醫(yī)學(xué)資料 DNA基因測序

毛細(xì)管凝膠電泳與DNA基因測序

趙志峰DNA是主要的遺傳物質(zhì)資料1：20世紀(jì)30年代，科學(xué)家認(rèn)識到：組成DNA分子的基本單位是

。脫氧核苷酸1分子磷酸1分子脫氧核糖1分子含氮堿基高中知識回顧1分子脫氧核苷酸=

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.【模型建構(gòu)1】:脫氧核苷酸堿基AGCT磷酸脫氧核糖ACT腺嘌呤脫氧核苷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸胞嘧啶脫氧核苷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸G脫氧核苷酸的種類1、DNA分子結(jié)構(gòu)主要特點DNA分子是有

條鏈組成，

盤旋成

結(jié)構(gòu)。

交替連接，排列在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架；

排列在內(nèi)側(cè)。堿基通過

連接成堿基對，并遵循

原則。反向平行雙螺旋脫氧核糖和磷酸堿基對氫鍵堿基互補配對2AP脫氧核糖GP脫氧核糖CP脫氧核糖TP脫氧核糖脫氧核糖APGPCPTP脫氧核糖脫氧核糖脫氧核糖DNA分子的復(fù)制1.條件：

(1)模板：解旋的DNA兩條單鏈

(2)原料：脫氧核苷酸

(3)能量：ATP

(4)酶：解旋酶、DNA聚合酶2.特點:

(1)邊解旋邊復(fù)制

(2)半保留復(fù)制3.“準(zhǔn)確”復(fù)制的原理：

（1）DNA分子獨特的雙螺旋結(jié)構(gòu)，為復(fù)制提供了精確的模板；

（2）堿基互補配對原則，保證了復(fù)制能夠準(zhǔn)確地進行。

元素周期表的發(fā)現(xiàn)奠定了二十世紀(jì)物理、化學(xué)研究和發(fā)展的基礎(chǔ)元素周期表“基因組序列圖”將奠定二十一世紀(jì)生命科學(xué)研究和生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)！

“基因組”----生命科學(xué)的“元素周期表”人體解剖圖奠定了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)生命的奧秘蘊藏于“四字天書”之中…GCTTCTTCCTCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCATCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCTTCTTCCTCATTTTCTCTCCACCATGCCGCCACCACGCCACCATGCTTCTTCCTCATCTCGCTTTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCGCTTCTTCCtTCTCT…DNA測序的基本原理一、脫氧鏈終止法測序

基本原理：

利用DNA聚合酶，以待測單鏈DNA為模板，以dNTP為底物，設(shè)立四種相互獨立的測序反應(yīng)體系，在每個反應(yīng)體系中加入不同的雙脫氧核苷三磷（dideoxyribonucleosidetriphosphate，ddNTP）作為鏈延伸終止劑。在測序引物引導(dǎo)下，按照堿基配對原則，每個反應(yīng)體系中合成一系列長短不一的引物延伸鏈，通過高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影檢測后，從凝膠底部到頂部按5′→3′方向讀出新合成鏈序列，由此推知待測模板鏈的序列。用于終止反應(yīng)的雙脫氧核苷酸：將2’，3’–雙脫氧核苷酸（ddNTP）參入到新合成的DNA鏈中，由于參入的ddNTP缺乏3’–羥基，因此不能與下一位核苷酸反應(yīng)形成磷酸二酯鍵，DNA合成反應(yīng)將中止。O堿基CPOH12345O堿基CPHH12345H2O脫氧核苷酸的連接O堿基CPHH12345O堿基CPOHH12345OHX雙脫氧核苷酸…?

