(高清版)DB32∕T 2570-2013 雞傳染性法氏囊R∕T-LAMP 診斷技術(shù)規(guī)程　

雞傳染性法氏囊RT-LAMP診斷技術(shù)規(guī)程DB32/T2570-2013為規(guī)范雞傳染性法氏囊RT-LAMP診斷技術(shù)規(guī)程，提高雞傳染性法氏囊病毒檢測的靈敏度、穩(wěn)定性、特異性，特制定本標準。本標準按GB/T1.1-2009《標準化工作導則第1部分：標準的結(jié)構(gòu)和編寫》要求編寫。本標準的附錄為規(guī)范性附錄。本標準由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院提出。本標準起草單位：江蘇省農(nóng)業(yè)科學院。本標準起草人：劉宇卓、李銀、黃欣梅、趙冬敏、韓凱凱、張敬峰。13.26xLoading3.10瓊脂糖3.12氯仿2按照DB13/T500商品肉雞傳染性法氏囊病防治技術(shù)規(guī)程中4.1流行特點、4.2臨床癥狀、4.3.1剖按照NY/T541-2002動物疫病實驗室檢驗采樣方法，病死或撲殺雞，無菌采集法氏囊及腎臟、肝臟組織，于0~4℃冷藏保存并立即送檢，采樣過程中樣品不得交叉污染。心10min,取上清備用。7.1RNA的提取取已處理的待檢樣品，以已知IBDV病毒為陽性對照，以無菌水為陰性對照，每管依次加入Trizol□600HL,振蕩混勻后，室溫放置10rpm,離心15min,取上層水相750H,加入500H異丙醇，混勻，-20℃放置15min,4℃10000rpm離心10min,去上清，緩緩加入75%乙醇1mL洗滌，4℃8000rpm離心5min,去上清，室溫干燥20min,加入DEPC水10HL,使充分溶解?；蚴褂肦NA提取試劑盒進行提取。7.2反應(yīng)條件FIP引物1.2μL,BIP引物1.2μL、F3引物0.15μL、B3引物0.15μL、BstDNA心混勻。60℃水浴60min,80℃滅活10min,4℃保存。7.3RT-LAMP結(jié)果觀察及判定7.3.1.1以陽性IBDV液作為陽性對照，以滅菌水作陰性對照，做RT-LAMP,所有反應(yīng)產(chǎn)物同時電泳。取RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物各8~10μL于1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳，電壓為120V,時間30～40min,紫外燈下觀7.3.1.2在陽性對照有梯狀目的條帶，陰性對照無條帶的情況下，檢測樣品出現(xiàn)與陽性對照相同梯狀7.3.2.2加入核酸染料后5～10min進行顯色判定。肉眼觀察反應(yīng)管，當陽性對照管液呈現(xiàn)綠色，陰性3DB32/T2570-20138結(jié)果判定當臨床上出現(xiàn)與第5條流行病學、臨床癥狀及剖檢變化相符的情況，可以初步判定為雞傳染性法氏8.2實驗室RT-LAMP結(jié)果的判定同7.3。如根據(jù)流行病學、臨床癥狀及剖檢變化可以初步臨床診斷為雞傳染性法氏囊病，結(jié)合實驗室1DB32/T2570-2013附錄A陽性樣品的制備本研究室分離、鑒定并保存的雞傳染性法氏囊病毒毒株。取保存毒株，用滅菌生理鹽水作1:50～100倍稀釋，接種9日齡~10日齡SPF雞胚尿囊膜，0.2mL/枚。置37℃恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)，每天照蛋觀察3次。棄去48h前死亡胚