；10.選擇欲使用之某一個溶劑，并設(shè)定其Current比例為100％，然后將10mL注射針筒轉(zhuǎn)進溶劑抽取閥門（InletManifoldValve）上方之洞口，再將閥門向左旋轉(zhuǎn)至“DRAW”之位置，抽出溶劑約10mL兩次，并檢視溶劑輸送塑料管內(nèi)確實已完全無氣泡存在，抽取完畢后將閥門回轉(zhuǎn)至“RUN”之位置，再將注射針筒轉(zhuǎn)開拔出。11.若有使用其它溶劑瓶，請重復(fù)前一步驟直到所有溶劑抽取完畢為止；12.設(shè)定Pump流速15.0mL/min(注意：確認(rèn)參比閥是往右扳開的)，Enter，啟動Pump高流速來排擠管路內(nèi)之氣泡；13.確認(rèn)溶劑排出是呈連續(xù)不間斷之狀態(tài)，然后按一下“StopFlow”相對屏幕功能鍵，停止Pump流速，再將溶劑排出閥門（Referencevalve）扳手往左壓緊；14.安裝色譜柱，設(shè)定流速至使用的范圍（約1.0~2.0mL/min），以及流動相比例（注意：％A＋％B+%C+%D=100％），待系統(tǒng)平衡穩(wěn)定后，即可開始進樣做分析檢測.注意事項:(1)當(dāng)使用無機鹽類流動相后，須以超純水沖洗，再以甲醇沖洗；(2)若此Pump是以IEEE-488聯(lián)機做計算機控制時，以上之操作條件參數(shù)必須在Millennium計算機軟件操作方法內(nèi)加以儲存設(shè)定，才得以有效之控制。三、程序化（Gradient）操作方法1.編輯Gradient方法表格(1)按一下“ProgramMethod”功能鍵，即進入PROGRAMGRADIENT畫面；(2)可先按一下“CLEARTABLE”鍵，消除表格內(nèi)原設(shè)定條件，然后在Gradient表上的Time（洗脫時間）、Flow（流速）、％A，％B，％C，％D（溶劑比例）及Curve（變化曲線）處，逐列輸入欲進行之梯度變化；注：①INITIAL為起始的條件；②％A＋％B+%C+%D必須等于100％；③每一列在各項輸入后，必須按Enter鍵；④GradientCurveShapes；（3）梯度表編輯完成后，按一下“SAVE”鍵，畫面上會出現(xiàn)EnterTableNumber（1－15）輸入欲存放之表號，再按Enter鍵，畫面上會出現(xiàn)ReplacewithNewTable？1＝Y(jié)es0＝No輸入1，將梯度表儲存起來。

2.編輯事件（EVENT）方法表格

（1）按一下“ProgramTable”功能鍵，即進入PROGRAMEVENT畫面（2）可先按一下“CLEARTABLE”鍵，消除表格內(nèi)原設(shè)定條件，然后在EVENT表上的Time（洗脫時間）、EVENT（事件）、ACTION（動作)處，逐列輸入欲進行之事件變化；注：事件的選擇（ChoiceOfEvent）動作的選擇

1－4＝1-4個外接裝置控制開關(guān)On/Off/Pulse5＝警示聲響On/Off6=氦氣法脫氣裝置（SPAGE）流量0－1007＝色譜柱加熱裝置溫度室溫～90℃8＝進入某一號方法Table程序1－159＝開始執(zhí)行某一號方法Table程序1-1510＝執(zhí)行紫外檢測器氘燈的開關(guān)On/Off（3）事件表編輯完成后，按一下“Save”鍵，畫面上會出現(xiàn)EnterTableNumber（1－15）輸入欲存放之表號，再按Enter鍵，畫面上會出現(xiàn)ReplacewithNewTable？1＝Y(jié)es0＝No輸入1，將事件表儲存起來3.執(zhí)行程序化方法（1）按一下“OperateMethod”功能鍵，即進入OperateGradient畫面（2）在畫面上的“GradientAndEventsTable＃：”輸入欲執(zhí)行的表號，即會同時執(zhí)行梯度表與事件表之程序；（3）再按一下“OperateMethod”功能鍵，即進入Gradient的準(zhǔn)備狀態(tài)（INTIAL）畫面；（4）待系統(tǒng)平衡穩(wěn)定后，即可開始進樣做分析檢測；當(dāng)以手動進樣器或自動進樣器完成進樣動作時，將會有一觸發(fā)訊號同時啟動程序動作，可看到Time（洗脫時間）開始計時與溶劑比例的變化；注：若手動按一下”STARTRUN”鍵，亦可啟動程序動作。（5）使用中途或分析完成后，可再按一下“INITIAL”功能鍵，讓Pump回復(fù)至程序的起始條件，以便繼續(xù)做下一個分析檢測。4.中止執(zhí)行程序化方法（1）于執(zhí)行程序方法當(dāng)中，欲中止執(zhí)行，按一下“Direct”功能鍵，即出現(xiàn)如下之警告畫面；（2）如果是因不小心按到“Direct”功能鍵，并非要中止執(zhí)行，則再按一下“OperateMethod”功能鍵即可再回復(fù)至執(zhí)行程序方法當(dāng)中而不會影響操作；如果確定要中止執(zhí)行，則再按一下“Direct”功能鍵，畫面將切換至“ISOCRATIC”而保持在中止程序那個時間點之狀態(tài)。四、關(guān)機方法1.當(dāng)分析檢測完畢后，對泵進行沖洗后，關(guān)閉流量，注意流速必須要逐步變化。洗脫順序為：如果使用有緩沖液的流動相，則停泵前一定要用HPLC級純水清洗HPLC系統(tǒng)。同時用純水清洗柱塞桿密封圈。若停泵存放時間超過一天，則停泵前須用水/甲醇清洗系統(tǒng)。2.直接關(guān)閉電源開關(guān)至OFF（0）的位置即可，并將氦氣鋼瓶關(guān)閉。五、液相色譜儀介紹、日常維護和故障排除1泵1.1泵的構(gòu)造和性能輸液泵是HPLC系統(tǒng)中最重要的部件之一。泵的性能好壞直接影響到整個系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可靠性。輸液泵應(yīng)具備如下性能：①流量穩(wěn)定，其RSD應(yīng)＜0.5%，這對定性定量的準(zhǔn)確性至關(guān)重要；②流量范圍寬，分析型應(yīng)在0.1~10ml/min范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)，制備型應(yīng)能達(dá)到100ml/min；③輸出壓力高，一般應(yīng)能達(dá)到150~300kg/cm2；④液缸容積小；⑤密封性能好，耐腐蝕。泵的種類很多，按輸液性質(zhì)可分為恒壓泵和恒流泵。恒流泵按結(jié)構(gòu)又可分為螺旋注射泵、柱塞往復(fù)泵和隔膜往復(fù)泵。恒壓泵受柱阻影響，流量不穩(wěn)定；螺旋泵缸體太大，這兩種泵已被淘汰。目前應(yīng)用最多的是柱塞往復(fù)泵。

