葡萄糖含量檢測(cè)試劑盒Pro實(shí)驗(yàn)解決方案

葡萄糖含量檢測(cè)試劑盒Pro實(shí)驗(yàn)解決方案原理葡萄糖是幾乎所有生物體的主要能量來(lái)源。血糖水平是許多代謝性疾病的關(guān)鍵診斷參數(shù)。葡萄糖的檢測(cè)在研究和藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程中都非常重要。CheKine?Pro葡萄糖含量檢測(cè)試劑盒（熒光法）可檢測(cè)動(dòng)植物組織，細(xì)胞、血清（漿）、唾液、尿液、體液等生物樣本。在該試劑盒中，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，并產(chǎn)生過(guò)氧化氫，在過(guò)氧化物酶作用下，催化過(guò)氧化氫與無(wú)熒光物質(zhì)反應(yīng)生成有熒光的物質(zhì)（Ex/Em=535/590nm），與葡萄糖的量成正比。自備耗材·熒光酶標(biāo)儀(激發(fā)波長(zhǎng)535nm，發(fā)射波長(zhǎng)590nm)·96孔全黑板、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭·恒溫箱、制冰機(jī)、低溫離心機(jī)·去離子水·勻漿器或研缽（如果是組織樣本）試劑準(zhǔn)備AssayBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫。-20℃保存。ReagentI：即用型；使用前，平衡到室溫。-20℃避光保存。用不完的試劑-20℃避光分裝保存6個(gè)月，避免反復(fù)凍融。注意：ReagentI有毒，建議在通風(fēng)櫥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。ReagentII：即用型；-20℃避光保存。ReagentIII：即用型；-20℃避光保存。WorkingReagent：每孔準(zhǔn)備50μL工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。按照AssayBuffer：ReagentI：ReagentII：ReagentIII=4,840μL：50μL：10μL：100μL的比例，混合均勻。Standard(400nmol/mL)：即用型；使用前，平衡到室溫。-20℃避光保存。用不完的試劑-20℃避光分裝保存6個(gè)月，避免反復(fù)凍融。標(biāo)準(zhǔn)品制備：4nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品：10μLStandard用990μLAssayBuffer稀釋；使用4nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品，按照下表所示，進(jìn)一步稀釋成標(biāo)準(zhǔn)品：序號(hào)Standard體積（μL）AssayBuffer體積（μL）濃度（nmol/mL）Std.112.5μL4nmol/mLStandard987.550Std.2500μLofStd.1(50nmol/mL)50025Std.3500μLofStd.2(25nmol/mL)50012.5Std.4500μLofStd.3(12.5nmol/mL)5006.25Std.5500μLofStd.4(6.25nmol/mL)5003.125Std.6500μLofStd.5(3.125nmol/mL)5001.5625Std.7500μLofStd.6(1.5625nmol/mL)5000.78125Blank05000注意：每次實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)使用新配制的標(biāo)準(zhǔn)品；配制好的標(biāo)準(zhǔn)品需要在4h之內(nèi)使用。樣本制備注意：建議使用新鮮樣本。如果不立即使用，可將樣品在-80℃下保存一個(gè)月。測(cè)定時(shí)，應(yīng)控制解凍的溫度和時(shí)間。室溫環(huán)境下解凍時(shí)，需在4h內(nèi)完成樣品解凍。組織：稱取約0.1g樣本，加入1mLAssayBuffer，用勻漿器或研缽冰浴勻漿，10,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測(cè)。細(xì)胞：收集500萬(wàn)細(xì)胞到離心管內(nèi)，用冷PBS清洗細(xì)胞，離心后棄上清，加入1mLAssayBuffer，冰浴超聲波破碎細(xì)胞5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復(fù)30次），然后10,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測(cè)。血清（漿）等液體樣本：10,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測(cè)。在進(jìn)行檢測(cè)前，請(qǐng)依據(jù)下表對(duì)樣本進(jìn)行稀釋，稀釋液為AssayBuffer（僅供參考）：胡蘿卜100-300兔肝臟100-400小鼠肌肉5-20HT29細(xì)胞5-20胎牛血清100-300Jurkat細(xì)胞培養(yǎng)液50-200唾液1-3尿液2-5注意：如需測(cè)定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號(hào)：KTD3001的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）進(jìn)行樣本蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。實(shí)驗(yàn)步驟熒光酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)激發(fā)波長(zhǎng)到535nm，發(fā)射波長(zhǎng)到590nm。操作表（下述操作在96孔全黑板中操作）：試劑空白孔（μL）標(biāo)準(zhǔn)孔（μL）測(cè)定孔（μL）樣本0050Standard0500AssayBuffer5000WorkingReagent505050充分混勻，37℃反應(yīng)15min，記錄各孔的熒光值RFU，熒光激發(fā)波長(zhǎng)535nm，熒光發(fā)射波長(zhǎng)590nm，空白孔記為RFU空白，標(biāo)準(zhǔn)孔記為RFU標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定孔記為RFU測(cè)定。計(jì)算ΔRFU測(cè)定=RFU測(cè)定-RFU空白，ΔRFU標(biāo)準(zhǔn)=RFU標(biāo)準(zhǔn)-RFU空白。注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需做1-2次。實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本稀釋成不同濃度做預(yù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，結(jié)合本試劑盒的線性范圍：0.1-50μM，選擇合適的稀釋倍數(shù)對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果計(jì)算注意：我們?yōu)槟峁┑挠?jì)算公式，包括推導(dǎo)過(guò)程計(jì)算公式和簡(jiǎn)潔計(jì)算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡(jiǎn)潔計(jì)算公式為最終計(jì)算公式。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為x軸，ΔRFU標(biāo)準(zhǔn)為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程，將ΔRFU測(cè)定帶入方程得到x(nmol/mL)。葡萄糖含量的計(jì)算：按樣本蛋白濃度計(jì)算葡萄糖(nmol/mgprot)=x÷Cpr×F按樣本鮮重計(jì)算：葡萄糖(nmol/g鮮重)=x÷(W÷V樣總)×F=x÷W×F按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算葡萄糖(nmol/104cell)=x÷(n÷V樣總)×F=x÷n×F按樣本體積計(jì)算：葡萄糖(nmol/mL)=x×FV樣總：加入AssayBuffer體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；n：細(xì)胞數(shù)量，以萬(wàn)計(jì)；F：樣本稀釋倍數(shù)。注意事項(xiàng)ReagentⅠ具有光敏性，使用和保存需嚴(yán)格避光。如果WorkingReagent出現(xiàn)紅色，可先對(duì)Standard進(jìn)行檢測(cè)，若Blank孔熒光值大于Std.7(0.78125nmol/mL)，則WorkingReagent失效，反之可以繼續(xù)使用。每次檢測(cè)都需要建立新的標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果RFU測(cè)定較低或ΔRFU測(cè)定為負(fù)值，可適當(dāng)減少樣本稀釋倍數(shù)或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，但不得超過(guò)30min。如果樣本測(cè)不出值，建議取新鮮樣本，重新檢測(cè)。結(jié)果展示以下數(shù)據(jù)僅供參考，實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。Figure1.(a)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。(b)本試劑盒測(cè)定胡蘿卜和兔肝臟中葡萄糖的含量。(c)本試劑盒測(cè)定胎牛血清、Jurkat細(xì)胞培養(yǎng)液和尿液中葡萄糖的含量。相關(guān)產(chǎn)品Cata