第5章環(huán)境毒理學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法

第五章環(huán)境毒理學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法第一節(jié)急性毒性試驗(yàn)急性毒性

急性毒性(acutetoxicity)是指機(jī)體(人或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物)一次或24h之內(nèi)多次接觸(染毒)外源化學(xué)物之后，在短期內(nèi)所發(fā)生的毒性效應(yīng)，包括引起死亡效應(yīng)

所謂“一次或24內(nèi)多次”接觸或染毒的時(shí)間界定一次是指瞬間染毒，如經(jīng)口染毒、經(jīng)注射途徑染毒，但在經(jīng)呼吸道與經(jīng)皮膚染毒，則是指在一個(gè)特定的期間內(nèi)持續(xù)地接觸化學(xué)物的過程，所以“一次”含有時(shí)間因素當(dāng)外源化學(xué)物毒性過低，或一次染毒劑量受機(jī)體容量限制，需給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物較大劑量時(shí)，則可在24h內(nèi)分次染毒，即為“多次”?！岸唐趦?nèi)”，一般限定為7天內(nèi)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接觸外源化學(xué)物所引發(fā)的急性毒性效應(yīng)出現(xiàn)的快慢和毒性反應(yīng)的強(qiáng)度，因外源化學(xué)物的性質(zhì)（主要為化學(xué)結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)）和染毒劑量的大小而有很大差別。有的化學(xué)物在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接觸致死劑量后，幾分鐘之內(nèi)即可產(chǎn)生中毒癥狀，甚至瞬間死亡，有的化學(xué)物則在接觸致死劑量幾天才出現(xiàn)明顯的中毒癥狀或死亡急性毒性中毒癥狀與化學(xué)性質(zhì)和染毒劑量的關(guān)系

急性毒性試驗(yàn)的目的

急性毒性研究的目的，主要是探求化學(xué)物的致死劑量，以初步評(píng)估其對(duì)人類的可能毒害的危險(xiǎn)性。再者是求該化學(xué)物的劑量-反應(yīng)關(guān)系，為其它毒性實(shí)驗(yàn)打下選擇染毒劑量的基礎(chǔ)化學(xué)物質(zhì)的急性毒性分級(jí)毒性分級(jí)大鼠一次經(jīng)口

LD50（mg/kg）6只大鼠吸入4h死亡2～4只的濃度（ppm）兔涂皮時(shí)

LD50（mg/kg）對(duì)人可能致死量（g/kg）總量（g）

（60kg體重）劇毒＜1＜10＜5＜0.050.1高毒1-10-5-0.05-3中等毒50-100-44-0.5-30低毒500-1000-350-5-250微毒5000-10000-2180-＞15＞10001ppm=1mg/kg=1mg/L=1×10-6常用來表示氣體濃度，或者溶液濃度。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

毒理學(xué)中研究外源化學(xué)物的基礎(chǔ)毒性主要是進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)，即是以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為研究對(duì)象，最終向外源化學(xué)物毒害主體—人類外推不同種屬的動(dòng)物對(duì)同一受試物的毒性作用表現(xiàn)可有很大的差別，要獲得較可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，一般應(yīng)選用兩種以上的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。常選用大白鼠和小白鼠。根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，可選用不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物描述性動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究采用的體外試驗(yàn)研究的模型標(biāo)本包括某些離體臟器、組織切片、原代細(xì)胞、傳代培養(yǎng)細(xì)胞、組織勻漿、亞細(xì)胞組分，甚至昆蟲、細(xì)菌等

染毒途徑和方式

經(jīng)口染毒經(jīng)呼吸道染毒經(jīng)皮膚染毒其它途徑染毒

經(jīng)口染毒

灌胃喂飼吞咽膠囊灌胃

人工給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物灌入外源化學(xué)物是經(jīng)常使用的經(jīng)口染毒方法。此時(shí)外源化學(xué)物直接灌入胃內(nèi)，而不與口腔及食道接觸，故而給予的化學(xué)物劑量準(zhǔn)確。但是，當(dāng)待測(cè)化學(xué)物為氣態(tài)或固體時(shí)均需用某種溶劑溶解，液態(tài)化學(xué)物往往也需用溶劑溶解灌胃體積依所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物而定，小鼠一次灌胃體積在0.1～0.5ml/kg體重，大鼠在1.0ml/100g體重之內(nèi)，家兔在5ml/kg體重之內(nèi)，狗不超過50ml/10kg體重

