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文檔簡介
電子顯微鏡樣品制備與觀察河北大學生命科學學院主要內容樣品的取材與固定樣品的滲透與包埋修快與支持膜的制備玻璃刀的制作與超薄切片電子染色電子顯微鏡的使用與生物樣品超微結構觀察一、樣品的取材與固定(一)實驗目的1掌握電鏡樣品取材的方法與要求2掌握電鏡樣品的固定方法與要求(二)實驗原理(見原理部分)(三)實驗材料小白鼠肝臟(等)(四)實驗方法1動物麻醉將小白鼠放入燒杯,放入一蘸有氯仿的脫脂棉球,用培養(yǎng)皿蓋住燒杯口,約3~5min后小白鼠被麻醉;2解剖分割迅速解剖,取出肝臟,在硬紙上用新單面刀片分割成0.5*0.5*0.5mm3
小塊,迅速投入準備號的固定液;3前固定2.5%戊二醛0~4℃固定1~2h(固定液需提前準備號);4漂洗0.1M磷酸緩沖液漂洗3次,每次5~10min,0~4℃;5后固定1%鋨酸固定1~2h,0~4℃;6漂洗0.1M磷酸緩沖液漂洗3次,每次5~10min,0~4℃;7脫水30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇,0~4℃,每步5~10min;8保存70%乙醇0~4℃保存。(五)實驗要求1用具干燥;2取材快、準、小、輕;3鋨酸有毒,需在通風廚中進行,含鋨酸的廢液放入指定容器;4每人固定2~3塊樣品;5在固定的過程中要不斷震動樣品管。二、樣品的滲透與包埋(一)實驗目的掌握超薄切片樣品滲透與包埋的方法(二)實驗原理見理論部分(三)實驗材料上次保存的材料(四)實驗方法1脫水85%乙醇→95%乙醇→100%乙醇→100%乙醇,每步5~10min;2置換丙酮→丙酮,每步5~10min
;3滲透1/2丙酮+1/2環(huán)氧樹脂1~4h;4包埋先將包埋模塊加滿環(huán)氧樹脂,再將滲透過的材料用牙簽挑到包埋模塊尖端部分,并在其中滲透3~4h;5聚合加熱37℃→45℃→60℃,各12h。(五)實驗要求1所用器具、工具保持清潔干燥;2手上若沾有環(huán)氧樹脂,用丙酮棉球擦去;每人包埋2~3個樣品塊。三、修快與支持膜的制備(一)實驗目的1掌握超薄切片包埋塊修快的方法;2掌握支持膜制備的方法。(二)實驗原理見理論部分(三)實驗材料上次實驗包埋的材料(四)實驗方法1修快(1)用樣品夾頭夾住環(huán)氧樹脂包埋塊的2/3左右,夾緊,或用手拿住樣品塊;(2)用小鋼銼或單面刀片修快使達到下面要求:切面光滑平整,盡可能是要觀察的材料,切面大小0.5*0.5mm2;3~4個斜面的坡度以45度為宜。2支持膜的制備(1)將玻璃條、250ml燒杯洗凈,玻璃條先用紗布擦干,然后再用綢布用力反復擦凈,250ml燒杯裝滿蒸餾水;(2)將玻璃條放入0.2~0.3%聚乙烯醇縮甲醛的氯仿溶液中2~4cm深,停留3~5s后提出,在空氣中自然干燥;(3)在玻璃條四周用單面刀片將膜輕輕劃開,然后以與水面30度角緩慢插入放在日光燈正下方的250ml燒杯的蒸餾水中,同時用眼觀察(使眼正好能看到水面反射的日光燈的光線),使膜完全脫離玻璃條而漂浮在水面上,膜應為均勻的灰色(約15nm);(4)將2~4片載網放在膜上,再用鑷子輕壓1~2下,使載網與膜緊貼;(5)再用比膜稍大的濾紙放在膜的上方,輕壓下濾紙一角,在濾紙剛好全部濕潤之際將濾紙?zhí)崞穑d網與膜亦貼在濾紙上;(6)將膜向上保存于培養(yǎng)皿中備用。(五)實驗要求1制膜所用的器具、蒸餾水、紗布、綢布必須干凈,用后洗凈,制膜過程要防塵;2每人修快2塊,制膜2張,將修好的樣品塊用紙包好寫上組號姓名;3預習下次實驗。四、玻璃刀的制作與超薄切片(一)玻璃刀的制作(二)超薄切片五、電子染色1蠟盤的制作在培養(yǎng)皿中注入融化的石蠟,讓其逐漸凝固;2滴加染液3鈾染4水洗5鉛染6水洗7干燥六、電子顯微鏡的使用與樣品超微結構觀察(一)JEM-100SX透射電子顯微鏡的使用1啟動:閉合電子顯微鏡穩(wěn)壓電源開關與冷卻循環(huán)水穩(wěn)壓電源開光,壓下啟動按鈕。約30分鐘后儀器進入可工作狀態(tài)。2放入樣品:按程序放入樣品。3加高壓:有下列幾檔可選40KV、60KV、80KV、100KV,若需高壓應先加低壓。選擇加速電壓原則:電壓越高,分辨率越高,反差越?。环粗?,電壓越低分辨率越低,反差越大。4加燈絲電源:順時針旋轉至限位處(加燈絲電源必須有高壓存在),此時應看到圖象,若不能看到圖象,請與專職人員聯(lián)系,切勿隨意調整各旋鈕。5觀察:調整放大倍數(shù)、亮度、樣品XY平移、焦距進行觀察。6照相:將要照相部位移至視野中心標記方框內,過卷,調整焦距、亮度至自動曝光兩個綠燈同時亮,抬起熒光屏進行曝光。7關機:將放大倍數(shù)調至1000X,調整亮度正好充滿熒光屏,取出樣品,燈絲旋鈕調至最低,高壓調至OFF,壓下關閉按鈕,約5分鐘后儀器關閉,切斷兩個穩(wěn)壓電源開關。8記錄:包括使用起至時間、觀察內容、使用人及所屬單位及導師,儀器工作情況。(二)樣品超微結構的觀察9、春去春又回,新桃換舊符。在那桃花盛開的地方,在這醉人芬芳的季節(jié),愿你生活像春天一樣陽光,心情像桃花一樣美麗,日子像桃子一樣甜蜜。2月-252月-25Sunday,February23,202510、人的志向通常和他們的能力成正比例。21:14:0721:14:0721:142/23/20259:14:07PM11、夫學須志也,才須學也,非學無以廣才,非志無以成學。2月-2521:14:0721:14Feb-2523-Feb-2512、越是無能的人,越喜歡挑剔別人的錯兒。21:14:0721:14:0721:14Sunday,February23,202513、志不立,天下無可成之事。2月-252月-2521:14:0721:14:07February23,202514、ThankyouverymuchfortakingmewithyouonthatsplendidoutingtoLondon.ItwasthefirsttimethatIhadseentheToweroranyoftheotherfamoussights.IfI'dgonealone,Icouldn'thaveseennearlyasmuch,becauseIwouldn'thaveknownmywayabout.。23二月20259:14:07下午21:14:072月-2515、會當凌絕頂,一覽眾山小。二月259:14下午2月-2521:14February23,202516、如果一個人不知道他
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