《煙草主要病毒核酸恒溫擴(kuò)增檢測技術(shù)報告》

煙草主要病毒核酸恒溫擴(kuò)增檢測技術(shù)報告1、項目背景近年來,病毒病在世界各國的危害日趨嚴(yán)重,所發(fā)現(xiàn)和報道的種類日益增多，危害煙草的病毒有煙草花葉病毒(TabacooMosaicVirus,TMV)、黃瓜花葉病毒(CucumberMosaicVirus,CMV)、馬鈴薯X病毒(PotatoVirusX,PVX)、馬鈴薯Y病毒(PotatoVirusY,PVY)、煙草蝕紋病毒(TabacooEtchVirus,TEV)、煙草環(huán)斑病毒(TabacooRingSpotVirus,TRSV)等十幾種病毒。其中煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、馬鈴薯Y病毒是引起煙草病毒病的主要病毒,嚴(yán)重影響煙草的產(chǎn)量和質(zhì)量，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，對煙草生產(chǎn)威脅很大。對為害煙草的病毒進(jìn)行有效和快速檢測，對于預(yù)防和控制煙草病毒病具有十分重要的現(xiàn)實意義。煙草病毒病在世界各煙區(qū)都普遍發(fā)生，是我國煙草危害最重要的病害。病毒病的發(fā)生嚴(yán)重影響煙葉的產(chǎn)量和質(zhì)量，給我國煙草生產(chǎn)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。因此開發(fā)新的技術(shù)快速、準(zhǔn)確、靈敏地檢測煙草主要病毒病，加強(qiáng)漂浮育苗苗期檢疫以及栽培土壤環(huán)境的監(jiān)測，對預(yù)防病毒感染，切斷病毒傳播，保障我國煙草生產(chǎn)的健康持續(xù)發(fā)展具有重要意義。目前用于煙草病毒檢測的方法主要有生物學(xué)診斷、電子顯微鏡、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）以及分子生物學(xué)等方法：生物學(xué)方法主要是鑒別寄主反應(yīng)或指示植物等，這種僅僅以鑒別寄主反應(yīng)或指示植物為依據(jù)的方法,雖曾廣泛運(yùn)用,卻由于其檢測速度慢、受環(huán)境和季節(jié)影響較大等諸多因素限制而運(yùn)用較少。電子顯微鏡技術(shù)雖然可以直接觀察到病毒粒子的存在，但其操作復(fù)雜、耗費(fèi)時間長；酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）雖具簡便、快速等優(yōu)點,但靈敏度較差,且存在非特異性反應(yīng)；上述三種方法均不能快速、簡便、準(zhǔn)確地檢測煙草普通花葉病毒和馬鈴薯Y病毒。近年來發(fā)展起來的以分子生物學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)的病毒檢測方法主要有RT-PCR法以及PCR微量板雜交等檢測方法，克服了上述三種方法的缺點，在實驗室條件下實現(xiàn)了煙草普通花葉病毒的相對快速、準(zhǔn)確檢測。由于常規(guī)的PCR檢測需要昂貴的PCR儀，凝膠電泳和成像系統(tǒng)等大大限制了這些檢測方法在生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用。環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)是2000年由Notomi等發(fā)明的。該技術(shù)針對目的基因的6個區(qū)段，設(shè)計4條特異引物并利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶,在一定溫度下對核酸進(jìn)行等溫擴(kuò)增。最近幾年已開始應(yīng)用于生物致病病原的檢測。到目前為止，尚未見利用LAMP技術(shù)檢測煙草普通花葉病毒和馬鈴薯Y病毒的報道。本研究的目的是提供煙草普通花葉病毒和馬鈴薯Y病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測方法，以實現(xiàn)能對這兩種煙草病毒病進(jìn)行快速、特異、靈敏、簡便的現(xiàn)場檢測，克服已有技術(shù)的不足。本項目自2010年1月份國家煙草專賣局下達(dá)了項目任務(wù)后，積極自籌經(jīng)費(fèi)，在中國煙草資源平臺的支持下，依據(jù)目標(biāo)任務(wù)、起止時間按照技術(shù)路線、實施方案、預(yù)期成果開展相關(guān)技術(shù)研究。項目從論證、立項、實施至總結(jié)計劃開展2年研究，到2011年10月結(jié)束，項目按期完成。2、主要技術(shù)內(nèi)容2.1設(shè)計用于檢測主要煙草病毒病的的LAMP引物序列：分別針對煙草花葉和馬鈴薯Y病毒的衣殼蛋白基因中保守區(qū)段設(shè)計的4條特異引物，使所提供的引物能有效檢測目前生產(chǎn)中的兩種煙草病毒病，且檢測特異性好。2.2研究樣品的取樣、處理方法：戴一次性PE手套，取樣品組織約0.02～1.0g置于采樣管中，用研磨棒將樣品組織磨碎至漿狀。