喂飼

喂飼方法染毒是將化學(xué)物溶于無害的溶液中拌入飼料或飲用水中，使動(dòng)物自行攝入含化學(xué)物的飼料或水，然后依每日食入的飼料與水在推算動(dòng)物實(shí)際攝入化學(xué)物的劑量喂飼法的優(yōu)點(diǎn)是接觸化學(xué)物的方式符合人類接觸污染食物與水的方式,方法簡(jiǎn)便、易操作。但往往攝入的化學(xué)物量不準(zhǔn)確，僅適用于動(dòng)物數(shù)量較大的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)由于此種方法更適宜進(jìn)行多日染毒，急性毒性試驗(yàn)一般不用之吞咽膠囊

將所需劑量的受試化學(xué)物裝入藥用膠囊內(nèi)，強(qiáng)制放到動(dòng)物的舌后咽部迫使其咽下。此法劑量準(zhǔn)確，尤其適用于易揮發(fā)、易水解和有異臭的化學(xué)物。兔、貓及狗等較大動(dòng)物可用此法經(jīng)呼吸道染毒

凡是氣態(tài)或易揮發(fā)的液態(tài)化學(xué)物均有經(jīng)呼吸道吸入的可能，在生產(chǎn)過程中形成氣溶膠的化學(xué)物也可經(jīng)呼吸道吸入經(jīng)呼吸道染毒有兩種類型

動(dòng)物自行吸收靜式吸入染毒動(dòng)式吸入染毒人工動(dòng)物氣管注入將液態(tài)或固態(tài)外源化學(xué)物注入肺內(nèi)。這是一個(gè)手術(shù)過程，僅適用于制造化學(xué)物對(duì)肺臟損傷模型的制備，而不用于一般毒性研究

經(jīng)皮膚染毒

研究外源化學(xué)物的經(jīng)皮吸收時(shí)，皮膚接觸化學(xué)物的面積、時(shí)間長(zhǎng)短、環(huán)境中溫、濕度均應(yīng)控制統(tǒng)一的條件為保證不因皮膚部位不同而形成的化學(xué)物滲透率差異，一般大鼠、豚鼠、兔均使用背部皮膚其它途徑染毒

有時(shí)需對(duì)外源化學(xué)物進(jìn)行絕對(duì)毒性或比較毒性研究，或進(jìn)行一些必要的特殊研究(如靜脈注射毒物動(dòng)力學(xué)、代謝研究、急救藥物篩選等)，往往用注射途徑染毒注射途徑包括靜脈注射(大鼠、小鼠尾靜脈，兔耳緣靜脈)、肌肉注射、皮下注射及小動(dòng)物腹腔注射染毒。但注射時(shí)應(yīng)控制注射體積毒性反應(yīng)的觀察與檢查

根據(jù)急性毒性試驗(yàn)的目的，受試動(dòng)物給予受試物后，應(yīng)即刻密切觀察各組動(dòng)物發(fā)生的毒性反應(yīng)（全身的或局部的）情況，中毒癥狀的特點(diǎn)和出現(xiàn)時(shí)間，中毒癥狀恢復(fù)時(shí)間，動(dòng)物發(fā)生中毒死亡的時(shí)間及死亡數(shù)，死亡動(dòng)物必須的病理解剖檢查觀察等試驗(yàn)的觀察期限，如受試動(dòng)物于接觸受試物后24～48h內(nèi)中毒死亡，未發(fā)現(xiàn)有遲發(fā)中毒作用時(shí)，一般觀察7～14d即可

急性毒性常用指標(biāo)

急性致死毒性最常用的指標(biāo)是LD50，它是經(jīng)過統(tǒng)計(jì)處理計(jì)算得出的數(shù)值，與LD100、LD0等相比有更高的重現(xiàn)性

LD50表示一種外源化學(xué)物引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡一半的劑量(或濃度）非致死性急性毒性

為了克服致死性急性毒性只能提供死亡指標(biāo)這一缺點(diǎn)，非致死性急性毒性的概念顯得比較重要，它可提供常規(guī)的非致死急性中毒的安全界限和對(duì)急性中毒的危險(xiǎn)性估計(jì)

