DB50T 1244-2022 基于plo基因的山羊化膿隱秘桿菌PCR檢測(cè)方法

ICS65.020.30CCSB41DB50基于plo基因的山羊化膿隱秘桿菌PCR檢測(cè)方法重慶市市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布IDB50/T1244—2022前言 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)和定義 14縮略語(yǔ) 1 16試劑材料、儀器設(shè)備 27方法步驟 28結(jié)果判定 49廢棄物處理 1附錄A（資料性）靶基因片段序列及引物在靶基因中的位置 2附錄B（規(guī)范性）試劑的配制 3附錄C（規(guī)范性）化膿隱秘桿菌plo基因PCR產(chǎn)物電泳判定圖 4DB50/T1244—2022本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。本文件由重慶市畜牧科學(xué)院提出。本文件由重慶市農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會(huì)歸口并組織實(shí)施。本文件起草單位：重慶市畜牧科學(xué)院。本文件主要起草人：張素輝、沈克飛、許國(guó)洋、付利芝、徐登峰、朱燕、蔣雨、周俊、陳朝洪、龍小飛、馮剛、鄧小龍、劉博。1DB50/T1244—2022基于plo基因的山羊化膿隱秘桿菌PCR檢測(cè)方法本文件規(guī)定了基于plo基因的山羊化膿隱秘桿菌PCR檢測(cè)方法的縮略語(yǔ)、原理、試劑材料、儀器設(shè)備、方法步驟、結(jié)果判定、廢棄物處理等要求。本文件適用于山羊化膿隱秘桿菌病的PCR診斷。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范SN/T3223動(dòng)物傳染病PCR檢測(cè)技術(shù)確認(rèn)規(guī)范3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。DNA脫氧核糖核酸（DeoxyriboNucleicAcid）PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）PL0溶血素（Pyolysin）TSA胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TrypticSoyAgarsoybean-caseindigestagar）TSB胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TrypticSoyBrothsoybean-caseindigestmedium）5原理5.1本文件針對(duì)山羊化膿隱秘桿菌的plo基因，設(shè)計(jì)合成特異引物，提取細(xì)菌DNA作為模板，在DNA聚合酶的作用下，經(jīng)高溫變性、低溫退火和中溫延伸的多次循環(huán)，使特異DNA片段的拷貝數(shù)放大數(shù)百萬(wàn)倍。將擴(kuò)增的DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像儀觀(guān)察，可見(jiàn)陽(yáng)性條帶。5.2該檢測(cè)方法，只能從化膿隱秘桿菌基因組DNA中擴(kuò)增出特異條帶。2DB50/T1244—20226試劑材料、儀器設(shè)備6.1試劑材料實(shí)驗(yàn)用水均符合GB/T6682二級(jí)水規(guī)定。除另有規(guī)定外，所用試劑均為分析純及以下的試劑:a)化膿隱秘桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，編號(hào)ATCC49698。b)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：商品化試劑盒。c)無(wú)水乙醇。d)2×TaqPCRMasterMix。e)核酸染料。f)DNA上樣緩沖液。g)瓊脂糖。h)DNA分子量標(biāo)記：DNAMarker2000。i)特異性引物：plo-F：TTGATAACGGTCCACCACGG;plo-R：CACTGCCACGACCTACAAGT。靶基因片段序列及引物在靶基因中的位置見(jiàn)附錄A。j)離心管、透明薄壁PCR管（0.2mL）、醫(yī)用棉簽、解剖器械（手術(shù)刀、剪刀、鑷子）、樣品袋。