柱塞往復(fù)泵的液缸容積小，可至0.1ml，因此易于清洗和更換流動相，特別適合于再循環(huán)和梯度洗脫；改變電機轉(zhuǎn)速能方便地調(diào)節(jié)流量，流量不受柱阻影響；泵壓可達(dá)400kg/cm2。其主要缺點是輸出的脈沖性較大，現(xiàn)多采用雙泵系統(tǒng)來克服。雙泵按連接方式可分為并聯(lián)式和串聯(lián)式，一般說來并聯(lián)泵的流量重現(xiàn)性較好（RSD為0.1%左右，串聯(lián)泵為0.2~0.3%），但出故障的機會較多（因多一單向閥），價格也較貴。1.2泵的使用和維護注意事項

為了延長泵的使用壽命和維持其輸液的穩(wěn)定性，必須按照下列注意事項進行操作：

①防止任何固體微粒進入泵體，因為塵?；蚱渌魏坞s質(zhì)微粒都會磨損柱塞、密封環(huán)、缸體和單向閥，因此應(yīng)預(yù)先除去流動相中的任何固體微粒。流動相最好在玻璃容器內(nèi)蒸餾，而常用的方法是濾過，可采用Millipore濾膜（0.2µm或0.45µm）等濾器。泵的入口都應(yīng)連接砂濾棒（或片）。輸液泵的濾器應(yīng)經(jīng)常清洗或更換。

②流動相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的流動相不應(yīng)保留在泵內(nèi)，尤其是在停泵過夜或更長時間的情況下。如果將含緩沖液的流動相留在泵內(nèi)，由于蒸發(fā)或泄漏，甚至只是由于溶液的靜置，就可能析出鹽的微細(xì)晶體，這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環(huán)和柱塞等。因此，必須泵入純水將泵充分清洗后，再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護的溶劑（對于反相鍵合硅膠固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。③泵工作時要留心防止溶劑瓶內(nèi)的流動相被用完，否則空泵運轉(zhuǎn)也會磨損柱塞、缸體或密封環(huán)，最終產(chǎn)生漏液。④輸液泵的工作壓力決不要超過規(guī)定的最高壓力，否則會使高壓密封環(huán)變形，產(chǎn)生漏液。⑤流動相應(yīng)該先脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性，如果有大量氣泡，泵就無法正常工作。如果輸液泵產(chǎn)生故障，須查明原因，采取相應(yīng)措施排除故障：①沒有流動相流出，又無壓力指示。原因可能是泵內(nèi)有大量氣體，這時可打開泄壓閥，使泵在較大流量（如5ml/min）下運轉(zhuǎn)，將氣泡排盡，也可用一個50ml針筒在泵出口處幫助抽出氣體。另一個可能原因是密封環(huán)磨損，需更換。②壓力和流量不穩(wěn)。原因可能是氣泡，需要排除；或者是單向閥內(nèi)有異物，可卸下單向閥，浸入丙酮內(nèi)超聲清洗。有時可能是砂濾棒內(nèi)有氣泡，或被鹽的微細(xì)晶粒或滋生的微生物部分堵塞，這時，可卸下砂濾棒浸入流動相內(nèi)超聲除氣泡，或?qū)⑸盀V棒浸入稀酸（如4mol/L硝酸）內(nèi)迅速除去微生物，或?qū)Ⅺ}溶解，再立即清洗。③壓力過高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。壓力降低的原因則可能是管路有泄漏。檢查堵塞或泄漏時應(yīng)逐段進行。1.3梯度洗脫HPLC有等強度(isocratic)和梯度(gradient)洗脫兩種方式。等度洗脫是在同一分析周期內(nèi)流動相組成保持恒定，適合于組分?jǐn)?shù)目較少，性質(zhì)差別不大的樣品。梯度洗脫是在一個分析周期內(nèi)程序控制流動相的組成，如溶劑的極性、離子強度和pH值等，用于分析組分?jǐn)?shù)目多、性質(zhì)差異較大的復(fù)雜樣品。采用梯度洗脫可以縮短分析時間，提高分離度，改善峰形，提高檢測靈敏度，但是常常引起基線漂移和降低重現(xiàn)性。梯度洗脫有兩種實現(xiàn)方式：低壓梯度（外梯度）和高壓梯度（內(nèi)梯度）。兩種溶劑組成的梯度洗脫可按任意程度混合，即有多種洗脫曲線：線性梯度、凹形梯度、凸形梯度和階梯形梯度。線性梯度最常用，尤其適合于在反相柱上進行梯度洗脫。在進行梯度洗脫時，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此帶來一些特殊問題，必須充分重視：①要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相。有些溶劑在一定比例內(nèi)混溶，超出范圍后就不互溶，使用時更要引起注意。當(dāng)有機溶劑和緩沖液混合時，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時需特別小心。②梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現(xiàn)性。進行樣品分析前必須進行空白梯度洗脫，以辨認(rèn)溶劑雜質(zhì)峰，因為弱溶劑中的雜質(zhì)富集在色譜柱頭后會被強溶劑洗脫下來。用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止混合時產(chǎn)生氣泡。③混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時常出現(xiàn)壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小，當(dāng)二者以相近比例混合時粘度增大很多，此時的柱壓大約是甲醇或水為流動相時的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱能承受的最大壓力。

④每次梯度洗脫之后必須對色譜柱進行再生處理，使其恢復(fù)到初始狀態(tài)。需讓10～30倍柱容積的初始流動相流經(jīng)色譜柱，使固定相與初始流動相達(dá)到完全平衡。2進樣器