LD50的測(cè)定

測(cè)定LD50常選用成年小鼠和大鼠兩個(gè)種屬，有時(shí)需選用其它種屬。無特殊要求，雌雄兩性各半正式試驗(yàn)時(shí)一般每組10只動(dòng)物，在預(yù)測(cè)的LD100及LD0之間安排5～7個(gè)劑量組

LD50值的計(jì)算有多種方法，大體上可以歸納為兩大類，其一是死亡率—?jiǎng)┝糠磻?yīng)相關(guān)要求為正態(tài)分配的，其中概率單位圖解法和寇氏法(Karber)較為常用。另一類是不要求為正態(tài)分布的（非正態(tài)分布），計(jì)算時(shí)只查對(duì)有關(guān)表格即可得到LD50寇氏法

此法計(jì)算LD50較為簡(jiǎn)便，但實(shí)驗(yàn)要符合下列條件：各個(gè)實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物數(shù)相同各組劑量要按等比級(jí)數(shù)分組最大劑量的死亡率最好為100%或與之接近，最小劑量的死亡率為0%或與之接近計(jì)算公式

LogLD50=Xm-i(∑P-0.5)

式中Xm—最大劑量的對(duì)數(shù)值

i—相鄰劑量比值的對(duì)數(shù)∑P—各組死亡率的總和（以小數(shù)表示）急性毒性分級(jí)

為了粗略表示外源化學(xué)物急性毒性的強(qiáng)弱和其對(duì)人的潛在危害程度，國際上提出了外源化學(xué)物的急性毒性分級(jí)（acutetoxicityclassification）。但分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)并未完全統(tǒng)一我國目前除參考使用國際上幾種分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)之外，又于1978年提出了相應(yīng)的暫行標(biāo)無論我國或國際上急性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)都還存在著不少缺點(diǎn)，有待逐步改進(jìn)農(nóng)藥的急性毒性分級(jí)

工業(yè)毒物急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

WHO推薦的外源化學(xué)物急性毒性五級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

LD50影響因素

試驗(yàn)動(dòng)物的內(nèi)外環(huán)境各種因素的影響試驗(yàn)人員操作熟練程度受試化學(xué)物的濃度或稀釋倍數(shù)的影響同一外源化學(xué)物在同一品系動(dòng)物和同樣接觸途徑所測(cè)定的LD50值也會(huì)有一定差異，甚至可有2～3倍的波動(dòng)范圍急性毒作用帶(acuteeffectzone，Zac)

LD50

Zac=Limac

式中：LD50代表毒性上限，Limac

急性閾劑量代表毒性下限。

Zac值的大小可反映急性閾劑量距離LD50的寬窄。Zac值越大表明化合物引起急性死亡的危險(xiǎn)性越小，反之表明引起急性死亡的危險(xiǎn)性越大

非致死性急性毒性

急性毒性只能提供死亡指標(biāo)，非致死性急性毒性可提供常規(guī)的非致死急性中毒的安全界限和對(duì)急性中毒的危險(xiǎn)性估計(jì)非致死性急性毒性試驗(yàn)要求測(cè)定急性毒作用閾（Limac）。毒性效應(yīng)是一種或多種毒性癥狀或生理生化指標(biāo)改變。對(duì)于某些生理生化的改變，如體重、體力或酶活性等，Limac是指均值與對(duì)照組比較時(shí)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的最低劑量非致死性急性毒性實(shí)驗(yàn)觀察效應(yīng)很多，首先明確觀察效應(yīng)

第二節(jié)蓄積性毒性試驗(yàn)

毒物蓄積性的定義

外源化學(xué)物進(jìn)人機(jī)體后，經(jīng)過代謝轉(zhuǎn)化以后代謝產(chǎn)物或者以未經(jīng)代謝轉(zhuǎn)化的原形母體化學(xué)物排出體外。但是當(dāng)化學(xué)物反復(fù)多次染毒動(dòng)物，而且化學(xué)物進(jìn)入機(jī)體的速度或總量超過代謝轉(zhuǎn)化的速度與排出機(jī)體的速度或總量時(shí)，化學(xué)物或其代謝產(chǎn)物就可能在機(jī)體內(nèi)逐漸增加并貯留某些部位。這種現(xiàn)象就稱為化學(xué)物的蓄積作用(cumulation)，大多數(shù)蓄積作用會(huì)產(chǎn)生蓄積毒性

