總膽固醇（TC）含量檢測試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案

總膽固醇（TC）含量檢測試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案原理總膽固醇（TC）包括游離膽固醇和膽固醇酯。組織TC是指組織中所有脂蛋白所含膽固醇之總和。CheKine?總膽固醇（TC）含量檢測試劑盒（微量法）提供了一種簡單的檢測方法，用于檢測生物樣本如動(dòng)物組織、細(xì)胞、細(xì)菌、血清（漿）中TC的含量水平。其原理是利用酯酶催化膽固醇酯水解生成游離膽固醇（FC）和游離脂肪酸（FFA），從而把膽固醇酯轉(zhuǎn)化為FC；進(jìn)一步利用膽固醇氧化酶催化FC氧化，生成Δ4-膽甾烯酮和H2O2；最后利用過氧化物酶催化H2O2氧化4-氨基安替比林和苯酚，生成紅色醌類化合物；在500nm有特征吸收峰，其顏色深淺與TC含量成正比。自備耗材·酶標(biāo)儀或可見分光光度計(jì)（能測500nm處的吸光度）·96孔板和微量玻璃比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭·低溫離心機(jī)、制冰機(jī)、水浴鍋·無水乙醇·勻漿器（如果是組織樣本）試劑準(zhǔn)備TCWorkingSolution：即用型；使用前，平衡到37℃；4℃保存。Standard：使用前配制，加10mL無水乙醇充分溶解，濃度為2μmol/mL，4℃避光分裝保存6個(gè)月。標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)置：按下表所示，用無水乙醇將2μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至1、0.5、0.25、0.125、0.063、0.031μmoL/mL。序號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品的體積無水乙醇的體積（μL）標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/mL）Std.1200μLofStandard02Std.2100μLofStd.1(2μmol/mL)1001Std.3100μLofStd.2(1μmol/mL)1000.5Std.4100μLofStd.3(0.5μmol/mL)1000.25Std.5100μLofStd.4(0.25μmol/mL)1000.125Std.6100μLofStd.5(0.125μmol/mL)1000.063Std.7100μLofStd.6(0.063μmol/mL)1000.031注意：每次實(shí)驗(yàn)都要做一次標(biāo)準(zhǔn)品檢測，制作標(biāo)曲；稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品溶液不穩(wěn)定，必須在4小時(shí)內(nèi)使用。樣本制備注意：推薦使用新鮮樣本，如果不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樣本可在-80℃保存1個(gè)月。動(dòng)物組織：稱取約0.1g組織，加入1mL無水乙醇，冰浴勻漿，8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。細(xì)胞、細(xì)菌：收集500萬細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，加1mL無水乙醇，超聲波破碎5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復(fù)30次），8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。血清（漿）：直接測定。注意：1.提取液中含有使蛋白變性的成分，若按蛋白濃度計(jì)算時(shí)，需要重新用裂解液提取蛋白進(jìn)行測定。2.如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號(hào)：KTD3001的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）進(jìn)行樣本蛋白質(zhì)濃度測定。實(shí)驗(yàn)步驟酶標(biāo)儀或可見分光光度計(jì)預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長到500nm，可見分光光度計(jì)用去離子水調(diào)零。TCWorkingSolution在37℃水浴中預(yù)熱30min以上。在96孔板或微量玻璃比色皿按照下表進(jìn)行操作：試劑空白孔（μL）標(biāo)準(zhǔn)孔（μL）測定孔（μL）無水乙醇5000Standard0500Sample0050TCWorkingSolution150150150混勻后室溫孵育15min，于500nm測定吸光值，記為A空白、A標(biāo)準(zhǔn)、A測定，計(jì)算ΔA測=A測定-A空白、ΔA標(biāo)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白。注意：空白孔和標(biāo)準(zhǔn)孔只需測定1次。實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果ΔA測小于0.01可適當(dāng)加大樣本量。如果ΔA測大于2μmoL/mL標(biāo)準(zhǔn)品的ΔA標(biāo)，樣本可用無水乙醇進(jìn)一步稀釋，計(jì)算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，或減少提取用樣本量。檢測時(shí)間不宜超過1h。結(jié)果計(jì)算注意：我們?yōu)槟峁┑挠?jì)算公式，包括推導(dǎo)過程計(jì)算公式和簡潔計(jì)算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計(jì)算公式為最終計(jì)算公式。1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為y軸，ΔA標(biāo)為x軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將ΔA測代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算出y（μmol/mL）。2.樣本TC含量計(jì)算(1)按樣本質(zhì)量計(jì)算TC含量(μmol/g鮮重)=y÷(W÷V提取)×n=y÷W×n(2)按蛋白濃度計(jì)算TC含量(μmol/mgprot)=y÷Cpr×n(3)按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算TC含量(μmol/104)=y÷(500÷V提取)×n=y÷500×n(4)按液體體積計(jì)算TC含量(μmol/mL)=y×nW：樣本質(zhì)量，g；V提取，加入無水乙醇的體積，1mL，n：樣本的稀釋倍數(shù)；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。結(jié)果展示典型標(biāo)準(zhǔn)曲線-以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。TCTC(μmol/mL)ΔAFigure1.TC標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)實(shí)例：Figure2.試劑盒