T-ZNZ 291-2024 飼料中多種抗球蟲類藥物的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

CCSB46T/ZNZ浙江省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全學會發(fā)布IT/ZNZ291—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由浙江省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全學會提出并歸口。本文件起草單位：綠城農(nóng)科檢測技術(shù)有限公司。本文件主要起草人：余鵬飛、董葉箐、傅詩敏、沈雄雅、陳蓉、何譽、倪娟楨、林婷、孫文閃、何曉明、徐偉榮。1T/ZNZ291—2024飼料中多種抗球蟲類藥物的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法本文件規(guī)定了飼料中16種抗球蟲類藥物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。本文件適用于配合飼料、濃縮飼料、精料補充料和預(yù)混合飼料等4類飼料中氨丙啉、常山酮、地克珠利、二硝托胺、癸氧喹酯、甲芐喹啉、甲基鹽霉素、克拉珠利、氯苯胍、氯羥吡啶、拉沙洛西、馬度米星銨、莫能菌素、尼卡巴嗪標志物、鹽霉素、乙氧酰胺苯甲酯的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T14699.1飼料采樣GB/T20195動物飼料試樣的制備3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4原理試樣中抗球蟲類藥物經(jīng)乙腈水溶液提取，用通過型親水親脂平衡型固相萃取柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定性定量測定，基質(zhì)外標法定量。5試劑和材料除另有規(guī)定外，所有試劑均為色譜純，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。5.1試劑和材料5.1.1乙腈（CH3CN）。5.1.2甲醇（CH3OH）。5.1.3N,N-二甲基甲酰胺。5.1.4乙酸銨（HCOONH4）。5.2試劑配制5.2.180%乙腈水溶液：取乙腈800mL、水200mL，混勻。2T/ZNZ291—20245.2.20.005mol/L乙酸銨水溶液：取乙酸銨0.385g，用水溶解并稀釋至1000mL。5.3標準品氨丙啉、常山酮、地克珠利、二硝托胺、癸氧喹酯、甲芐喹啉、甲基鹽霉素、克拉珠利、氯苯胍、氯羥吡啶、拉沙洛西、馬度米星銨、莫能菌素、尼卡巴嗪標志物、鹽霉素、乙氧酰胺苯甲酯含量≥95.0%，或均應(yīng)為有證標準物質(zhì)，具體見附錄A。5.4標準溶液配制5.4.1標準儲備溶液（1000mg/L）：分別準確稱取適量16種抗球蟲類藥物標準品（相當于有效成分10mg，精確至0.01mg），用N,N-二甲基甲酰胺3mL溶解后，再用甲醇定容至10mL，此溶液濃度均為1000mg/L。-18℃避光密封保存，有效期6個月。5.4.2混合標準工作液：準確量取標準儲備液（5.4.1）氨丙啉、癸氧喹酯、甲卞喹啉各0.1mL，常山酮、甲基鹽霉素、拉沙洛西、氯苯胍、馬度米星銨、莫能菌素、鹽霉素、地克珠利、尼卡巴嗪標志物各0.5mL，氯羥吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、克拉珠利、二硝托胺各2mL于100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成混合標準工作液。其中氨丙啉、癸氧喹酯、甲卞喹啉濃度為1mg/L，常山酮、甲基鹽霉素、拉沙洛西、氯苯胍、馬度米星銨、莫能菌素、鹽霉素、地克珠利、尼卡巴嗪標志物濃度為5mg/L，氯羥吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、克拉珠利、二硝托胺濃度為20mg/L。-18℃避光密封保存，有效期1個月。5.5材料5.5.1通過型親水親脂平衡型固相萃取柱：200mg，6mL。5.5.2聚四氟乙烯微孔濾膜：0.22μm。6儀器和設(shè)備6.1液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源（ESI）。6.2分析天平：感量0.01mg和1mg。6.3離心機：≥4000r/min。6.4渦旋振蕩器。6.5超聲波清洗器。6.6固相萃取裝置。7試樣的制備與保存7.1試樣的制備按GB/T14699.1的規(guī)定抽取有代表性的飼料樣品，用四分法縮減取樣，按照GB/T20195制備試樣，粉碎后過0.45mm孔徑的分析篩，混勻，裝入磨口瓶中，備用。a)取粉碎過篩后的供試樣品，作為供試試料。b)取粉碎過篩后的空白樣品，作為空白試料。c)取粉碎過篩后的空白樣品，添加適宜濃度的混合標準工作液,作為空白添加試料。3T/ZNZ291—20247.2試樣的保存將樣品置于陰涼、避光處保存。8測定步驟8.1提取稱取2g（精確至0.001g）試樣于50mL離心管中，準確加入10mL80%乙腈水溶液（5.2.1）渦旋混勻5min后，超聲提取20min，4000r/min離心5min，取上清液于50mL離心管中；殘渣用10mL80%乙腈水溶液（5.2.1）重復(fù)提取一次，合并上清液，備用。8.2凈化移取1mL備用液過固相萃取柱，棄去，再移取2mL備用液過柱，收集濾液，過濾膜，供液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。