蓄積毒性（cumulativetoxicity）

蓄積毒性是指低于一次中毒劑量的外源化學(xué)物，反復(fù)與機(jī)體接觸一定時(shí)間后致使機(jī)體出現(xiàn)的中毒作用一種外源化學(xué)物在體內(nèi)蓄積作用的過程，表現(xiàn)為物質(zhì)蓄積和功能蓄積。物質(zhì)蓄積和功能蓄積往往是同時(shí)存在又互為基礎(chǔ)，在實(shí)際工作中常難于嚴(yán)格區(qū)別外源化學(xué)物在機(jī)體內(nèi)所產(chǎn)生的蓄積作用是引起亞慢性毒性作用和慢性毒性作用的基礎(chǔ)受試物的蓄積毒性強(qiáng)弱是評(píng)估它的毒性作用指標(biāo)之一，也是制定衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)時(shí)選用安全系數(shù)大小的重要參考依據(jù)物質(zhì)蓄積

物質(zhì)蓄積指外源化學(xué)物反復(fù)進(jìn)入機(jī)體內(nèi)，在體內(nèi)的吸收量大于排出量，并在體內(nèi)逐漸積累的過程物質(zhì)蓄積可以用化學(xué)方法測(cè)得機(jī)體內(nèi)(或某些組織臟器內(nèi))存在該化學(xué)物母體或其代謝產(chǎn)物，例如重金屬鉛、汞、錳等，又如DDT代謝物功能蓄積

功能蓄積指不斷進(jìn)入機(jī)體的外源化學(xué)物，對(duì)機(jī)體反復(fù)作用并引起功能發(fā)生改變累積加重，最后導(dǎo)致出現(xiàn)損害作用的過程。功能蓄積往往測(cè)不出該物質(zhì)，如某些有機(jī)溶劑、有機(jī)磷化合物等評(píng)價(jià)毒物蓄積性的方法

※蓄積系數(shù)法

☆固定劑量法

☆遞增劑量法

※生物半減期法※蓄積率測(cè)定法蓄積系數(shù)法

蓄積系數(shù)是指多次染毒使半數(shù)動(dòng)物出現(xiàn)毒性效應(yīng)的總有效劑量(ED50（n）或LD50（n)與一次染毒的半數(shù)有效量（ED50（1）或LD50（1））之比值，毒性效應(yīng)包括死亡蓄積系數(shù)法的原理是在一定期限內(nèi),以低于致死劑量(＜LD50)的劑量，每日給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染毒，直至出現(xiàn)預(yù)計(jì)的毒性效應(yīng)(如半數(shù)動(dòng)物死亡)為止，然后計(jì)算蓄積系數(shù)(cumulativecoe-fficient,Kcum)半數(shù)有效量（mediaeffectivedose,ED50）指某一物質(zhì)使50%的試驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生效應(yīng)的劑量

蓄積毒性分級(jí)

Kcum蓄積毒性強(qiáng)度

﹤

1高度蓄積

1～明顯蓄積

3～中等蓄積

5～輕度蓄積固定劑量法

取大鼠或小鼠，以灌胃或腹腔注射給予受試化學(xué)物。先求其LD50，再以相同條件將40只或以上動(dòng)物，雌雄各半，均分兩組，一為染毒組，一為對(duì)照組對(duì)受試動(dòng)物按1/10～1/20ED50（1）（LD50（1））的固定劑量，連續(xù)每天進(jìn)行染毒一次，觀察記錄受試動(dòng)物出現(xiàn)的某種毒性效應(yīng)或反應(yīng)情況固定劑量法評(píng)價(jià)蓄積作用的方法

當(dāng)染毒劑量累計(jì)達(dá)到相當(dāng)5倍ED50（1）或LD50（1）以上時(shí)，若受試動(dòng)物中出現(xiàn)某種毒性效應(yīng)或死亡動(dòng)物數(shù)未超過半數(shù)，此時(shí)的蓄積系數(shù)已大于5，表明該受試物的蓄積毒性作用不明顯如果染毒過程中受試物中相繼出現(xiàn)某種毒性效應(yīng)或死亡的動(dòng)物數(shù)累計(jì)達(dá)到50%，此時(shí)算出受試物累計(jì)的染毒總劑量，按上述公式即可計(jì)算出受試物的蓄積毒性系數(shù)遞增劑量法