早期使用隔膜和停流進樣器，裝在色譜柱入口處?，F(xiàn)在大都使用六通進樣閥或自動進樣器。進樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復(fù)性好，保證中心進樣，進樣時對色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。HPLC進樣方式可分為：隔膜進樣、停流進樣、閥進樣、自動進樣。2.1隔膜進樣用微量注射器將樣品注入專門設(shè)計的與色譜柱相連的進樣頭內(nèi)，可把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎等于零，可以獲得最佳的柱效，且價格便宜，操作方便。但不能在高壓下使用（如10MPa以上）；此外隔膜容易吸附樣品產(chǎn)生記憶效應(yīng)，使進樣重復(fù)性只能達(dá)到1~2%；加之能耐各種溶劑的橡皮不易找到，常規(guī)分析使用受到限制。2.2停流進樣可避免在高壓下進樣。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新啟動時往往會出現(xiàn)"鬼峰"；另一缺點是保留時間不準(zhǔn)。在以峰的始末信號控制餾分收集的制備色譜中，效果較好。2.3閥進樣一般HPLC分析常用六通進樣閥（以美國Rheodyne公司的7725和7725i型最常見），其關(guān)鍵部件由圓形密封墊（轉(zhuǎn)子）和固定底座（定子）組成。由于閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率低于隔膜進樣（約下降5~10%左右），但耐高壓（35~40MPa），進樣量準(zhǔn)確，重復(fù)性好（0.5%），操作方便。六通閥的進樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。①用部分裝液法進樣時，進樣量應(yīng)不大于定量環(huán)體積的50%（最多75％），并要求每次進樣體積準(zhǔn)確、相同。此法進樣的準(zhǔn)確度和重復(fù)性決定于注射器取樣的熟練程度，而且易產(chǎn)生由進樣引起的峰展寬。②用完全裝液法進樣時，進樣量應(yīng)不小于定量環(huán)體積的5~10倍（最少3倍），這樣才能完全置換定量環(huán)內(nèi)的流動相，消除管壁效應(yīng)，確保進樣的準(zhǔn)確度及重復(fù)性。六通閥使用和維護注意事項①樣品溶液進樣前必須用0.45µm濾膜過濾，以減少微粒對進樣閥的磨損。②轉(zhuǎn)動閥芯時不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動相受阻，使泵內(nèi)壓力劇增，甚至超過泵的最大壓力；再轉(zhuǎn)到進樣位時，過高的壓力將使柱頭損壞。③為防止緩沖鹽和樣品殘留在進樣閥中，每次分析結(jié)束后應(yīng)沖洗進樣閥。通?？捎盟疀_洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。2.4自動進樣用于大量樣品的常規(guī)分析。3色譜柱

色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔(dān)負(fù)分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁、有機聚合物微球（包括離子交換樹脂）、多孔碳等，其粒度一般為3,5,7,10μm等，柱效理論值可達(dá)5~16萬/米。對于一般的分析只需5000塔板數(shù)的柱效；對于同系物分析，只要500即可；對于較難分離物質(zhì)對則可采用高達(dá)2萬的柱子，因此一般10~30cm左右的柱長就能滿足復(fù)雜混合物分析的需要。

柱效受柱內(nèi)外因素影響，為使色譜柱達(dá)到最佳效率，除柱外死體積要小外，還要有合理的柱結(jié)構(gòu)（盡可能減少填充床以外的死體積）及裝填技術(shù)。即使最好的裝填技術(shù)，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產(chǎn)生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是管壁效應(yīng)。這種管壁區(qū)大約是從管壁向內(nèi)算起30倍粒徑的厚度。在一般的液相色譜系統(tǒng)中，柱外效應(yīng)對柱效的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于管壁效應(yīng)。3.1柱的構(gòu)造

色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高于70kg/cm2時，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度。為提高柱效，減小管壁效應(yīng)，不銹鋼柱內(nèi)壁多經(jīng)過拋光。也有人在不銹鋼柱內(nèi)壁涂敷氟塑料以提高內(nèi)壁的光潔度，其效果與拋光相同。還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細(xì)管柱。色譜柱兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板，是燒結(jié)不銹鋼或鈦合金，孔徑0.2~20µm(5~10µm)，取決于填料粒度，目的是防止填料漏出。

色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類，尺寸規(guī)格也不同：①常規(guī)分析柱（常量柱），內(nèi)徑2~5mm（常用4.6mm，國內(nèi)有4mm和5mm），柱長10~30cm；②窄徑柱（narrowbore，又稱細(xì)管徑柱、半微柱semi-microcolumn），內(nèi)徑1~2mm，柱長10~20cm；③毛細(xì)管柱（又稱微柱microcolumn），內(nèi)徑0.2~0.5mm；④半制備柱，內(nèi)徑＞5mm；⑤實驗室制備柱，內(nèi)徑20~40mm，柱長10~30cm；⑥生產(chǎn)制備柱內(nèi)徑可達(dá)幾十厘米。柱內(nèi)徑一般是根據(jù)柱長、填料粒徑和折合流速來確定，目的是為了避免管壁效應(yīng)。3.2柱的發(fā)展方向因強調(diào)分析速度而發(fā)展出短柱，柱長3~10cm，填料粒徑2~3µm。為提高分析靈敏度，與質(zhì)譜(MS)聯(lián)接，而發(fā)展出窄徑柱、毛細(xì)管柱和內(nèi)徑小于0.2mm的微徑柱（microbore）。細(xì)管徑柱的優(yōu)點是：①節(jié)省流動相；②靈敏度增加；③樣品量少；④能使用長柱達(dá)到高分離度；⑤容易控制柱溫；⑥易于實現(xiàn)LC-MS聯(lián)用。但由于柱體積越來越小，柱外效應(yīng)的影響就更加顯著，需要更小池體積的檢測器（甚至采用柱上檢測），更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設(shè)備應(yīng)具備如下性能：輸液泵能精密輸出1~100µl/min的低流量，進樣閥能準(zhǔn)確、重復(fù)地進樣微小體積的樣品。且因上樣量小，要求高靈敏度的檢測器，電化學(xué)檢測器和質(zhì)譜儀在這方面具有突出優(yōu)點。3.3柱的填充和性能評價

色譜柱的性能除了與固定相性能有關(guān)外，還與填充技術(shù)有關(guān)。在正常條件下，填料粒度＞20µm時，干法填充制備柱較為合適；顆粒＜20µm時，濕法填充較為理想。填充方法一般有4種：①高壓勻漿法，多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充；②徑向加壓法，Waters專利；③軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱；④干法。柱填充的技術(shù)性很強，大多數(shù)實驗室使用已填充好的商品柱。

必須指出，高效液相色譜柱的獲得，裝填技術(shù)是重要環(huán)節(jié)，但根本問題還在于填料本身性能的優(yōu)劣，以及配套的色譜儀系統(tǒng)的的結(jié)構(gòu)是否合理。

無論是自己裝填的還是購買的色譜柱，使用前都要對其性能進行考察，使用期間或放置一段時間后也要重新檢查。柱性能指標(biāo)包括在一定實驗條件下（樣品、流動相、流速、溫度）下的柱壓、理論塔板高度和塔板數(shù)、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重復(fù)性，或分離度。一般說來容量因子和選擇性因子的重復(fù)性在±5%或±10%以內(nèi)。進行柱效比較時，還要注意柱外效應(yīng)是否有變化。