2.3優(yōu)化RNA提取、純化技術(shù)提取體系：用研磨棒蘸取漿狀的樣品組織將FTA膜片充分潤濕，吸取親水性且易揮發(fā)的叔醇滴于上述FTA膜片上，靜置1~20min，獲得吸附于FTA上的病毒RNA。2.4規(guī)范檢測結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)：選擇核酸染料GeneFinderTM加入反應(yīng)體系，綠色為陽性（感染目標(biāo)病毒），橙色為陰性（未感染目標(biāo)病毒）2.5優(yōu)化、規(guī)范主要病毒病的LAMP檢測技術(shù)，利用將核算染料粘附到擴(kuò)增反應(yīng)管的內(nèi)側(cè)上方或蓋子內(nèi)側(cè)，有效消除污染風(fēng)險。3、技術(shù)關(guān)鍵3.1技術(shù)特點：Loop-mediatedisothermalamplificationmethod（LAMP）：環(huán)介導(dǎo)的恒溫擴(kuò)增方法，是一種新式恒溫核酸擴(kuò)增方法,采用能特異識別靶序列上6個位點的4條引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(BstDNApolymerase),在恒溫條件(60～65℃),進(jìn)行核酸的指數(shù)級擴(kuò)增,在45～60min的時間里其擴(kuò)增效率可達(dá)到109～1010個數(shù)量級。在擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生莖———環(huán)結(jié)構(gòu),引物與其雜交啟動新一輪核酸合成。本研究利用針對目標(biāo)病毒的衣殼蛋白基因中保守區(qū)段設(shè)計的4條特異引物、一種反轉(zhuǎn)錄酶和一種Bst鏈置換酶，無需單獨對目的核酸（RNA）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，在恒定溫度下保溫一段時間即可同步完成對目的核酸的反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，實現(xiàn)對兩種病毒病的快速和高靈敏檢測，建立了適用于煙草主要病毒病監(jiān)測的RT-LAMP（reversetranscriptionloop-mediatedisothermalamplificationmethod）。3.2關(guān)鍵技術(shù)：提供檢測兩種病毒病的LAMP特異引物；優(yōu)化病毒RNA的提取程序；在不增加成本的條件下，避免現(xiàn)場檢測出現(xiàn)交叉污染，實現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的檢測判斷。4、方法制定4.1影響因素的研究：優(yōu)化LAMP反應(yīng)檢測體系（1）Mg2+濃度圖1ART-LAMP優(yōu)化.在63C條件下Mg2+濃度的影響泳道從右到左1–8:1mM，2mM，3mM，4,5,6,7and8mMMgCl2,M：DNAmarkerDL2000由圖1A可以看出，當(dāng)Mg2+離子濃度低于4mM時，不能進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，Mg2+離子濃度達(dá)到5mM時，產(chǎn)物量比較大，檢測結(jié)果清晰、明了，當(dāng)Mg2+離子濃度大于5mM時，反應(yīng)產(chǎn)物沒有明顯的增加，因此優(yōu)化Mg2+離子濃度為5mM。（2）反應(yīng)溫度圖2BRT-LAMP優(yōu)化.5mMMgCl2條件下溫度的影響，泳道從左到右1–6:20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，65C，M：DNAmarkerDL2000由圖2B可以看出，當(dāng)溫度低于50℃時，擴(kuò)增不能被檢測到，到溫度達(dá)到60℃時，擴(kuò)增產(chǎn)物量大，可明顯檢測到，65℃時，同樣能得到很好的效果，因此，考慮到田間檢測保溫設(shè)施散熱等因素，優(yōu)化溫度為65℃。（3）反應(yīng)時間圖3C在5mMMgCl2和65C溫度條件下，反應(yīng)時間的影響，泳道從左到右1–5:15分鐘，30分鐘，45分鐘，60分鐘，75分鐘，M：DNAmarkerDL2000由圖3C可以看出，反應(yīng)時間低于45分鐘時，不能檢測到反應(yīng)產(chǎn)物，當(dāng)反應(yīng)時間達(dá)到60分鐘時，反應(yīng)產(chǎn)物量大，易于被檢測到，因此優(yōu)化反應(yīng)時間為60分鐘。4.2取樣方法戴一次性PE手套取煙葉（幼葉、老葉）樣品約（0.02～1.0）g置于（1.5～2.5）ml滅菌試管中，用研磨棒將樣品組織磨碎至漿狀，用研磨棒蘸取漿狀的樣品組織將FTA膜片充分潤濕，吸取親水性且易揮發(fā)的叔醇滴于上述FTA膜片上，靜置（1~20）min，獲得吸附于FTA上的病毒RNA。每樣品換一次PE手套。