k)TSA固體培養(yǎng)基、TSB液體培養(yǎng)基、TAE電泳緩沖液，配制方法見(jiàn)附錄B。6.2儀器設(shè)備根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，儀器設(shè)備應(yīng)符合以下要求：a)電子天平（感量0.001g）。l)高壓滅菌鍋（溫度范圍：105℃~135℃,工作壓力：≤0.35MPa）。m)高速離心機(jī)（可控溫至4℃、離心速度可達(dá)12000r/min以上）。n)電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（溫控范圍：10℃~300℃,恒溫波動(dòng)度≤±1℃)。o)二級(jí)生物安全柜。p)恒溫培養(yǎng)箱（溫度范圍：5℃~50℃,溫度均勻度：≤±1℃)。q)純水儀。r)組織研磨儀。s)制冰機(jī)。t)恒溫水浴鍋（溫度范圍：5℃~50℃,溫度均勻度：≤±1℃)。u)4℃冰箱（溫控范圍：2℃~8℃);-20℃冰箱。v)PCR儀。w)電泳儀（電壓90V～120V）。x)凝膠成像儀。y)微量移液器（2μL，20μL，200μL，1000μL）及配套吸頭。7方法步驟7.1樣品采集與保存采樣原則，按照NY/T541的規(guī)定執(zhí)行。3DB50/T1244—20227.1.1樣品采集根據(jù)臨床情況，可以采集以下樣品：a)組織樣：無(wú)菌采集肺臟、淋巴結(jié)病變部位，將其放入密閉的樣品袋內(nèi)，并應(yīng)做好樣品標(biāo)識(shí)。b)胸腔積液：若有胸腔積液，在完全暴露胸腔前，用2mL或5mL注射器無(wú)菌吸取1mL～2mL胸腔積液,分裝于1.5mL離心管中，并應(yīng)做好樣品標(biāo)識(shí)。c)膿液：若有肩前或股前淋巴結(jié)腫大、化膿，在膿腫部位表面常規(guī)碘酊消毒，滅菌手術(shù)刀在膿腫下部劃開(kāi)小于1cm創(chuàng)口，擠出膿液，用去掉針頭的5mL注射器吸取膿液,分裝于1.5mL離心管中，并應(yīng)做好標(biāo)識(shí)。7.1.2樣品保存應(yīng)將采集的樣品于4℃條件下保存，立即送到實(shí)驗(yàn)室。7.2樣品處理7.2.1實(shí)驗(yàn)環(huán)境實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)符合GB19489要求，在二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。7.2.2組織樣處理肺臟、淋巴結(jié)等組織樣處理方法如下：a）取4g～5g組織樣，剪碎、研磨，用5mL滅菌超純水混懸；b）2000r/min離心2min，取上清液；c）10000r/min離心10min，棄上清液；d）沉淀以200μL超純水重懸，備用。7.2.3胸腔積液、膿液處理胸腔積液、膿液等樣品處理方法如下：a）無(wú)菌吸取500μL胸腔積液或膿液至1.5mL滅菌離心管中，加入500μL超純水，震蕩混勻；b）10000r/min離心10min，棄上清，收集沉淀；c）沉淀以200μL超純水超純水重懸，備用。7.2.4可疑培養(yǎng)物樣品處理取待檢液體培養(yǎng)物（純培養(yǎng)物或混合培養(yǎng)物）1mL10000r/min離心5min，棄上清，沉淀以200μL超純水重懸，備用。7.2.5陽(yáng)性對(duì)照化膿隱秘桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)TSA復(fù)蘇，純化培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接TSB培養(yǎng)，作為陽(yáng)性對(duì)照，處理應(yīng)同7.2.4。7.2.6陰性對(duì)照滅菌超純水，處理應(yīng)同7.2.4。7.3DNA提取4DB50/T1244—2022取第7.2獲得樣品，采用同等商品化試劑盒進(jìn)行DNA提取。7.4PCR擴(kuò)增7.4.1基本要求PCR檢測(cè)過(guò)程中的敏感性、特異性、重復(fù)性等應(yīng)符合SN/T3223要求。7.4.2PCR反應(yīng)體系組成將提取的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，陰性對(duì)照為超純水，PCR反應(yīng)體系20μL，反應(yīng)體系見(jiàn)表1。