8.3基質(zhì)匹配標準曲線的制備取6份空白樣品經(jīng)提取和凈化后，加入適量的混合標準工作液（5.4.2）配制成氨丙啉、甲卞喹啉、癸氧喹酯濃度為0.0005mg/L、0.001mg/L、0.005mg/L、0.01mg/L、0.02mg/L、0.05mg/L；常山酮、甲基鹽霉素、拉沙洛西、氯苯胍、馬度米星銨、莫能菌素、鹽霉素、地克珠利、尼卡巴嗪標志物濃度為0.0025mg/L、0.005mg/L、0.025mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.25mg/L；氯羥吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、克拉珠利、二硝托胺濃度為0.01mg/L、0.02mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、1mg/L的基質(zhì)匹配標準溶液，供液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜測定。以測得特征離子峰面積為縱坐標，對應(yīng)的標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。8.4測定8.4.1液相色譜參考條件液相色譜參考條件如下：a)色譜柱：T3柱（50mm×2.1mm，1.8μm），或相當者。b)流動相：A為0.005mol/L乙酸銨水溶液（5.2.2），B為甲醇。c)梯度洗脫：洗脫程序見表1。d)流速：0.35mL/min。e)柱溫：40℃。f)進樣量：2μL。表1梯度洗脫程序時間，min09550.59552.55955.55955.519558.59554T/ZNZ291—20248.4.2質(zhì)譜參考條件質(zhì)譜參考條件如下：a)離子源：電噴霧（ESI）離子源。b)掃描方式：正/負離子掃描。c)檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測。d)接口溫度：350℃。e)脫溶劑溫度：602℃。f)加熱塊溫度：400℃。g)霧化氣流量：3L/min。h)加熱氣流量：10L/min。i)干燥氣流量：10L/min。j)其他質(zhì)譜參數(shù)參考值見表A.2。8.4.3定性測定在同樣測試條件下，試樣中待測藥物的保留時間與基質(zhì)匹配標準工作液中待測藥物的保留時間之比，偏差在±2.5%以內(nèi)，且檢測到的相對離子豐度，應(yīng)當與濃度相當?shù)幕|(zhì)匹配標準溶液相對離子豐度一致。其允許偏差應(yīng)符合表3的要求。表3定性確證時相對離子豐度的允許偏差>50>20-50>10-208.4.4定量測定取試樣溶液和基質(zhì)匹配標準工作液，作單點或多點校準，按外標法定量，基質(zhì)匹配標準工作液及試料溶液中目標物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍內(nèi)，如超過線性范圍，應(yīng)重新實驗或?qū)⒃嚇尤芤汉突|(zhì)匹配標準溶液作相應(yīng)稀釋f倍后重新測定。單點校準定量時，試樣溶液中待測物的濃度與標準溶液濃度相差不超過30%。在上述色譜質(zhì)譜條件下標準溶液特征離子質(zhì)量色譜圖見附錄B。8.4.5空白試驗取空白試樣，采用完全相同的測定步驟進行平行操作。9結(jié)果計算和表述試樣中抗球蟲藥物的量標準曲線校準按（1）計算或單點校準按（2）計算，結(jié)果保留3位有效數(shù)字。式中：X——試樣中被測物質(zhì)的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；C——由標準曲線得到的試樣溶液中相對應(yīng)被測物質(zhì)濃度，單位為毫克每升（mg/LV——提取液體積的數(shù)值，單位為毫升（mL）；m——試料質(zhì)量的數(shù)值，單位為克（g1000——換算系數(shù)；f——上機測定的試樣溶液濃度超出線性范圍后，進一步稀釋的倍數(shù)。5T/ZNZ291—2024式中：X——試樣中被測物質(zhì)的含量，單位為毫克每千克（mg/kgA——試樣中被測物質(zhì)的峰面積；Cs——基質(zhì)匹配標準溶液中被測物質(zhì)濃度的數(shù)值，單位為毫克每升（mg/LV——提取液體積的數(shù)值，單位為毫升（mL）；As——基質(zhì)匹配標準溶液中被測物質(zhì)的峰面積；m——試料質(zhì)量的數(shù)值，單位為克（g1000——換算系數(shù)；f——上機測定的試樣溶液濃度超出校準點30%，進一步稀釋的倍數(shù)。10方法靈敏度、準確度和精密度10.1靈敏度本方法氨丙啉、甲卞喹啉、癸氧喹酯的定量限為0.01mg/kg；常山酮、甲基鹽霉素、拉沙洛西、氯苯胍、馬度米星銨、莫能菌素、鹽霉素、地克珠利、尼卡巴嗪標志物定量限為0.05mg/kg；氯羥吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、克拉珠利、二硝托胺的定量限為0.2mg/kg。10.2準確度本方法氨丙啉、甲卞喹啉、癸氧喹酯在0.01mg/kg~0.25mg/kg，常山酮、甲基鹽霉素、拉沙洛西、氯苯胍、馬度米星銨、莫能菌素、鹽霉素、地克珠利、尼卡巴嗪標志物在0.05mg/kg~1.25mg/kg，氯羥吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、克拉珠利、二硝托胺在0.2mg/kg~5mg/kg添加濃度水平上的回收率為70%~120%。10.3精密度本方法批內(nèi)相對標準偏差≤15%，批間相對偏差≤15%。6T/ZNZ291—2024（資料性）16種抗球蟲藥物的中英文名稱、CAS號、分子式、相對分子量及定性、定量和質(zhì)譜分析參數(shù)16種抗球蟲藥物的中英文名稱、CAS號、分子式、相對分子量見表A.1。表A.116種抗球蟲藥物的中英文名稱、CAS號、分子式、相對分子量1C14H19ClN42C16H17BrClN3O33C17H9Cl3N4O24C8H7N3O55C24H35NO56NequinateC22H23NO47NarasinC43H72O118C17H10Cl2N4O29C15H13Cl2N5·HClC7H7Cl2NOC34H53NaO8C47H83NO17C36H61O11·Na尼卡巴嗪標志物（4,4'-二C13H10N4O5C42H69NaO11C12H15NO47T/ZNZ291—202416種抗球蟲藥物的定性、定量和質(zhì)譜分析參數(shù)見表A.2