一份合格的色譜柱評價報告應(yīng)給出柱的基本參數(shù)，如柱長、內(nèi)徑、填料的種類、粒度、色譜柱的柱效、不對稱度和柱壓降等。3.4柱的使用和維護注意事項

色譜柱的正確使用和維護十分重要，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護色譜柱。①避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時應(yīng)該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉(zhuǎn)動不能過緩（如前所述）。②應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機溶劑改變?yōu)槿渴撬粗嗳?。③一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會迅速降低柱效。④選擇使用適宜的流動相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時，預(yù)柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預(yù)先被硅膠"飽和"，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。

⑤避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對樣品進行預(yù)處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。⑥經(jīng)常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進行清洗時，對流路系統(tǒng)中流動相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要50~75ml。⑦流動相在使用前必須進行脫氣處理，盡量不使用或少使用高粘度的流動相。⑧在滿足靈敏度的情況下，盡可能使用小進樣量。如果樣品比較“臟”，要進行凈化或提純處理。⑨分析結(jié)束語后，要清洗掉進樣閥中殘留的樣品，并用流動相或適當(dāng)?shù)娜軇┣逑瓷V柱。⑩如色譜柱長期不用，應(yīng)該用適當(dāng)?shù)挠袡C溶劑保存并封閉或定期給柱子補充合適的流動相。保存色譜柱時應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長時間。下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考：硅膠柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴(yán)格脫水。甲醇能洗去殘留的強極性雜質(zhì)，已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次沖洗，再以相反順序依次沖洗。如果下一步分析用的流動相不含緩沖液，那么可以省略最后用水沖洗這一步。一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質(zhì)，在甲醇（乙腈）沖洗時重復(fù)注射100~200µl四氫呋喃數(shù)次有助于除去強疏水性雜質(zhì)。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類脂。有時也注射二甲亞砜數(shù)次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脫能除去蛋白質(zhì)污染。

陽離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去交換性能強的鹽，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有機物）、甲醇、水依次沖洗。

11.色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M行清洗；另一種可能是大分子進入柱內(nèi)，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。

在后兩種情況發(fā)生時，小心擰開柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出1~2mm高度（注意把被污染填料取凈）再把柱內(nèi)填料整平。然后用適當(dāng)溶劑濕潤的固定相（與柱內(nèi)相同）填滿色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善，但是很難恢復(fù)到新柱的水平。

柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（5~30mm），可以起到保護、延長柱壽命的作用。采用保護柱會損失一定的柱效，這是值得的。

通常色譜柱壽命在正確使用時可達(dá)2年以上。以硅膠為基質(zhì)的填料，只能在pH2~9范圍內(nèi)使用。柱子使用一段時間后，可能有一些吸附作用強的物質(zhì)保留于柱頂，特別是一些有色物質(zhì)更易看清被吸著在柱頂?shù)奶盍仙?。新的色譜柱在使用一段時間后柱頂填料可能塌陷，使柱效下降，這時也可補加填料使柱效恢復(fù)。

每次工作完后，最好用洗脫能力強的洗脫液沖洗，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當(dāng)采用鹽緩沖溶液作流動相時，使用完后應(yīng)用無鹽流動相沖洗。含鹵族元素（氟、氯、溴）的化合物可能會腐蝕不銹鋼管道，不宜長期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經(jīng)常使用，應(yīng)每隔4~5天開機沖洗15分鐘。4檢測器對于紫外檢測器，在分析柱平衡的差不多時，開啟檢測器；在分析完成后，馬上關(guān)閉檢測器。檢測器是HPLC儀的三大關(guān)鍵部件之一。其作用是把洗脫液中組分的量轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?。HPLC的檢測器要求靈敏度高、噪音低（即對溫度、流量等外界變化不敏感）、線性范圍寬、重復(fù)性好和適用范圍廣。4.1分類1）按原理可分為光學(xué)檢測器（如紫外、熒光、示差折光、蒸發(fā)光散射）、熱學(xué)檢測器（如吸附熱）、電化學(xué)檢測器（如極譜、庫侖、安培）、電學(xué)檢測器（電導(dǎo)、介電常數(shù)、壓電石英頻率）、放射性檢測器（閃爍計數(shù)、電子捕獲、氦離子化）以及氫火焰離子化檢測器。2）按測量性質(zhì)可分為通用型和專屬型（又稱選擇性）。通用型檢測器測量的是一般物質(zhì)均具有的性質(zhì)，它對溶劑和溶質(zhì)組分均有反應(yīng)，如示差折光、蒸發(fā)光散射檢測器。通用型的靈敏度一般比專屬型的低。專屬型檢測器只能檢測某些組分的某一性質(zhì)，如紫外、熒光檢測器，它們只對有紫外吸收或熒光發(fā)射的組分有響應(yīng)。3）按檢測方式分為濃度型和質(zhì)量型。濃度型檢測器的響應(yīng)與流動相中組分的濃度有關(guān)，質(zhì)量型檢測器的響應(yīng)與單位時間內(nèi)通過檢測器的組分的量有關(guān)。4）檢測器還可分為破壞樣品和不破壞樣品的兩種。4.2性能指標(biāo)1）噪音和漂移：在儀器穩(wěn)定之后，記錄基線1小時，基線帶寬為噪音，基線在1小時內(nèi)的變化為漂移。它們反映檢測器電子元件的穩(wěn)定性，及其受溫度和電源變化的影響，如果有流動相從色譜柱流入檢測器，那么它們還反映流速（泵的脈動）和溶劑（純度、含有氣泡、固定相流失）的影響。噪音和漂移都會影響測定的準(zhǔn)確度，應(yīng)盡量減小。2）靈敏度(sensitivity)：表示一定量的樣品物質(zhì)通過檢測器時所給出的信號大小。對濃度型檢測器，它表示單位濃度的樣品所產(chǎn)生的電信號的大小，單位為mV·ml/g。對質(zhì)量型檢測器，它表示在單位時間內(nèi)通過檢測器的單位質(zhì)量的樣品所產(chǎn)生的電信號的大小，單位為mV·s/g。3）檢測限(detectionlimit)

檢測器靈敏度的高低，并不等于它檢測最小樣品量或最低樣品濃度能力的高低，因為在定義靈敏度時，沒有考慮噪聲的大小，而檢測限與噪聲的大小是直接有關(guān)的。

檢測限指恰好產(chǎn)生可辨別的信號（通常用2倍或3倍噪音表示）時進入檢測器的某組分的量（對濃度型檢測器指在流動相中的濃度--注意與分析方法檢測限的區(qū)別，單位g/ml或mg/ml；對質(zhì)量型檢測器指的是單位時間內(nèi)進入檢測器的量，單位g/s或mg/s）。又稱為敏感度(detectability)。D＝2N/S，式中N為噪聲，S為靈敏度。通常是把一個已知量的標(biāo)準(zhǔn)溶液注入到檢測器中來測定其檢測限的大小。