以4d為一期，開始第一期每天染毒劑量為1/10ED50或LD50，隨后染毒劑量每隔4d按1.5倍遞增一次定期遞增染毒劑量*表

染毒日期（天）每日染毒劑量

每4天染毒總劑量

累計(jì)染毒總劑量

1～40.100.40.45～80.150.61.09～120.220.91.913～160.341.43.317～200.502.05.3

注：表中的遞增染毒劑量*為×ED50或LD50

遞增劑量法評(píng)價(jià)蓄積作用的方法

如果連續(xù)染毒已達(dá)20d，此時(shí)染毒的總劑量已累計(jì)達(dá)到5.30倍的ED50或LD50，受試動(dòng)物中出現(xiàn)某種毒性效應(yīng)或死亡的動(dòng)物數(shù)未達(dá)到50%，則表示該受試物的蓄積毒性不明顯，試驗(yàn)可以終止如受試物在試驗(yàn)過程中，相繼出現(xiàn)的某種毒性效應(yīng)或死亡的動(dòng)物數(shù)累積達(dá)到50%，即可計(jì)算出蓄積系數(shù)并可對(duì)蓄積毒性強(qiáng)度作出評(píng)估生物半減期法

生物半減期（biologicalhalftime，簡(jiǎn)稱T1/2）指進(jìn)入機(jī)體的外來化學(xué)物質(zhì)通過機(jī)體的生物轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)化作用過程而被消除一半所需要的時(shí)間生物半減期法是用毒物動(dòng)力學(xué)原理來描述外源化學(xué)物的體內(nèi)蓄積作用外源化學(xué)物在機(jī)體內(nèi)蓄積的速度和量與單位時(shí)間內(nèi)機(jī)體對(duì)受試化學(xué)物的吸收速度、清除速度有關(guān)生物半減期的測(cè)定

在實(shí)際觀測(cè)中，常常僅以間接測(cè)定它們?cè)谘?、尿液或器官組織中的濃度（或量）降低一半所需的時(shí)間，來代表該物質(zhì)的生物半減期通常的方法是機(jī)體接觸受試物后，在一定時(shí)間的間隔內(nèi)，分別測(cè)定血液或尿液、器官組織中該物質(zhì)的濃度（或量），依據(jù)所得結(jié)果按下式求出它的生物半減期生物半減期（T1/2）

=（t2

–t1）log2/（logy1–

logy2）

式中：y1和y2—分別為給受試物后在t1和t2時(shí)間取樣測(cè)定的該物質(zhì)的含量。根據(jù)測(cè)定生物半減期的長(zhǎng)短，判定受試物的蓄積毒性大小蓄積率測(cè)定法

蓄積率(cumulativepercent)測(cè)定法，常用的動(dòng)物為小鼠或大鼠首先將受試動(dòng)物分成蓄積和對(duì)照兩大組，每組60～70只。蓄積組動(dòng)物每次按一定劑量(低于最小致死量)按同一給毒途徑預(yù)先給受試物，經(jīng)過一定時(shí)間之后，按常規(guī)方法測(cè)定蓄積組和對(duì)照組的LD50，并按下式計(jì)算蓄積率:

蓄積率=（對(duì)照組LD50-蓄積組LD50）/蓄積組預(yù)給受試物的總劑量×100%蓄積率應(yīng)標(biāo)明預(yù)先給受試物的時(shí)間及劑量，在相同時(shí)間及劑量條件下，蓄積率越大則表示該物質(zhì)在體內(nèi)的蓄積作用越強(qiáng)，反之則越弱。第三節(jié)亞慢性和慢性毒性試驗(yàn)

亞慢性與慢性毒性試驗(yàn)的重要性

通常情況下，人類對(duì)生活和生產(chǎn)環(huán)境中的有害化學(xué)和生物因素接觸水平較低，不至于發(fā)生急性中毒，卻在長(zhǎng)期反復(fù)接觸中發(fā)生慢性中毒另外，雖有些化學(xué)物測(cè)不出急性毒性或急性毒性極低，但卻有慢性毒性