表1PCR反應(yīng)體系7.4.3PCR反應(yīng)程序94℃2min；94℃30s，60℃30s，72℃15s，30個(gè)循環(huán)；72℃3min；4℃保存。7.4.4PCR產(chǎn)物檢測(cè)取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，方法操作如下：a)參照附錄B制備50×TAE電泳緩沖液，稀釋為1×TAE使用；b)配制含核酸染料的1.2%瓊脂糖凝膠；c)取5μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物與6×DNA上樣緩沖液按體積比5:1混合后加入加樣孔；d)用1×TAE緩沖液作為電泳液，在恒壓120V下進(jìn)行電泳；e)電泳30min后將凝膠取出，置于凝膠成像儀中，觀(guān)察PCR結(jié)果。8結(jié)果判定8.1檢測(cè)結(jié)果成立條件1DB50/T1244—2022陽(yáng)性對(duì)照PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后在264bp出現(xiàn)目的條帶，陰性對(duì)照PCR產(chǎn)物電泳后沒(méi)有條帶；檢測(cè)結(jié)果成立。判定圖見(jiàn)附錄C。8.2結(jié)果描述及判定8.2.1在檢測(cè)結(jié)果成立的前提下，如果檢測(cè)樣品中PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后在264bp的位置上出現(xiàn)一條特異性條帶，判為陽(yáng)性，即該樣品為化膿隱秘桿菌核酸陽(yáng)性。8.2.2在檢測(cè)結(jié)果成立的前提下，如果檢測(cè)樣品中PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后在264bp的位置上未出現(xiàn)一條特異性條帶，判為陰性，即該樣品為化膿隱秘桿菌核酸陰性。8.2.3如果陽(yáng)性對(duì)照無(wú)相應(yīng)的目的條帶，可能是存在操作失誤，該檢測(cè)需要重新進(jìn)行；如果陰性對(duì)照有相應(yīng)的目的條帶，可能是陰性對(duì)照存在污染或是操作失誤，該檢測(cè)需要重新進(jìn)行。9廢棄物處理檢測(cè)過(guò)程中的廢棄物，應(yīng)做好無(wú)害化處理，應(yīng)符合GB19489的要求。2(資料性)化膿隱秘桿菌plo基因DNA片段序列及引物在靶基因中的位置見(jiàn)圖A.1。CTAGGGTTTAACATTTTCCTCGACCCAGGGATTGAGCGTCGTACCCTTAplo-F→TCTTGTTGATAACGGTCCACCACGGATCCCACGCTAGACCTGTCGCCGGATGTTGCGGGCGTTTGCCGGAAGTTGAATAGTCTCGCGGAACCCAATTCCCACTCCACGTCTTGGGGGTGCGGATCTCCTTACCCTGCGGGTCGTCTCGTCCCACTTCAGCCTGAACTTCGCGACGTAGCCACCGCCATGGCGGplo-R→ACCAGACTTGTAGGTCGTGGCAGTGGTTTCAATGTAATCACCGCTGCTCCTAACAGCTGCCAGCTGGTTATCCTTCAAGAAATTGACGGCATAGGAAACGGGCACGGCAGGAGAGAAGGTACTCTCCTCCTTGATAATCTTCTTG3DB50/T1244—2022（規(guī)范性）試劑的配制B.1TSA固體培養(yǎng)基（1L）稱(chēng)取本品40.0g于1L蒸餾水中，微溫溶解，121℃高壓滅菌15min；取出涼至55℃,無(wú)菌條件，按8%比例加入小牛血清，輕搖混勻后制備平板，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀(guān)察有無(wú)菌落，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)即可備用。B.2TSB液體培養(yǎng)基（1L）稱(chēng)取本品30.0g于1L蒸餾水中，微溫溶解，121℃高壓滅菌15min；取出涼至55℃,無(wú)菌條件，按8%比例加入小牛血清，混勻后分裝，備用。B.3TAE電泳緩沖液（pH約8.5）的配制稱(chēng)取三羥甲基氨基甲烷（Tri