檢測限是檢測器的一個主要性能指標(biāo)，其數(shù)值越小，檢測器性能越好。值得注意的是，分析方法的檢測限除了與檢測器的噪聲和靈敏度有關(guān)外，還與色譜條件、色譜柱和泵的穩(wěn)定性及各種柱外因素引起的峰展寬有關(guān)。4）線性范圍(linearrange)：指檢測器的響應(yīng)信號與組分量成直線關(guān)系的范圍，即在固定靈敏度下，最大與最小進樣量（濃度型檢測器為組分在流動相中的濃度）之比。也可用響應(yīng)信號的最大與最小的范圍表示，例如Waters996PDA檢測器的線性范圍是-0.1~2.0A。

定量分析的準(zhǔn)確與否，關(guān)鍵在于檢測器所產(chǎn)生的信號是否與被測樣品的量始終呈一定的函數(shù)關(guān)系。輸出信號與樣品量最好呈線性關(guān)系，這樣進行定量測定時既準(zhǔn)確又方便。但實際上沒有一臺檢測器能在任何范圍內(nèi)呈線性響應(yīng)。通常A＝BCx，B為響應(yīng)因子，當(dāng)x=1時，為線性響應(yīng)。對大多數(shù)檢測器來說，x只在一定范圍內(nèi)才接近于1，實際上通常只要x=0.98~1.02就認(rèn)為它是呈線性的。

線性范圍一般可通過實驗確定。我們希望檢測器的線性范圍盡可能大些，能同時測定主成分和痕量成分。此外還要求池體積小，受溫度和流速的影響小，能適合梯度洗脫檢測等。5）池體積：除制備色譜外，大多數(shù)HPLC檢測器的池體積都小于10µl。在使用細(xì)管徑柱時，池體積應(yīng)減少到1~2µl甚至更低，不然檢測系統(tǒng)帶來的峰擴張問題就會很嚴(yán)重。而且這時池體、檢測器與色譜柱的連接、接頭等都要精心設(shè)計，否則會嚴(yán)重影響柱效和靈敏度。4.3紫外檢測器(ultravioletdetector)

UV檢測器是HPLC中應(yīng)用最廣泛的檢測器，當(dāng)檢測波長范圍包括可見光時，又稱為紫外-可見檢測器。它靈敏度高，噪音低，線性范圍寬，對流速和溫度均不敏感，可于制備色譜。由于靈敏高，因此既使是那些光吸收小、消光系數(shù)低的物質(zhì)也可用UV檢測器進行微量分析。但要注意流動相中各種溶劑的紫外吸收截止波長。如果溶劑中含有吸光雜質(zhì)，則會提高背景噪音，降低靈敏度（實際是提高檢測限）。此外，梯度洗脫時，還會產(chǎn)生漂移。

注：將溶劑裝入1cm的比色皿，以空氣為參比，逐漸降低入射波長，溶劑的吸光度A＝1時的波長稱為溶劑的截止波長。也稱極限波長。中國藥典對UV法溶劑的要求是：以空氣為空白，溶劑和吸收池的吸收度在220~240nm范圍內(nèi)不得超過0.40，在241~250nm范圍內(nèi)不得過0.20，在251~300nm范圍內(nèi)不得過0.10，在300nm以上不得過0.05。

UV檢測器的工作原理是Lambert-Beer定律，即當(dāng)一束單色光透過流動池時，若流動相不吸收光，則吸收度A與吸光組分的濃度C和流動池的光徑長度L成正比.

UV檢測器分為固定波長檢測器、可變波長檢測器和光電二極管陣列檢測器(photodiodearraydetector，PDAD)。按光路系統(tǒng)來分，UV檢測器可分為單光路和雙光路兩種?？勺儾ㄩL檢測器又可分單波長（單通道）檢測器和雙波長（雙通道）檢測器。PDAD是80年代出現(xiàn)的一種光學(xué)多通道檢測器，它可以對每個洗脫組分進行光譜掃描，經(jīng)計算機處理后，得到光譜和色譜結(jié)合的三維圖譜。其中吸收光譜用于定性（確證是否是單一純物質(zhì)），色譜用于定量。常用于復(fù)雜樣品（如生物樣品、中草藥）的定性定量分析。4.4二極管陣列檢測器4.5與檢測器有關(guān)的故障及其排除1）流動池內(nèi)有氣泡

如果有氣泡連續(xù)不斷地通過流動池，將使噪音增大，如果氣泡較大，則會在基線上出現(xiàn)許多線狀"峰"，這是由于系統(tǒng)內(nèi)有氣泡，需要對流動相進行充分的除氣，檢查整個色譜系統(tǒng)是否漏氣，再加大流量驅(qū)除系統(tǒng)內(nèi)的氣泡。如果氣泡停留在流動池內(nèi)，也可能使噪音增大，可采用突然增大流量的辦法除去氣泡（最好不連接色譜柱）；或者啟動輸液泵的同時，用手指緊壓流動池出口，使池內(nèi)增壓，然后放開?？煞磸?fù)操作數(shù)次，但要注意不使壓力增加太多，以免流動池破裂。2）流動池被污染

無論參比池或樣品池被污染，都可能產(chǎn)生噪音或基線漂移?？梢允褂眠m當(dāng)溶劑清洗檢測池，要注意溶劑的互溶性；如果污染嚴(yán)重，就需要依次采用1mol/L硝酸、水和新鮮溶劑沖洗，或者取出池體進行清洗、更換窗口。3）光源燈出現(xiàn)故障

紫外或熒光檢測器的光源燈使用到極限或者不能正常工作時，可能產(chǎn)生嚴(yán)重噪音，基線漂移，出現(xiàn)平頭峰等異常峰，甚至使基線不有回零。這時需要更換光源燈。4）倒峰

倒峰的出現(xiàn)可能是檢測器的極性接反了，改正后即可變成正峰。用示差折光檢測器時，如果組分的折光指數(shù)低于流動相的折光指數(shù)，也會出現(xiàn)倒峰，這就需要選擇合適的流動相。如果流動相中含有紫外吸收的雜質(zhì)，使用紫外檢測器時，無吸收的組分就會產(chǎn)生倒峰，因此必須用高純度的溶劑作流動相。在死時間附近的尖銳峰往往是由于進樣時的壓力變化，或者由于樣品溶劑與流動相不同所引起的。5數(shù)據(jù)處理和計算機控制系統(tǒng)

