脂肪酶活檢測(cè)原理及方法

脂肪酶活檢測(cè)原理及實(shí)際方法：一、原理以及標(biāo)準(zhǔn)曲線做法1.對(duì)硝基苯酚酯（4-Nitrophenylester）是脂肪酶水解活力測(cè)定中運(yùn)用最為廣泛的一種底物，脂肪酶水解其產(chǎn)生pNP（對(duì)硝基苯酚）在堿性條件下顯黃色，在410nm下有吸光值，且靈敏度很高。2.所需試劑有：

CAS碳鏈長(zhǎng)度出貨號(hào)價(jià)格名稱830-03-5

C2

N8130-1G￥462

對(duì)硝基苯乙酸酯

2635-54-9C4

N9876-1G

￥570對(duì)硝基苯丁酸酯

1956-10-1

C8

21742-1G-F￥487對(duì)硝基苯辛酸酯

1956-11-2C12

61716-1G￥435對(duì)硝基苯月桂酸酯

1492-30-4

C16N2752-1G￥379對(duì)硝基苯棕櫚酸酯

14617-86-8

C18

N3627-1G

￥2621.97對(duì)硝基苯硬酸脂全部為色譜純?cè)噭?，?gòu)于sigma公司標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：a.標(biāo)準(zhǔn)對(duì)硝基苯酚母液(2mM，2mmol/L):稱取0.02789g的對(duì)硝基苯酚(p-NP)溶于100ml的溶液B（即不同pH的緩沖液），置于棕色試劑瓶?jī)?nèi)，4℃冰箱保存。方法一：b.標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別取0.02，0.04，0.06，0.08，0.12，0.16ml的對(duì)硝基苯酚母液(2mM)，用溶液B（即不同pH的緩沖液）稀釋至4ml，分別測(cè)定在410nm處的吸收值。以對(duì)硝基苯酚濃度x（對(duì)應(yīng)濃度分別是0.01，0.02，0.03，0.04，0.06，0.08，單位：mM）為橫坐標(biāo)，吸光值y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。方法二：全部對(duì)硝基苯酚經(jīng)過(guò)與測(cè)酶活相同的處理，獲得吸光度。b.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別取0、1.875、3.75、7.5、15、22.5、30、45μL的對(duì)硝基苯酚分別加入62.5、60.625、58.75、55、47.5、40、32.5、17.5μL的異丙醇和（全部都是）562.5的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r/min，3min，測(cè)出標(biāo)準(zhǔn)曲線。上表是方法一測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線脂肪酶酶活定義：在410nm下測(cè)定吸光值,以1min內(nèi)催化水解底物對(duì)硝基苯棕櫚酸酯(p-NPP)產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯酸(p-NP)所需的酶量為1個(gè)酶活單位(U)。公式y(tǒng)=14.474x+0.0272中x是p-NP的濃度(單位：mmol/l)，y是吸光值，14.474、0.0272是反應(yīng)系數(shù)，R2是相關(guān)系數(shù)。則，酶活計(jì)算公式為：酶活=1000*n*V*(y-0.0272)/14.474t其中n為稀釋倍數(shù)，t為反應(yīng)時(shí)間（單位：min），V為反應(yīng)體系的總體積（單位：L）、1000是mmol到μmol的比例。底物耐堿性測(cè)定及試驗(yàn)液配制底物耐堿性測(cè)定a.6種底物分別加至pH7，pH8的37℃的PBS緩沖液中（選擇37℃培養(yǎng)箱），每隔5min檢測(cè)一次顏色變化，拍照；b.6種底物分別加至pH8，pH9的Tris-HCl緩沖液中（37℃），每隔5min檢測(cè)一次顏色變化，拍照；c.分別加至pH9，pH10的Gly-NaOH緩沖液。測(cè)酶活所需要試劑的配制，酶活測(cè)定方法方法一：（96孔板法，粗略，速度快）溶液的配制溶液A：溶液A:30.0mg對(duì)硝基苯棕桐酸脂(p-NPP，Sigma，或者其他底物，337.52g/mol，即8.89*10-5mol)溶于10.00ml異丙醇（濃度為8.89*10-3M，或8.89mM），4℃棕色瓶（可以使用包錫箔紙的15ml離心管）保存，每10ml可用于單個(gè)酶500次測(cè)定；溶液B:緩沖液(pH緩沖液，可更改)100.0ml加入1滴TritonX-100，混勻，4℃保存。96孔板（220μL）：A液（底物液）：18μL↗體系液180（μL）+酶液（40μL）↘B液（pH緩沖液）：162μL此步驟中，底物再次被稀釋，濃度為0.889mM。123456789101112AC230空白C230平行C430空白C430C830空白C830C1230空白C1230C1630空白C1630BC230平行C230平行C430C430C830C830C1230C1230C1630C1630CC250空白C250C450空白C450C850空白C850C1250空白C1250C1650空白C1650DC250C250C450C450C850C850C1250C1250C1650C1650EC260空白C2