DB32T3372-2018東方百合脫毒技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.20

B05

備案號(hào)：58108-2018DB32

江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB32/T3372—2018

東方百合脫毒技術(shù)規(guī)程

Technicalregulationofvirus-freefororientallily

2018-2-10發(fā)布2018-3-10實(shí)施

江蘇省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布

DB32/T3372—2018

東方百合脫毒技術(shù)規(guī)程

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了東方百合脫毒技術(shù)的術(shù)語和定義、脫毒設(shè)備、組培室消毒滅菌、種源獲取、病毒檢測(cè)

等技術(shù)要求。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于具備生物技術(shù)條件下的東方百合脫毒技術(shù)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

GB/T18247主要花卉產(chǎn)品等級(jí)第6部分：花卉種球

NY/T1491花卉植物病毒檢測(cè)規(guī)程

NY/T2306花卉種苗組培快繁技術(shù)規(guī)程

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

東方百合orientallily

由天香百合、鹿子百合、日本百合、紅花百合等種與湖北百合的雜種中選育出來的栽培雜種系。

4脫毒設(shè)備

4.1組培場地建設(shè)

組培實(shí)驗(yàn)室應(yīng)選擇安靜、清潔、無污染的地方。

4.2洗滌設(shè)備

工廠化生產(chǎn)可選用自動(dòng)洗瓶機(jī)，另外配置干燥箱、晾瓶架等。

4.3百合脫除病毒設(shè)備

超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、解剖刀、鑷子、解剖針、解剖鏡等。

4.4滅菌設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋、器械消毒器、紫外燈、烘干箱、微濾孔器等。

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5組培室消毒滅菌

按NY/T2306要求進(jìn)行組培室消毒。

6種源獲取

6.1鱗片誘導(dǎo)成鱗莖

6.1.1鱗片選取

選取完整、無病蟲害無病斑且周徑≥14cm的百合鱗莖，由外向內(nèi)完整的剝?nèi)≈袑喻[片，流水沖洗凈

表面泥垢后,用0.2%～0.5%的洗衣粉水沖洗10min，在自來水流水條件下沖洗30min。

6.1.2外植體獲取

用75%酒精滅菌30s，再用0.1%的升汞溶液浸泡8min～10min，期間不斷進(jìn)行搖動(dòng)，使鱗片充分與溶

液混合，最后用無菌水沖洗5次～6次。將鱗片外圍1mm的部分切除，然后選取外層下部與鱗莖盤相連的

部分為最佳外植體橫切約為0.5cm厚的小塊。

6.1.3誘導(dǎo)與增殖愈傷組織

6.1.3.1愈傷培養(yǎng)基配方

MS+2mg/L6-BA+1mg/L2，4-D+30g/L蔗糖+6.5g/L瓊脂，pH為5.8～6.0。

6.1.3.2鱗片接種

將切好的百合鱗片，將底部切口平放于誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基上，形成愈傷。

6.1.4愈傷誘導(dǎo)成小鱗莖

6.1.4.1培養(yǎng)基配方

MS+0.5mg/L6-BA+15g/L蔗糖+6.5g/L瓊脂，pH為5.8～6.0。

6.1.4.2愈傷接種

將鱗片上的愈傷取出并切成黃豆粒大小，平放于誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基上。

6.1.4.3培養(yǎng)條件

愈傷及成鱗莖誘導(dǎo)均放置于培養(yǎng)室中，置于23℃～27℃，進(jìn)行光照與黑暗比例為16h/8h條件下培養(yǎng)，

光照強(qiáng)度為3000lx～5000lx。在培養(yǎng)期間，每隔20d更換一次培養(yǎng)基。

6.2組培鱗莖增大培養(yǎng)

6.2.1組培鱗莖增大培養(yǎng)基配方

MS+1mg/LIBA+60g/L蔗糖+6.5g/L，pH為5.8～6.0

6.2.2小鱗莖接種

將分化的小鱗莖接種到組培鱗莖增大培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

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6.2.3培養(yǎng)條件

將接種的鱗莖，置于23℃～27℃條件下，暗培養(yǎng)60d即可長成直徑大于0.5cm以上的組培鱗莖。在培

養(yǎng)期間，每隔20d更換一次培養(yǎng)基。

6.3打破休眠

把增大的組培鱗莖，整瓶轉(zhuǎn)至4℃暗培養(yǎng)的冷藏室內(nèi)，暗培養(yǎng)60d～80d解除休眠。

6.4熱處理

將解除休眠的百合鱗莖，整瓶置于人工氣候箱中每天升高1℃至變溫培養(yǎng)（38℃-10h，26℃-14h）,

暗培養(yǎng)持續(xù)15d～25d。

6.5剝?nèi)∏o尖培養(yǎng)成鱗莖

6.5.1莖尖誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基

MS+2.5mg/LPicloram+30g/L蔗糖+6.5g/L瓊脂，pH為5.8～6.0

6.5.2莖尖接種

把熱處理過的百合組培鱗莖，在10倍～80倍的解剖鏡下，用解剖刀剝除外部鱗片漏出生長點(diǎn)，用解

剖針挑取0.5mm～0.7mm大小的莖尖生長點(diǎn)接種到誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基上。

6.5.3培養(yǎng)條件

將接種的莖尖至于25℃條件下，全暗培養(yǎng)60d～80d，每20d更換一次培養(yǎng)基。

6.6愈傷誘導(dǎo)成球

按6.1.4與6.2的步驟進(jìn)行百合籽球的培養(yǎng)。

7病毒檢測(cè)

將脫毒的百合組培鱗莖，采用多重RT-PCR法（引物序列見表1）進(jìn)行主要病毒（黃瓜花葉病毒

（Cucumbermosaicvirus，CMV）、百合無癥病毒（Lilysymptomlessvirus，LSV）和百合斑駁病毒（Lily

mosettlevirus，LMoV）的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為陰性，說明鱗莖不帶病毒可作為百合無病毒種源繼續(xù)擴(kuò)繁，

如果為陽性，說明脫毒不夠徹底，不能作為無病毒種源。

表1百合主要病毒檢測(cè)的引物序列

病毒上游引物下游引物

VirusesUpprimer(5’-3’)Downprimer(5’-3’)

CMVATGGACAAATCTGAATCAACCAGTCAGACTGGGAGCACTCCAG

LMoVCACCTCACCAAATGTAAATGGTAGAAATTCCAAGTAAGGAGTGC

LSVGAAGAAGCACGCTGGACTG