在4組相互獨立的測序反應(yīng)體系中，分別加入四種不同ddNTP，其余成分相同。調(diào)整每個測序反應(yīng)中dNTP與ddNTP的比例，使引物的延伸在對應(yīng)于待測模板DNA每個可能摻入的位置都有可能發(fā)生終止。電泳電泳:帶電顆粒在電場的作用下，向著與其電性相反的電極移動，稱為電泳正極負(fù)極帶負(fù)電粒子帶正電粒子凝膠電泳定義：凝膠電泳利用凝膠的分子篩作用使分子大小不同的電解質(zhì)得到分離：相對分子質(zhì)量大的溶質(zhì)受凝膠阻滯作用大，泳動速度較慢，小分子溶質(zhì)泳動速度較快。經(jīng)過一段時間的電泳后，根據(jù)溶質(zhì)相對分子質(zhì)量的不同，凝膠中形成數(shù)條含有不同溶質(zhì)的區(qū)帶，實現(xiàn)溶質(zhì)之間的相互分離。毛細(xì)管凝膠電泳將聚丙烯酰胺等在毛細(xì)管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分?jǐn)U散，所得峰型尖銳，分離效率高。蛋白質(zhì)、DNA等的電荷/質(zhì)量比與分子大小無關(guān)，CZE模式很難分離，采用CGE能獲得良好分離，DAN排序的重要手段。特點：抗對流性好，散熱性好，分離度極高。無膠篩分技術(shù)：采用低粘度的線性聚合物溶液代替高粘度交聯(lián)聚丙烯酰胺。柱便宜、易制備。毛細(xì)管

1裝置

毛細(xì)管數(shù)據(jù)處理電極檢測器電極試樣緩沖液高壓電源

（可高至30KV）

（二）新生鏈的熒光標(biāo)記原理多色熒光標(biāo)記法--熒光標(biāo)記終止底物法定義：將熒光染料標(biāo)記在作為終止底物的雙脫氧單核苷酸上反應(yīng)中將4種ddNTP分別用4種不同的熒光染料標(biāo)記，帶有熒光基團的ddNTP在摻入DNA片段導(dǎo)致鏈延伸終止的同時，也使該片段端標(biāo)上了一種特定的熒光染料經(jīng)電泳后將各個熒光譜帶分開，根據(jù)熒光顏色的不同來判斷所代表的不同堿基信息

（二）新生鏈的熒光標(biāo)記原理熒光標(biāo)記引物法熒光標(biāo)記引物法原理（二）新生鏈的熒光標(biāo)記原理模板：TCCATGAT產(chǎn)物：AAGAGGAGGTAGGTAAGGTACAGGTACTAGCTGGTTAAC

染料受測序儀氬離子激光激發(fā)而發(fā)射出特定光譜的四種不同顏色的熒光，同時，測序儀的專用激光掃描鏡頭實時掃描不同大小的DNA片段在相應(yīng)時間通過垂直電泳膠讀數(shù)區(qū)時發(fā)射的熒光，將不同大小DNA片段發(fā)射的熒光實時地傳遞給計算機測序數(shù)據(jù)實時收集軟件，將電泳結(jié)果轉(zhuǎn)換成膠圖文件及原始數(shù)據(jù)信號。當(dāng)電泳完畢后，DNA序列分析軟件通過分析膠圖文件及原始數(shù)據(jù)信號，得到最終的測序結(jié)果。儀器的組成--PE310基因分析儀PE310基因分析儀的結(jié)構(gòu)凝膠塊區(qū)

自動進樣器區(qū)

檢測區(qū)

儀器的組成--PE310基因分析儀PE310基因分析儀的主機分區(qū)熱板毛細(xì)管雷射檢測器注射器驅(qū)動桿毛細(xì)管和電極注射器正極緩沖液泵塊自動進樣器負(fù)極緩沖液PE310基因分析儀的基本結(jié)構(gòu)DNA的檢測原理測序反應(yīng)一般以單引物進行DNA聚合酶延伸反應(yīng)，絕大多數(shù)產(chǎn)物均為單鏈反應(yīng)結(jié)束后，樣品經(jīng)簡單純化處理就可以放置到自動測序儀中開始電泳兩極間極高的電勢差推動著各個熒光DNA片段在凝膠高分子聚合物中從負(fù)極向正級泳動并達(dá)到相互分離，且依次通過檢測窗口由激光器發(fā)出的極細(xì)光束，通過精密的光學(xué)系統(tǒng)被導(dǎo)向檢測區(qū)，在這里激光束以與凝膠垂直的角度激發(fā)熒光DNA片段

DNA的檢測原理DNA片段上的熒光發(fā)色基團吸收了激光束提供的能量而發(fā)射出特征波長的熒光代表不同堿基信息的不同顏色熒光經(jīng)過光柵分光后再投射到CCD攝像機上同步成像。收集的熒光信號再傳輸給計算機加以處理整個電泳過程結(jié)束時在檢測區(qū)