4.3靈敏度檢測PCR反應(yīng)體系：總PCR反應(yīng)體系20μL，包括2.5μL10×buffer,1.5μLMgCl2(1.9mM),0.5μLdNTP混合液(每種dNTP10mM),0.25μLTaq聚合酶(4U/μL;Promega,USA),每種引物1μL(10lM),12.25μLDEPC-treatedH2Oand1μL模板cDNA.擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸60sec，共35個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存，反應(yīng)產(chǎn)物用用2%瓊脂糖電泳。RT-LAMP反應(yīng)體系：總體系25μL，包括FIP和BIP引物各1.6μM,F3，B3各引物0.2μM，1×反應(yīng)Buffer(20mMTris–HCl,10mMKCl,2mMMgSO4,10mM(NH4)2SO4,0.1%TritonX-100),5mMMgCl2,1mM甜菜堿,每種dNTP1.4mM,1μL(8U)BstDNA聚合酶(NEB),0.5μL模板RNA,0.2μL(8U)反轉(zhuǎn)錄酶(Fermentas),最后加雙蒸水至25μL.反應(yīng)條件為65℃，反應(yīng)時間為60分鐘，反應(yīng)產(chǎn)物用用2%瓊脂糖電泳。圖4RT-LAMP和RT-PCR靈敏度檢測的影響（TMV）A.pMD18-T-TMVPCR靈敏度檢測.B.pMD18-T-TMVLAMP靈敏度檢測M:DNAmarkerDL2000.泳道模板濃度以10的數(shù)量級稀釋，1–8分別是7×100–7×107病毒粒子。由圖4A可以看出，PCR靈敏度檢測從第4泳道7×103開始檢測出產(chǎn)物，圖4B從第二泳道7×101可以檢測出產(chǎn)物，因此RT-LAMP最低檢測極限為70個病毒粒子，靈敏度比普通PCR高100倍。4.4評價方法向反應(yīng)產(chǎn)物中加入0.2μLGenefindertm，裸眼就可判斷出檢測結(jié)果，不需要專業(yè)的技術(shù)知識，陽性為綠色，陰性為橙色。圖5TMVRT-LAMP產(chǎn)物顯色檢測試管從左到右分別是TMV陽性對照，TMV陰性對照，最后兩個是檢測葉片，入陽性為綠色，陰性為橙色。4.5檢測方法（1）特異引物序列TMV特異引物序列FIP5’-GCACCACGTGTGATTACGGACATTTTGACCTCTGGTCCTGCAACT-3’BIP5’-AAGGGTTGTGTCTTGGATCGCGTTTTTTACGTGCCTGCGGATGT-3’F3：5’-CGAGAGCTCTTCTGGTTTGG-3’B3：5’-GATTCGAACCCCTCGCTTTA-3’PVY特異引物序列FIP5'-ACCCACATCCCGCAGATTTCGTTTTATGCGCAACAAAAAGGAACC-3’BIP5'-ACATCACGAACACCAGTGAGGGTTTTTTTCAATGCTGCGGCCTTC-3’F3：5'-CTCAGATGTTGCAGAAGCGT-3’B3：5'-AAGTCGAGGTTGGGCTGA-3’。（2）取煙葉樣品0.05g+置于采樣管中，用研磨棒將樣品組織磨碎至漿狀；（3）用研磨棒蘸取漿狀的樣品組織將FTA膜片充分潤濕；（4）吸取叔醇滴于上述FTA膜片上，靜置1~20min；（5）用牙簽將上述FTA膜片轉(zhuǎn)移到蒸餾水內(nèi)，震蕩漂洗管3~5min以洗滌FTA膜片；（6）再用牙簽將上述核酸變性管內(nèi)的FTA膜片轉(zhuǎn)移到擴(kuò)增檢測管內(nèi)，將擴(kuò)增檢測管置于65oC條件下保溫60min；（7）將擴(kuò)增檢測管上下反復(fù)甩動1-3min；（8）用力向下甩動擴(kuò)增檢測管，使管內(nèi)混有染料的擴(kuò)增反應(yīng)液集聚于擴(kuò)增檢測管底部，用眼睛觀察反應(yīng)液，如果反應(yīng)液呈現(xiàn)綠色則表示該樣品的PVY或TMV檢測結(jié)果為陽性，如果反應(yīng)液呈現(xiàn)橙黃色則表示該樣品的PVY或TMV檢測結(jié)果為陰性。5、總結(jié)本研究對這兩種煙草病毒病進(jìn)行快速、特異、靈敏、簡便的現(xiàn)場檢測，可使得TMV、PVY的檢測能夠快速有序地進(jìn)行，可實現(xiàn)其檢測過程的程序化和標(biāo)準(zhǔn)化，使得操作規(guī)范、不易出錯。對加強(qiáng)煙草病毒病的流行病學(xué)監(jiān)測和病害防控意義重大，具有很高的推廣應(yīng)用價值，結(jié)論如下：1．引物特異性強(qiáng)依據(jù)優(yōu)選的TMV、PVY衣殼蛋白保守區(qū)序列所設(shè)計的擴(kuò)增引物能有效檢測幾乎所有TMV、PVY的病毒株系，而與其他病毒的衣殼蛋白又無同源性，檢測特異性非常好；2．檢測準(zhǔn)確采用內(nèi)置染料的方法，在反應(yīng)結(jié)束后不用打開反應(yīng)管即可直接對反應(yīng)液進(jìn)行染色，避免了打開反應(yīng)管再添加染料使后續(xù)待檢樣品被擴(kuò)增產(chǎn)物污染而造成假陽性的結(jié)果，從而大大提高了該方法在檢測中應(yīng)用的可靠性。3．靈敏度高檢測靈敏度比普通PCR提高