早期的HPLC儀器是用記錄儀記錄檢測信號，再手工測量計算。其后，使用積分儀計算并打印出峰高、峰面積和保留時間等參數(shù)。80年代后，計算機技術(shù)的廣泛應(yīng)用使HPLC操作更加快速、簡便、準(zhǔn)確、精密和自動化，現(xiàn)在已可在互聯(lián)網(wǎng)上遠(yuǎn)程處理數(shù)據(jù)。計算機的用途包括三個方面：①采集、處理和分析數(shù)據(jù)；②控制儀器；③色譜系統(tǒng)優(yōu)化和專家系統(tǒng)。6恒溫裝置

在HPLC儀中色譜柱及某些檢測器都要求能準(zhǔn)確地控制工作環(huán)境溫度，柱子的恒溫精度要求在±0.1~0.5℃之間，檢測器的恒溫要求則更高。

溫度對溶劑的溶解能力、色譜柱的性能、流動相的粘度都有影響。一般來說，溫度升高，可提高溶質(zhì)在流動相中的溶解度，從而降低其分配系數(shù)K，但對分離選擇性影響不大；還可使流動相的粘度降低，從而改善傳質(zhì)過程并降低柱壓。但溫度太高易使流動相產(chǎn)生氣泡。

色譜柱的不同工作溫度對保留時間、相對保留時間都有影響。在凝膠色譜中使用軟填料時溫度會引起填料結(jié)構(gòu)的變化，對分離有影響；但如使用硬質(zhì)填料則影響不大。

總的說來，在液固吸附色譜法和化學(xué)鍵合相色譜法中，溫度對分離的影響并不顯著，通常實驗在室溫下進行操作。在液固色譜中有時將極性物質(zhì)（如緩沖劑）加入流動相中以調(diào)節(jié)其分配系數(shù)，這時溫度對保留值的影響很大。

不同的檢測器對溫度的敏感度不一樣。紫外檢測器一般在溫度波動超過±0.5℃時，就會造成基線漂移起伏。示差折光檢測器的靈敏度和最小檢出量常取決于溫度控制精度，因此需控制在±0.001℃左右，微吸附熱檢測器也要求在±0.001℃以內(nèi)。7流動相7.1流動相的性質(zhì)要求

一個理想的液相色譜流動相溶劑應(yīng)具有低粘度、與檢測器兼容性好、易于得到純品和低毒性等特征。

選好填料（固定相）后，強溶劑使溶質(zhì)在填料表面的吸附減少，相應(yīng)的容量因子k降低；而較弱的溶劑使溶質(zhì)在填料表面吸附增加，相應(yīng)的容量因子k升高。因此，k值是流動相組成的函數(shù)。塔板數(shù)N一般與流動相的粘度成反比。所以選擇流動相時應(yīng)考慮以下幾個方面：①流動相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)。低交聯(lián)度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時遇到某些有機相會溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質(zhì)。堿性流動相不能用于硅膠柱系統(tǒng)。酸性流動相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)。

②純度。色譜柱的壽命與大量流動相通過有關(guān)，特別是當(dāng)溶劑所含雜質(zhì)在柱上積累時。

③必須與檢測器匹配。使用UV檢測器時，所用流動相在檢測波長下應(yīng)沒有吸收，或吸收很小。當(dāng)使用示差折光檢測器時，應(yīng)選擇折光系數(shù)與樣品差別較大的溶劑作流動相，以提高靈敏度。

④粘度要低（應(yīng)<2cp）。高粘度溶劑會影響溶質(zhì)的擴散、傳質(zhì)，降低柱效，還會使柱壓降增加，使分離時間延長。最好選擇沸點在100℃以下的流動相。

⑤對樣品的溶解度要適宜。如果溶解度欠佳，樣品會在柱頭沉淀，不但影響了純化分離，且會使柱子惡化。

⑥樣品易于回收。應(yīng)選用揮發(fā)性溶劑。7.2流動相的選擇

在化學(xué)鍵合相色譜法中，溶劑的洗脫能力直接與它的極性相關(guān)。在正相色譜中，溶劑的強度隨極性的增強而增加；在反相色譜中，溶劑的強度隨極性的增強而減弱。

正相色譜的流動相通常采用烷烴加適量極性調(diào)整劑。

反相色譜的流動相通常以水作基礎(chǔ)溶劑，再加入一定量的能與水互溶的極性調(diào)整劑，如甲醇、乙腈、四氫呋喃等。極性調(diào)整劑的性質(zhì)及其所占比例對溶質(zhì)的保留值和分離選擇性有顯著影響。一般情況下，甲醇-水系統(tǒng)已能滿足多數(shù)樣品的分離要求，且流動相粘度小、價格低，是反相色譜最常用的流動相。但Snyder則推薦采用乙腈-水系統(tǒng)做初始實驗，因為與甲醇相比，乙腈的溶劑強度較高且粘度較小，并可滿足在紫外185~205nm處檢測的要求，因此，綜合來看，乙腈-水系統(tǒng)要優(yōu)于甲醇-水系統(tǒng)。

在分離含極性差別較大的多組分樣品時，為了使各組分均有合適的k值并分離良好，也需采用梯度洗脫技術(shù)。

反相色譜中，如果要在相同的時間內(nèi)分離同一組樣品，甲醇/水作為沖洗劑時其沖洗強度配比與乙腈/水或四氫呋喃/水的沖洗強度配比有如下關(guān)系：

C乙腈＝0.32C2甲醇＋0.57C甲醇

C四氫呋喃＝0.66C甲醇

C為不同有機溶劑與水混合的體積百分含量。100%甲醇的沖洗強度相當(dāng)于89%的乙腈/水或66%的四氫呋喃/水的沖洗強度。7.3流動相的pH值

采用反相色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱堿（7≤pKa≤8）樣品時，通過調(diào)節(jié)流動相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，并改善峰形的技術(shù)稱為反相離子抑制技術(shù)。對于弱酸，流動相的pH值越小，組分的k值越大，當(dāng)pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于弱酸的pKa值時，弱酸主要以分子形式存在；對弱堿，情況相反。分析弱酸樣品時，通常在流動相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液；分析弱堿樣品時，通常在流動相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。

注：流動相中加入有機胺可以減弱堿性溶質(zhì)與殘余硅醇基的強相互作用，減輕或消除峰拖尾現(xiàn)象。所以在這種情況下有機胺（如三乙胺）又稱為減尾劑或除尾劑。7.4流動相的脫氣

