抗體制備技術(shù)

抗體制備技術(shù)醫(yī)學檢驗學院李會強Email：lihuiqiang1965@163.comAntibody，AbB細胞識別抗原后，增殖、分化為漿細胞所產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，主要存在于血清等體液中，能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合。IgG如何評價抗體質(zhì)量？效價（稀釋度）特異性（交叉反應(yīng)率）親和性（平衡常數(shù)）純度（IgG）種類（人工制備抗體）多克隆抗體（免疫血清）

Polyclonalantibody，PcAb單克隆抗體

Monoclonalantibody，McAb基因工程抗體

GeneticengineeringantibodyPart1

00000000免疫原的制備Part2

多克隆抗體的制備Part3

單克隆抗體的制備Part1

00000000免疫原的制備Part2

多克隆抗體的制備Part3

單克隆抗體的制備免疫原

Immunogen指用于制備抗體的抗原（antigen）或半抗原（hapten）免疫原顆粒性血細胞或細菌

可溶性完全抗原半抗原-載體合成肽-載體如何純化單一蛋白質(zhì)抗原？制備組織勻漿細胞溶解或破碎選擇性沉淀色譜分離鑒定溶解細胞的措施超聲粉碎反復凍融溶菌酶裂解？常規(guī)純化蛋白技術(shù)鹽析色譜凝膠色譜離子交換色譜親和色譜色譜免疫親和色譜純化抗原重要手段關(guān)于佐劑使用說明

佐劑Adjuvant指能夠增強免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型的物質(zhì)，應(yīng)用時可與抗原同時或預先注射于機體。佐劑本身可以有免疫原性，也可以沒有免疫原性。佐劑種類：具有免疫原性抗酸桿菌（BCG）無免疫原性福氏佐劑氫氧化鋁常用：福氏佐劑FreundadjuvantComplete

Freundadjuvant

羊毛脂石蠟油

BCGInCompleteFreundadjuvant

羊毛脂石蠟油使用原則：顆粒性抗原一般情況下不需使用；可溶性大分子量的蛋白質(zhì)免疫原、人工抗原，初次免疫時必須使用佐劑；不連續(xù)兩次使用完全福氏佐劑，以免導致動物嚴重反應(yīng)；Part1

00000000免疫原的制備Part2

多克隆抗體的制備Part3

單克隆抗體的制備多克隆抗體免疫血清如何獲得高質(zhì)量免疫血清？免疫原合適動物免疫方案制備理想免疫原選擇免疫動物確定免疫方案實施免疫程序檢測抗體效價采血分離血清抗體純化鑒定如何選擇動物？免疫原與動物種屬關(guān)系動物個體狀況的選擇抗血清用量和要求免疫方案免疫劑量體積和濃度

免疫途徑

次數(shù)與間隔全量免疫方案微量免疫方案采血方法

待抗體效價合格，需加強免疫，3~5日后采血，采血前需禁食

外周靜脈頸動脈插管

心臟穿刺抗體純化

特異性

確保與類似物質(zhì)不發(fā)生結(jié)合

蛋白純度

丙球IgGFab純化-免疫血清

特異性

免疫原的純度

后期純化

免疫吸附

交叉抗原（反向吸附）

特性抗原（正向吸附）抗體純化

純度

飽和硫酸銨鹽析

蛋白A親和層析鹽析后需除鹽ProteinA蛋白A親和層析pH7.4PB平衡pH3洗脫緩沖液pH8.9結(jié)合緩沖液pH6洗脫緩沖液pH3洗脫緩沖液鑒定

特異性

效價

親合力

純度PcAbMcAb免疫血清儲存冷凍保存冷凍干燥保存4℃保存Part1

00000000免疫原的制備Part2

多克隆抗體的制備Part3

單克隆抗體的制備定義單克隆抗體monoclonalantibody，McAb由單個雜交瘤細胞增殖而成的細胞克隆產(chǎn)生的，針對某一抗原表位的、完全均一的、單一特異性的抗體克隆選擇學說B細胞表面具有單一一種抗原受體，只識別一種抗原表位，并產(chǎn)生針對該表位的抗體。clonalselectiontheoryhybridomacell雜交瘤技術(shù)關(guān)鍵親本細胞與選擇細胞的融合

選擇培養(yǎng)基與雜交瘤細胞的實現(xiàn)親本細胞

免疫脾細胞

抗原致敏且分泌抗體

骨髓瘤細胞

長期在體外無限繁殖免疫脾細胞

動物免疫

同免疫血清制備

制備脾細胞懸液BALB/c小鼠骨髓瘤細胞（SP2/0

orNS1）選擇有HGPRT或TK缺陷的細胞株；次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）胸苷激酶（TK）與B細胞雜交形成穩(wěn)定的雜交瘤細胞；骨髓瘤細胞本身不分泌免疫球蛋白；具有較高融合效率；骨髓瘤細胞（SP2/0

orNS1）

確保

酶缺陷（需驗證）狀態(tài)（活力）+8-

AzaguanineMyelomaCellsHGPRT-MyelomaCells融合（fuse）

生物法

化學法PEG

物理法篩選雜交瘤細胞篩選雜交瘤細胞選擇培養(yǎng)基HAT次黃嘌呤（H）氨基蝶吟（A）胸腺嘧啶（T）要點：免疫脾細胞的制備骨髓瘤細胞的培養(yǎng)與篩選

細胞融合篩選陽性克隆克隆化抗體的大量制備融合：關(guān)鍵一步；融合前親本細胞需經(jīng)預處理；融合于37℃水浴中進行；注意兩種親本細胞的比例；選擇高質(zhì)量細胞融合劑；緩慢終止融合作用；DerivedfromdifferentBLymphocytescelllinesPOLYCLONAL.MONOCLONAL.DerivedfromasingleBcellcloneBatchtoBatchvariationaffectingAbreactivity&titremAbofferReproducible,Predictable&Potentiallyinexhaustiblesuppl