DB31∕T 1278-2021 實(shí)驗(yàn)裸鼴鼠 遺傳質(zhì)量控制

實(shí)驗(yàn)裸鼴鼠遺傳質(zhì)量控制Laboratorynakedmole-rat—Geneticqualityco2021-01-04發(fā)布2021-04-01實(shí)施I 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)和定義 14遺傳命名 1 15.1原則 1 1 26封閉群裸鼴鼠的遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè) 26.1封閉群裸鼴鼠的遺傳質(zhì)量 2 26.3檢測(cè)方法 26.4結(jié)果判定 26.5檢測(cè)頻率 2附錄A(規(guī)范性)封閉群裸鼴鼠的微衛(wèi)星DNA標(biāo)記檢測(cè)方法 3Ⅲ本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)提出并組織實(shí)施。本文件由上海市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本文件起草單位：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)提請(qǐng)注意，聲明符合本文件時(shí)，可能涉及附錄A的“封閉群棵鼴鼠的微衛(wèi)星本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)對(duì)于該專利的真實(shí)性、有效性和范圍無(wú)任何立場(chǎng)。該專利持有人已向本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)承諾，他愿意同任何申請(qǐng)人在合理且無(wú)歧視的條款和條件下，就專利授權(quán)許可進(jìn)行談判，該專利持有人的聲明已在本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)備案。相關(guān)信息可以通過(guò)以下聯(lián)系方法獲得：地址：上海市楊浦區(qū)翔殷路800號(hào)請(qǐng)注意除上述專利外，本文件的某些內(nèi)容仍可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。1本文件規(guī)定了實(shí)驗(yàn)裸鼴鼠(簡(jiǎn)稱：裸鼴鼠)的遺傳命名、繁殖和封閉群裸鼴鼠的遺傳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及檢測(cè)方法的要求。本文件適用于實(shí)驗(yàn)裸鼴鼠的遺傳質(zhì)量控制。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB14923實(shí)驗(yàn)動(dòng)物哺乳類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳質(zhì)量控制3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。實(shí)驗(yàn)裸鼴鼠laboratorynakedmole-rat裸鼴鼠學(xué)、生產(chǎn)和檢定以及其他科學(xué)實(shí)驗(yàn)的裸鼴鼠。封閉群裸鼴鼠closedcolony以非近親交配方式進(jìn)行繁殖生產(chǎn)的裸鼴鼠種群，在不從外部引入新個(gè)體的條件下，至少連續(xù)繁殖4代以上。4遺傳命名封閉群的命名按照GB14923執(zhí)行。保持封閉群裸鼴鼠的遺傳概貌及生理特性，避免近交繁殖。5.2.1封閉群裸鼴鼠種子應(yīng)遺傳背景明確，來(lái)源清楚，有完整的資料(包括種群名稱、來(lái)源、遺傳基因特點(diǎn)及主要生物學(xué)特性等)。2封閉群應(yīng)足夠大，采用循環(huán)交配方式，引種數(shù)量不應(yīng)少于25對(duì)無(wú)血緣關(guān)系(三代以內(nèi)無(wú)共同祖先)的雌雄裸鼴鼠。以保持封閉群裸鼴鼠的遺傳基因的穩(wěn)定，并盡量避免近親交配。具體繁殖方法按照主要生物學(xué)特性等);群體數(shù)量/只不少于16只不少于30只采用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記檢測(cè)方法。具體方法執(zhí)行群體內(nèi)遺傳變異采用平均雜合度指標(biāo)或群體平衡狀態(tài)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。當(dāng)平均雜合度在0.5～0.7,且期望雜合度與觀測(cè)雜合度經(jīng)卡方檢驗(yàn)無(wú)明顯差異時(shí)，群體為裸鼴鼠封閉群。代溫伯格指數(shù)(Hardy-Weinberg,HWE)X2的P值進(jìn)行判斷，若P值均大于0.05,判定為裸鼴鼠封閉群。