HPLC所用流動相必須預(yù)先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會影響柱的分離效率，影響檢測器的靈敏度、基線穩(wěn)定性，甚至使無法檢測。（噪聲增大，基線不穩(wěn)，突然跳動）。此外，溶解在流動相中的氧還可能與樣品、流動相甚至固定相（如烷基胺）反應(yīng)。溶解氣體還會引起溶劑pH的變化，對分離或分析結(jié)果帶來誤差。

溶解氧能與某些溶劑（如甲醇、四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡(luò)合物，此絡(luò)合物會提高背景吸收（特別是在260nm以下），并導(dǎo)致檢測靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會在梯度淋洗時造成基線漂移或形成鬼峰（假峰）。在熒光檢測中，溶解氧在一定條件下還會引起淬滅現(xiàn)象，特別是對芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下，熒光響應(yīng)可降低達(dá)95%。在電化學(xué)檢測中（特別是還原電化學(xué)法），氧的影響更大。

除去流動相中的溶解氧將大大提高UV檢測器的性能，也將改善在一些熒光檢測應(yīng)用中的靈敏度。常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。對混合溶劑，若采用抽氣或煮沸法，則需要考慮低沸點溶劑揮發(fā)造成的組成變化。超聲脫氣比較好，10~20分鐘的超聲處理對許多有機溶劑或有機溶劑/水混合液的脫氣是足夠了（一般500ml溶液需超聲20~30min方可），此法不影響溶劑組成。超聲時應(yīng)注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內(nèi)液面不要高出水面太多。

離線（系統(tǒng)外）脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態(tài)，在你停止脫氣后，氣體立即開始回到溶劑中。在1~4小時內(nèi)，溶劑又將被環(huán)境氣體所飽和。

在線（系統(tǒng)內(nèi)）脫氣法無此缺點。最常用的在線脫氣法為鼓泡，即在色譜操作前和進行時，將惰性氣體噴入溶劑中。嚴(yán)格來說，此方法不能將溶劑脫氣，它只是用一種低溶解度的惰性氣體（通常是氦）將空氣替換出來。此外還有在線脫氣機。

一般說來有機溶劑中的氣體易脫除，而水溶液中的氣體較頑固。在溶液中吹氦是相當(dāng)有效的脫氣方法，這種連續(xù)脫氣法在電化學(xué)檢測時經(jīng)常使用。但氦氣昂貴，難于普及。7.5流動相的濾過

所有溶劑使用前都必須經(jīng)0.45µm（或0.22µm）濾過，以除去雜質(zhì)微粒，色譜純試劑也不例外（除非在標(biāo)簽上標(biāo)明"已濾過"）。

用濾膜過濾時，特別要注意分清有機相（脂溶性）濾膜和水相（水溶性）濾膜。有機相濾膜一般用于過濾有機溶劑，過濾水溶液時流速低或濾不動。水相濾膜只能用于過濾水溶液，嚴(yán)禁用于有機溶劑，否則濾膜會被溶解！溶有濾膜的溶劑不得用于HPLC。對于混合流動相，可在混合前分別濾過，如需混合后濾過，首選有機相濾膜。現(xiàn)在已有混合型濾膜出售。7.6流動相的貯存

流動相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內(nèi)，不能貯存在塑料容器中。因許多有機溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑，導(dǎo)致溶劑受污染。這種被污染的溶劑如用于HPLC系統(tǒng)，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴(yán)，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動相。

磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長霉，應(yīng)盡量新鮮配制使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內(nèi)冷藏，并在3天內(nèi)使用，用前應(yīng)重新濾過。容器應(yīng)定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質(zhì)沉淀和可能生長的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無此現(xiàn)象。7.7鹵代有機溶劑應(yīng)特別注意的問題

鹵代溶劑可能含有微量的酸性雜質(zhì)，能與HPLC系統(tǒng)中的不銹鋼反應(yīng)。鹵代溶劑與水的混合物比較容易分解，不能存放太久。鹵代溶劑（如CCl4、CHCl3等）與各種醚類（如乙醚、二異丙醚、四氫呋喃等）混合后，可能會反應(yīng)生成一些對不銹鋼有較大腐蝕性的產(chǎn)物，這種混合流動相應(yīng)盡量不采用，或新鮮配制。此外，鹵代溶劑（如CH2Cl2）與一些反應(yīng)性有機溶劑（如乙腈）混合靜置時，還會產(chǎn)生結(jié)晶。總之，鹵代溶劑最好新鮮配制使用。如果是和干燥的飽和烷烴混合，則不會產(chǎn)生類似問題。7.8HPLC用水

HPLC應(yīng)用中要求超純水，如檢測器基線的校正和反相柱的洗脫。

進行HPLC、GC、電泳和熒光分析，或在涉及組織培養(yǎng)時，沒有有機物污染是非常重要的。測高錳酸鉀顏色保留時間的定性方法反應(yīng)慢，對很低水平的有機物（對HPLC可能還是太高了）不夠靈敏，特別是不能定量?？傆袡C碳(TOC)分析儀（把有機物氧化成CO2，測游離的CO2）常用于I類（NCCLS）水中低濃度有機物的測定。I類水標(biāo)準(zhǔn)：

