21三體綜合征產(chǎn)前診斷

21三體綜合征產(chǎn)前診斷From臨床17班小組案例張某，女，31歲，商場收銀員，懷孕16周，擔(dān)心所孕胎兒不正常，前來進(jìn)行遺傳咨詢。經(jīng)詢問得知，張某的一表姐曾生育一智力低下兒子，經(jīng)某醫(yī)院診斷為先天愚型，但具體核型不詳。張某孕前檢查各項(xiàng)優(yōu)生指標(biāo)均正常，孕前無感冒服藥史，無有毒有害物質(zhì)接觸史。張某的丈夫，32歲，司機(jī)，有煙酒嗜好，在妻子懷孕前半年已戒酒，減少吸煙量。兩人核型檢查均正常，家族中其他特殊疾病患者。根據(jù)張某的情況，作中孕期唐氏篩查，結(jié)果張某血清的AFP,hCG和uE3檢查結(jié)果陽性。根據(jù)上述資料和風(fēng)險(xiǎn)評估，張某所孕胎兒具有21三體綜合癥的高風(fēng)險(xiǎn)，建議進(jìn)行產(chǎn)前診斷。

孕婦就診

常規(guī)篩查綜合分析風(fēng)險(xiǎn)值孕期檢查進(jìn)一步確診羊膜穿刺熒光原位雜交技術(shù)PCR技術(shù)結(jié)果分析遺傳建議羊膜穿刺離心實(shí)驗(yàn)流程：羊膜穿刺---羊水中有一定數(shù)量胎兒脫落細(xì)胞（多為成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞）,經(jīng)體外培養(yǎng)后,可進(jìn)行染色體分析.酶和蛋白質(zhì)檢測性、染色體檢查和提取DNA作基因分析，也可不經(jīng)培養(yǎng)，用微量技術(shù)作酶和蛋白質(zhì)分析或直接提取DNA作基因診斷。時(shí)間：妊娠16~20周步驟：（B超監(jiān)視下進(jìn)行）孕婦排空膀胱—腰穿針穿刺—穿過腹壁和子宮 壁進(jìn)入羊膜腔—抽取羊水熒光原位雜交（FISH）FISH的基本原理是將DNA(或RNA)探針用特殊的核苷酸分子標(biāo)記,然后將探針直接雜交到染色體或DNA纖維切片上,再用與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體與探針分子特異性結(jié)合來檢測DNA序列在染色體或DNA纖維切片上的定性、定位、相對定量分析.材料

儀器

離心機(jī)，水浴鍋，恒溫培養(yǎng)箱，熒光顯微鏡。試劑

熒光探針。工作液的配制：（1）20×SSC：氯化鈉175g，檸檬酸三鈉88.2g，加三蒸水到1000ml。（2）變性液：甲酰胺28ml，20×SSC 4ml，蒸餾水8ml，終體積40ml，充分混勻，調(diào)整pH至7.0～8.0,密封保 存于4℃～8℃,每次使用前均需測定pH值。（3）洗脫液：甲酰胺 20ml，20×SSC4ml，蒸餾水16ml，終體積40ml。（4）SSCT： 20×SSC100ml，Tween-200.2ml，加二蒸水至終體積為1000ml。方法1.羊水細(xì)胞涂片的制備

抽取羊水5～6ml，1500rpm離心10min，去上清，留羊水細(xì)胞沉淀；在細(xì)胞沉淀中加3ml0.25%trypsin（溶于無CaCl2的Hanks液），37℃消化30min；2000rpm離心10min，去上清，在沉淀中加入4～5ml0.75mol/LKCl,37℃孵育30min，再加入1ml固定液（甲醇∶冰醋酸為3∶1），輕輕混勻，2000rpm離心10min，去上清，加5ml固定液，輕輕混勻，2000rpm離心10min，去上清，加適量固定液，滴片。

