微生物的獲得與利用GuangdongFoodandDrugVocationalCollege講

微生物的獲得與利用GuangdongFoodandDrugVocationalCollege廣東食品藥品職業(yè)學院張召副研究員ZhaoZhangassociateresearcher1、樣本采集及保存：通過低溫和樣本保存液保存樣品，延長樣品保存時間和減少樣本中菌種損失。2、目標菌種檢測：通過二代高通量深度測序技術/熒光定量PCR檢測技術等，檢測樣本中微生物的種類及其相對豐度，對樣品進行質控。3、目標菌種分離：通過查閱文獻和資料和不同培養(yǎng)基分離得到的菌株，進一步構建目標菌種的選擇培養(yǎng)基。微生物分離培養(yǎng)4、目標菌種培養(yǎng)：利用選擇培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，對目的菌種進行富集培養(yǎng)，同時利用96孔板進行大規(guī)模的分離、純化等反復操作，找到目的菌株。5、目標菌種鑒定：對最終純化好的目的菌株進行16S、MALDI-TOFMS等快速鑒定技術確認目標菌株。微生物分離培養(yǎng)TidjaniAlou,M.etal.StateoftheArtintheCultureoftheHumanMicrobiota:NewInterestsandStrategies.ClinicalMicrobiologyReviews34,e00129-19(2020).微生物存活的關鍵運用厭氧糞便收集裝置，在內部創(chuàng)建厭氧氣體以保持原始微生物群組成和多樣性。樣本保存于含抗氧化劑的糞菌保護液中，減少暴露于氧氣環(huán)境的時間。減少糞便樣品冷藏運輸和保存時間，盡快開展樣本分離培養(yǎng)。在冷凍保存或冷凍干燥糞菌液前，添加保護劑培養(yǎng)基（含蔗糖（10%）、海藻糖（10%）、脫脂乳（10%）和抗氧化劑）保持腸道細菌活力。

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通過流式細胞術和平板計數法評估糞便樣品保存和處理方式Bellali,S.,Lagier,J.-C.,Raoult,D.&BouKhalil,J.AmongLiveandDeadBacteria,theOptimizationofSampleCollectionandProcessingRemainsEssentialinRecoveringGutMicrobiotaComponents.FrontiersinMicrobiology10,(2019).智能集菌儀檢測樣品微生物存活技術微生物獲得來源與技術兼性厭氧菌，在厭氧條件下培養(yǎng)較有利于其生長。菌落周圍無溶血環(huán)，不溶血，屬于γ-溶血瓊脂平板上圓形或似圓形、凸起、灰白色菌落；具有較好的胃腸液耐受性。

培養(yǎng)特性溶血反應革蘭氏染色及鏡檢微生物的培養(yǎng)特性采用API50CH鑒定系統(tǒng)通過49個生化試驗來對菌種的碳水化合物的代謝進行檢定。LF0124hLF0148hLF01API試驗結果統(tǒng)計表LF01API試驗鑒定結果

LF01發(fā)酵半乳糖（GAL）、葡萄糖（GLU）、果糖（FRU）、甘露糖（MNE）、山梨糖（SBE）、甘露醇（MAN）、山梨醇（SOR）、乳糖（LAC）、蔗糖（SAC）、海藻糖（TRE）和松參糖（MLZ）等，且鑒定結果均為類干酪乳桿菌類干酪亞種，鑒定%均≥99.7%，T值均≥0.79。微生物生化特性菌株抗生素敏感性微生物的安全評價活菌藥物活菌藥物，又稱微生態(tài)活菌制品（Microecologicallivebacterialproducts）系由人體內正常菌群成員或具有促進正常菌群生長和活性作用的無害外籍細菌，經培養(yǎng)、收集菌體、干燥成菌粉后，加入適宜輔料混合制成。用于預防和治療因菌群失調引起的相關癥狀和疾病。活菌藥物的定義國內，對于微生態(tài)藥物的管理并沒有明確的規(guī)定，早些年已經有十幾種微生態(tài)制劑上市，其與現(xiàn)在FDA定義的活體生物藥有一定的區(qū)別；多為非處方藥物，適應癥大多是籠統(tǒng)的急慢性腹瀉。當時國內臨床試驗標準不太完善、審批政策也較為寬松。近10年無新品種上市。在美國，至今還沒有活菌藥物獲得批準上市。目前在進行特定活體生物藥物研發(fā)的公司有20多家，在研項目30多種，最快III期全球都在布局這一方向，無毒安全，免疫提升，潛力巨大010203全球現(xiàn)狀活菌藥物的定義工程菌，各國FDA均有

嚴格管控不會引起耐藥與依賴問題，攝入一定量的后，菌株定值治未病安全人來源，本身已適應菌株來源與治療范圍廣環(huán)境、食材、各種動物、食品、水源等，幾乎全部疾病都可以菌株定值后，產生大量的代謝物，和中藥作用類似活菌藥物的特點無依賴/無耐藥

截至2022年03月，國際上進入臨床階段的LBP藥物有60個左右（圖1，2數據來源：企業(yè)官網、ClinicalTrial），其中進入臨床III期的品種有6個。目前有更多針對新適應癥（