（高清版）DB37∕T 3113-2018 豬圓環(huán)病毒2型抗體膠體金快速檢測技術(shù)規(guī)范

ICS65.020.30DB37DB37/T3113—2018豬圓環(huán)病毒2型抗體膠體金快速檢測技術(shù)規(guī)范2018-02-02發(fā)布2018-03-02實施山東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB37/T3113—2018本標準按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標準由山東省畜牧獸醫(yī)局提出。本標準由山東省畜牧業(yè)標準化技術(shù)委員會歸口。本標準起草單位：山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所。本標準起草人：李俊、時建立、彭喆、吳曉燕、徐紹建、于江、孫文博、叢曉燕、朱曉琳、韓紅、吳家強、杜以軍、陳蕾、陳智、劉暢。1豬圓環(huán)病毒2型抗體膠體金快速檢測技術(shù)規(guī)范本標準規(guī)定了豬圓環(huán)病毒2型(PorcineCircovirusType2,PCV2)的抗體膠體金試紙條制備方法及試紙條使用規(guī)范。本標準適用于豬圓環(huán)病毒2型的抗體快速檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術(shù)語與定義下列術(shù)語與定義適用于本標準。3.1聚氯乙烯板。3.2牛血清白蛋白。3.3硝酸纖維素膜。磷酸緩沖鹽溶液。4材料及設(shè)備4.1主要儀器設(shè)備4.1.1微量移液器(最大量程分別為10μL、20μL、100μL、1000μL)。4.1.220000r/min低溫高速離心機。24.1.60.22μm無菌過濾器。4.1.8電子天平精度為：0.001g。4.2.1BSA:配制見附錄A.1。4.2.2氯金酸：配制見附錄A.2。4.2.3NC膜。4.2.4玻璃纖維膜。4.2.5吸水紙。4.2.6碳酸鉀分析純。4.2.7豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白。4.2.8羊抗兔IgG。4.2.91×PBS溶液(pH值7.4):配制見附錄A.3。4.2.10超純水：符合GB/T6682,三級。4.2.110.1mol/LTris-HCL:配制見附錄A.4。4.2.12Tween-20分析純。5.1.1用電爐加熱99mL超純水至沸。5.1.2加入1mL1%氯金酸溶液，繼續(xù)加熱3min。5.1.3再緩慢加入2mL1%檸檬酸鈉溶液，邊加入邊用磁力攪拌器進行攪拌。5.1.4繼續(xù)加熱，顏色由灰色變?yōu)楹谏?，繼而變?yōu)榱良t色停止加熱(約5min)。5.1.5避光室溫冷卻后，用超純水補足至100mL。5.1.6用紫外分光光度計分別測其在520nm和535nm處的吸光度值，使其吸光度值在0.8～1.0之間5.2膠體金標記抗原和標記pH值用0.2mol/L碳酸鉀將膠體金溶液調(diào)節(jié)pH值為8.0后，加入純化后的豬圓環(huán)病毒Cap蛋白，使其終濃5.3.1在金標溶液中加入羊抗兔(IgG),使其終濃度為1mg/mL。5.3.2加入1/10體積的10%BSA溶液(終濃度1%為封閉液)封閉，混勻并靜置15min。5.3.34℃,8000r/min離心20min棄上清。3DB37/T3113—20185.3.4用原體積1/20且含有10%蔗糖的0.1mol/LTris-HCL(pH值8.5)儲存液重新懸浮沉淀。5.4玻璃纖維膜、聚酯纖維膜與NC膜的預處理5.4.1聚酯纖維膜(金標結(jié)合墊)用Tween-20,37℃浸泡30min。5.4.2玻璃纖維膜(樣品墊)、NC膜用封閉液37℃浸泡30min。5.4.3用1×PBS溶液(pH值7.4)分別對金標結(jié)合墊、樣品墊和NC膜洗3次，37℃干燥備用。5.5.1用噴膜儀將標記Cap蛋白的膠體金以5μL/cm的噴涂量噴涂到金標結(jié)合墊上，37℃干燥備用。5.5.2將純化后的豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白稀釋到1mg/mL,用噴膜儀按1μL/cm的噴涂量噴涂到NC膜的檢測線(T-線)上，37℃干燥備用。5.5.3將羊抗兔(IgG)稀釋到1mg/mL,用噴膜儀按1μL/cm的噴涂量噴涂到NC膜的對照線(C-線)上，37℃干燥備用。5.6.1將處理好的樣品墊、膠體金結(jié)合墊、NC膜和吸水紙(吸水墊)從上到下粘貼在預先裁好的PVC膠板上。5.6.2用切條機裁剪制作試紙條，寬度為6mm,組裝膠體金檢測卡備用。6免疫膠體金試紙條的檢測將檢測卡平放在桌面上，將待檢血清樣品3滴～4滴(約80μL)加入加樣孔(S)內(nèi)，在室溫內(nèi)靜置15min后，5min之內(nèi)判斷結(jié)果。7.1對照線(C)出現(xiàn)一條紫紅色線，試驗成立。7.2試驗成立條件下，判定結(jié)果：a)檢測線(T)處不出現(xiàn)紅色線，則待檢血清為豬圓環(huán)病毒2型抗體陰性；b)檢測線(T)處出現(xiàn)一條顏色很淺的紫紅色線，則待檢血清為豬圓環(huán)病毒2型抗體弱陽性；c)檢測線(T)出現(xiàn)一條顏色較深的紫紅色線，則待檢血清為豬圓環(huán)病毒2型抗體陽性。4(規(guī)范性附錄)試劑的配制A.1牛血清白蛋白(BSA)(10%)牛血清白蛋白1g。滅菌超純水定容至10mL。氯金酸1g。滅菌超純水定容至100mL。A.31×PBS溶液(pH7.4)磷酸二氫鉀(KH2P04):0.27g。磷酸氫二鈉(Na2HPO4):1.42g。氯化鈉(NaC1):8g。氯化鉀(KC1):0.2g。加滅菌超純水約800mL充分攪拌溶解，然后加入濃鹽酸