NCCLS

ASTM

電阻率，MΩ·cm，25℃，最小

10.0

18.0

硅酸鹽，mg/L，最大

0.05

0.003

微粒，µm濾器

0.22

0.2

微生物，CFU/ml

10

分三檔

美國藥典24版（2000年）要求TOC＜0.5mg/L（用標(biāo)準(zhǔn)蔗糖溶液1.19mg/L），電導(dǎo)率在室溫pH6時≤2.4µS/cm（即≥0.42MΩ·cm）。HPLC級水增加吸收特性：在1cm池中，用超純水作空白，在190nm、200nm和250~400nm的吸收度分別不得過0.01、0.01和0.05。增加不揮發(fā)物，≤3ppm（中國藥典純水≤10ppm）。8常見故障的分析與排除既使日常精心維護的液相色譜儀，隨著使用時間的增加或使用者經(jīng)驗不足也會出現(xiàn)一些問題或故障?，F(xiàn)將液相色譜儀容易出現(xiàn)的故障及解決辦法介紹如下8.1保留時間變化保留時間的變化有三中情況：波動、縮短、延長。保留時間出現(xiàn)波動時，應(yīng)檢查柱溫是否處于恒溫狀態(tài)，如果設(shè)置為室溫，氣溫的變化會引起保留時間的波動，應(yīng)該設(shè)置為恒定溫度；等度和梯度間還沒有充分達(dá)到平衡狀態(tài)時，應(yīng)該用十倍以上柱體積的流動相去平衡色譜柱；緩沖液濃度太低時，應(yīng)換用＞25mml/L的緩沖液；色譜柱被污染或已經(jīng)接近柱壽命時，應(yīng)更換保護柱或換新色譜柱。保留時間縮短時，流速增加，應(yīng)檢查流速的設(shè)定；柱溫高時，應(yīng)檢查柱的設(shè)置；進樣量太大時，減少樣品用量或降低樣品濃度；流動相的組成發(fā)生了改變，比如流動相中易揮發(fā)有機相蒸發(fā)，兩相之間互溶不好，會導(dǎo)致流動相不均勻或某一相出現(xiàn)部分沉淀；流動相的PH值應(yīng)保持3~7.5范圍內(nèi)，否則會引起柱鍵合相的流失。保留時間延長時，流速減小，應(yīng)檢查流速的設(shè)定和管路是否有泄露；柱溫低時，檢查柱溫的設(shè)置；流動相的組成發(fā)生了改變，比如流動相中易揮發(fā)有機相蒸發(fā)，兩相之間互溶不好，會導(dǎo)致流動相不均勻或某一相出現(xiàn)部分沉淀；檢查流動相的pH值是否3~7.5范圍內(nèi)，否則會引起柱鍵合相的流失。8.2峰拖尾色譜柱超載時，要減少進樣量或稀釋樣品或使用高溶量的色譜柱；色譜柱性能不佳時，更換色譜柱；死體積或柱外體積過大時，將連接降至最低，并對所有連接點作合理的調(diào)整，盡可能采用細(xì)內(nèi)徑的連接；加入硅羥基，其作用是純化色譜柱，增加緩沖液的濃度，降低流動相的pH值，純化樣品；出現(xiàn)峰干擾時，應(yīng)清潔樣品，調(diào)整流動相。8.3

峰展寬進樣體積過大時，用流動相配樣；樣品過載時，進小濃度、小體積樣品；在進樣閥中造成峰擴展時，進樣前后排出氣泡，以降低擴散；流動相粘度過高時，提高柱溫，并采用低粘度流動相；等度洗脫，保留時間過長時，要增加流速或改用梯度洗脫；柱外體積過大時，將連接管徑和連結(jié)管降至最小[1]。8.4基線噪聲流動相或檢測器中有氣泡時，要對流動相進行脫氣處理；檢測器燈有連續(xù)噪聲時，更換氘燈；出現(xiàn)由污染引起的隨機噪聲時，應(yīng)清洗色譜柱、凈化樣品、使用HIPLC級試劑；偶然有噪聲時，可能是來自電源的干擾，如果電壓不穩(wěn)時，應(yīng)采用穩(wěn)壓電源。8.5肩峰或分叉進樣量太大或樣品濃度過高時，要減少進樣量或稀釋樣品；樣品溶劑太強時，應(yīng)使用軟弱的樣品溶劑；色譜柱性能欠佳時，應(yīng)更換色譜柱。8.6

鬼峰色譜柱未達(dá)到平衡時，要繼續(xù)平衡色譜柱；樣品中溶劑出峰時，使用流動相作樣品的溶劑；出現(xiàn)進樣閥殘余峰時，使用強溶劑清洗進樣閥，并改進閥和樣品的清洗程序；流動相用水不合格率，應(yīng)使用HPLC級的水。9

使用注意事項在使用混合溶劑作流動相時，一定要先混合，再過0.45um濾膜；等流動相恢復(fù)至室溫，用超聲波或He氣進行脫氣處理后，方可使用。更換流動相時，必須按一定的程序進行，否則會產(chǎn)生問題。更換流動相有三種情況：互溶性流動相的更換、無互溶性流動相的更換和緩沖溶液的更換。對于第一種情況，先用準(zhǔn)備更換的流動相把吸濾器完全清洗干凈，再打開儀器的排液閥，按清洗鍵，清洗泵中的流動相。將吸濾器放入新流動腥中，減慢流速清洗數(shù)分鐘后關(guān)閉排液閥。接下來清洗色譜柱和檢測器檢測池直到基線平穩(wěn)。對于第二種情況，先用與新舊流動相都互溶的中間清洗液（如：異丙醇）清洗，再用新流動相清洗，具體過程與第一種情況相同。對于第三情況，應(yīng)先用蒸餾水作為中間清洗液進行清洗，再用新流動相清洗即可。10維護知識問答10.1為什么溶劑和樣品要過濾?

溶劑和樣品過濾非常重要，它會對色譜柱、儀器起到保護作用，消除由于污染對分析結(jié)果的影響。

色譜柱：由于填料顆粒很細(xì)，色譜柱內(nèi)腔很小，溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會使色譜柱和毛細(xì)管容易堵塞。

儀器：溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會增加進樣閥的堵塞和磨損，同時也會增加泵頭內(nèi)的藍(lán)寶石活塞桿和活塞的磨損。10.2為什么HPLC用緩沖鹽時要加在線Seal-wash選項？

HPLC用緩沖鹽時,由于泵頭內(nèi)的緩沖鹽溶液存在高壓析鹽現(xiàn)象,析出的細(xì)小鹽粒非常堅硬,它附著在藍(lán)寶石活塞桿上,隨著藍(lán)寶石活塞桿的往復(fù)運動,容易產(chǎn)生劃痕,并磨損密封墊,造成漏液等故障現(xiàn)象。在線Seal-wash選項能有效的帶走可能存在的緩沖鹽結(jié)晶。緩沖鹽的濃度在0.1mol或大于0.1mol時,必須使用該在線沖洗選項.

清洗液配制:

90%水+10%異丙醇.該混合液可抑制菌類生長和減小水的表面張力。以2-3滴/min的速度虹吸流下，不能干涸。10.3為什么流動相管路非常細(xì)?

在使用HPLC時,應(yīng)特別注意”柱外效應(yīng)”對分析結(jié)果的影響，由于樣品分子在液體流動相中的擴散系數(shù)比在氣體中小4~5個數(shù)量級，液體流動相的流速也比氣相慢1-2個數(shù)量級。因此，樣品進入色譜柱后，在柱子以外的任何死體積（進樣器、柱接頭、連接管、檢測器）中，樣品分子的擴散和滯留，都會引起色譜峰的展寬，而使柱效降低。為使柱外效應(yīng)減之最小，獲得理想的分析結(jié)果，

毛細(xì)管線分類：0.17mm內(nèi)徑

綠色

0.12mm內(nèi)徑紅色。

PEEK

管線：內(nèi)徑

0.13mm;0.18mm;0.25mm;0.5mm。10.4流動相使用前為什么要脫氣？