2.雜交、洗脫、顯色

(1)將pH為7.0～7.5的變性液(70%甲酰胺/2×SSC)放入水浴中預(yù)熱至74℃,將一支干凈的溫度計(jì)插入變性液中以確認(rèn)溫度達(dá)到了74℃，注意冷玻片插入變性液中將降低變性液的溫度。(2)將玻片插入預(yù)熱的變性液中3～4min，不要搖動，然后迅速將玻片插入預(yù)冷至-20℃的酒精中，依次從70%、90%到100%酒精中各脫水2min。(3)將探針于37℃保溫5min，輕輕振動后短暫離心收集液體于管底（不要變性探針）。(4)用刻字筆將標(biāo)本周圍劃線，加上10μl探針。蓋上蓋玻片，在蓋玻片周圍封上一層rubbercement，將玻片置于濕盒中于37℃雜交過夜。熒光原位雜交技術(shù)(5)在水浴中預(yù)熱40ml洗脫液（50%甲酰胺/2SSC）至43℃，將一支干凈的溫度計(jì)插入洗脫液中證實(shí)溫度達(dá)到43℃。(6)用鑷子小心地除去rubbercement，小心揭開蓋玻片，將玻片插入洗脫液中洗脫10min，然后再重復(fù)一次。洗脫液的溫度對于信號強(qiáng)度與特異性非常關(guān)鍵，洗脫液溫度不能低于43℃。以免由于交叉雜交導(dǎo)致背景產(chǎn)生。(7)將玻片在37℃的2×SSC中洗脫2次，每次4min。(8)將玻片置于室溫SSCT液中洗脫2min。（9）將玻片取出，用紙巾從玻片邊沿吸過量的SSCT，不要讓玻片干掉，以免由于檢測試劑的非特異性結(jié)合導(dǎo)致高背景熒光。（10）在每塊玻片上加上30μlavidin-FITC，蓋上蓋玻片，37℃孵育20min。（11）小心去除蓋玻片，將玻片在室溫SSCT中洗脫3次，每次2mi（12）用紙巾從玻片邊沿吸過量的SSCT，加上30mlAnti-avidin于標(biāo)本上，蓋上蓋玻片，37℃孵育20min。（13）小心去除蓋玻片，在室溫的SSCT中洗脫3次，每次2min。（14）在每塊玻片上加上30μlavidin-FITC，蓋上蓋玻片，37℃孵育20min。（15）小心去除蓋玻片，在室溫的SSCT中洗脫3次，每次2min。（16）用紙巾從玻片邊沿吸過量的SSCT加上10μlDAPI，蓋上18mm×18mm蓋玻片，用一塊紙巾蓋上蓋玻片,小心擠壓紙巾以吸去多余的DAPI,注意不要移動蓋玻片。3.熒光顯微鏡下觀察.

如圖：顯示兩紅兩綠的熒光即為正常.

如圖：顯示三紅兩綠即為患者。PCR-SSLP技術(shù)選用21號染色體的6個(gè)具有高度多態(tài)性的短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）位點(diǎn)為遺傳標(biāo)記，應(yīng)用pcr—sslp技術(shù)，通過pcr擴(kuò)增和硝酸銀進(jìn)行檢測。方法步驟：取羊水2ml------處理離心-----沉淀保留DNApcr擴(kuò)增：配置擴(kuò)增體系，調(diào)整pcr循環(huán)參數(shù)電泳分離銀染-顯色-擴(kuò)增產(chǎn)物檢測結(jié)果 正常人在某一str位點(diǎn)可出現(xiàn)兩種情況：一．若為雜合子，pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示2條DNA帶，密度定量為1:1.二．若為純合子，pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示1條DNA帶。Down綜合征患者在某一str位點(diǎn)的檢測結(jié)果分3種情況：一，顯示為3條DNA帶，密定量比為1:1:1；二，顯示為2條DNA帶，密度定量比為2:1；三，顯示為1條DNA。前兩種提示：該str位點(diǎn)有3個(gè)等位基因，可對DOWN綜合征作出診斷。第三種提示：三個(gè)等位基因純合型，不能做出診斷，需結(jié)合其他STR位點(diǎn)的檢測結(jié)果綜合分析。本研究選6個(gè)STR位點(diǎn)分布于21號染色體長臂；D21S16位于21q11.1，D21S11位于21q22.1~q21；D21S1432位于21q21；D21S1437和D21S1270位于DSCR(關(guān)鍵區(qū)域)內(nèi)部，D21S1446位于21q23.30。因此，選用上述6個(gè)STR位點(diǎn)，尤其是D21S1437，D21S1270兩位點(diǎn)位于DSCR內(nèi)部，以它們作為遺傳標(biāo)記，采用PCR—SSLP的方法結(jié)合定量分析，可以確認(rèn)，細(xì)胞中21號染色體的數(shù)目或DSCR的數(shù)目，從而對由21三體及部分三體造成的DOWN綜合征作出診斷。先天愚型染色體核型分析核型特征一、若結(jié)果正常：核型：46，XX(XY)二、若結(jié)果異常：1、21三體型（約占92.5%）：有典型的臨床表現(xiàn)。核型：47，XX（XY），+21產(chǎn)生原因：父母之一配子發(fā)生時(shí)減數(shù)分裂過程中出現(xiàn)不分離的結(jié)果，大多數(shù)是母親卵子形成過程中發(fā)生了21號染色體不分離（95%）；父親精子形成中發(fā)生21不分離而致該病約占5%。2、易位型（約占5%）：有典型的臨床表現(xiàn)。

常見核型：46，XX（XY），-14，+t（14；21）（p11；q11）3、嵌合型（約占2.5%）：臨床癥狀可以很典型，也可以很輕，主要取決于正常細(xì)胞與異常細(xì)胞之間的比例。核型：46，XX（XY）/47，XX（XY），+21原因：正常的受精卵在胚胎發(fā)育早期卵裂過程中，發(fā)生21號染色體的不分離。

綜上總結(jié)給與遺傳建議：若經(jīng)過實(shí)驗(yàn)檢查診斷為21三體綜合癥，就目前的醫(yī)療水平而言，21-三體綜合征既沒有方法治愈也沒有方法預(yù)防，目前主