若有任何一個(gè)位點(diǎn)的P值小于或等于0.05,則不能判定為裸鼴鼠封閉群。封閉群裸鼴鼠生產(chǎn)群12個(gè)月至少進(jìn)行一次遺傳質(zhì)量檢測(cè)。3(規(guī)范性)封閉群裸鼴鼠的微衛(wèi)星DNA標(biāo)記檢測(cè)方法采集封閉群裸鼴鼠的血液或組織，提取基因組DNA。對(duì)特定的微衛(wèi)星標(biāo)記座位進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)遺傳分析儀檢測(cè)各座位基因的峰形和大小，確定各微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳概貌A.2儀器設(shè)備應(yīng)用到的儀器設(shè)備包括但不限于：a)常壓電泳儀；b)4℃冰箱、-20℃冰箱；c)低溫高速離心機(jī)；d)水浴鍋；e)分析天平；g)紫外分光光度儀；i)毛細(xì)管電泳儀(STR)。A.3檢測(cè)方法采集約0.1g組織或0.5mL血液，放入75%乙醇保存。A.3.2基因組DNA的提取用酚-氯仿萃取法或試劑盒提取基因組DNA。A.3.3微衛(wèi)星位點(diǎn)采用25個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)檢測(cè)封閉群裸鼴鼠的遺傳概貌。各微衛(wèi)星位點(diǎn)的名稱、引物序列、等位基因數(shù)、鎂離子濃度及等位基因分布范圍見表A.1。編號(hào)引物(5'-3')Mg2+濃度核心序列范圍424344表A.1微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物序列、最佳退火溫度、鎂離子濃度及等位基因數(shù)分布范圍(續(xù))引物(5'-3')Mg2+濃度核心序列范圍5242446262623242426252424242628262528252A.3.4.1PCR擴(kuò)增的體系A(chǔ).3.4.1.1PCR總反應(yīng)體積為30μL,其中含10×PCR緩沖液3μL,各組分的終濃度為0.05UTaq(30ng~60ng),純水補(bǔ)齊反應(yīng)體積。A.3.4.1.2PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性，3min;94℃變性，30s;退火溫度(各位點(diǎn)退火溫度參見表A.1),30s;72℃延伸，30s;30個(gè)循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸5min;擴(kuò)增產(chǎn)物4℃保存。A.3.4.2PCR產(chǎn)物的檢測(cè)PCR產(chǎn)物，經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳以及凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。A.3.4.3擴(kuò)增產(chǎn)物的STR掃描擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)確保擴(kuò)增出目的片段后，選擇分別以FAM、HEX標(biāo)記的兩個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物，以1:1.5體積比混合，取1μL上樣進(jìn)行STR掃描。A.3.5STR掃描結(jié)果的判讀與統(tǒng)計(jì)分析A.3.5.1STR掃描結(jié)果的判讀A.3.5.1.1掃描結(jié)果出現(xiàn)兩種波形：一種為純合基因型，只有一個(gè)主波；另一種為雜合基因波。同時(shí)，根據(jù)軟件讀出波峰處的擴(kuò)增產(chǎn)物的bp數(shù)。A.3.5.1.2由基因分型軟件讀出每個(gè)樣本在每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的擴(kuò)增片段大小。每個(gè)位點(diǎn)的等位基因根據(jù)擴(kuò)增片段從小到大順序排列記錄為a,b,c,d…等。A.3.5.2運(yùn)用群體遺傳分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析將所有樣本的每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因型以ab,bb等形式輸入群體遺傳分析軟件的數(shù)據(jù)文件，計(jì)算樣品在各微衛(wèi)星位點(diǎn)上的基因頻率、平均觀察等位基因數(shù)、平均有效等位基因數(shù)(Ne)、香隆指數(shù)、平均雜合度(H)等。平均雜合度在0.5～0.7,且期望雜合度與觀測(cè)雜合度經(jīng)卡方檢驗(yàn)無(wú)明顯差異時(shí)，判定為裸鼴鼠封閉群?；蛘撸紫鹊玫礁鱾€(gè)位點(diǎn)上各基因頻率、基因型