亞慢性毒性試驗(yàn)

亞慢性毒性(也稱亞急性毒性)指機(jī)體在相當(dāng)于1/20左右生命期間，少量反復(fù)接觸某種有害化學(xué)和生物因素所引起的損害作用研究受試動(dòng)物在其1/20左右生命時(shí)間的，少量反復(fù)接觸受試物后所致?lián)p害作用的實(shí)驗(yàn)，稱亞慢性毒性試驗(yàn)(subchronictoxicitytest)或亞急性毒性試驗(yàn)(subacutetoxicitytest）

以大鼠為例，平均壽命為兩年，即24個(gè)月，因此，亞慢性毒作用試驗(yàn)的接觸期為1～2個(gè)月左右

亞慢性毒性試驗(yàn)?zāi)康?/p>

急性毒性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察受試物對(duì)機(jī)體的主要毒性作用及毒作用的靶器官，并對(duì)最大無作用劑量及中毒閾劑量作出初步確定亞慢性毒性試驗(yàn)的結(jié)果，可為慢性試驗(yàn)設(shè)計(jì)選定最適觀測(cè)指標(biāo)及劑量提供直接的參考

慢性毒性試驗(yàn)(chronictoxicitytest）

慢性毒性是指外源化學(xué)物質(zhì)長(zhǎng)時(shí)間（大于1/10生命期）少量反復(fù)作用于機(jī)體后所引起的損害作用。研究受試動(dòng)物長(zhǎng)時(shí)間少量反復(fù)接觸受試物后，所致?lián)p害作用的試驗(yàn)稱慢性毒性試驗(yàn)(chronictoxicitytest），亦稱長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)(longtermtoxicitytest)要求試驗(yàn)動(dòng)物生命的大部分時(shí)間或終生長(zhǎng)期接觸受試物。各種試驗(yàn)動(dòng)物壽命長(zhǎng)短不同，慢性毒性試驗(yàn)的期限也不相同貴州省織金縣青壯漢拄拐杖--氟慢性中毒30歲的人60歲的肺-一名工人展示自己體檢的胸片因矽肺病死亡丈夫的遺孀合影

慢性毒性試驗(yàn)的主要目的

確定化學(xué)物毒性下限，即確定機(jī)體長(zhǎng)期接觸該化學(xué)物造成機(jī)體受損害的最小作用劑量(閾劑量)和對(duì)機(jī)體無害的最大無作用劑量為制定外源化學(xué)物的人類接觸安全限量標(biāo)準(zhǔn)提供毒理學(xué)依據(jù)

如最大容許濃度，每日容許攝入量（acceptabledailyintake，簡(jiǎn)稱ADI，以mg/kg體重d表示）等

最大耐受劑量(MTD)

在亞慢性或慢性試驗(yàn)條件下，在此劑量下實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無死亡，且無任何可察覺的中毒癥狀但是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可以出現(xiàn)體重下降，不過其體重下降的幅度不超過同期對(duì)照組體重的10%的最大劑量慢性毒作用帶(chroniceffectzone，Zch)

以急性毒性閾值(Limac)與慢性毒性閾值(Limch)比值表示外源化學(xué)物慢性中毒的可能性大小比值越大表明越易于發(fā)生慢性毒害實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的原則

試驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)分組及劑量選擇接觸途徑指標(biāo)觀察與測(cè)量

試驗(yàn)動(dòng)物

亞慢性試驗(yàn)、慢性試驗(yàn)首先要考慮對(duì)受試物敏感的動(dòng)物種屬和品系應(yīng)考慮到被選用的動(dòng)物供應(yīng)方便，價(jià)格適中，易于飼養(yǎng)管理。最常用的動(dòng)物有大鼠、小白鼠、狗和家兔，其次貓、琢鼠、猴等亦可供使用。一般要求選擇兩種試驗(yàn)動(dòng)物，嚙齒類和非嚙齒類各一種試驗(yàn)動(dòng)物的性別一般要求雌雄各半長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)，應(yīng)選用年幼、初斷奶的動(dòng)物作為試驗(yàn)對(duì)象亞慢性毒性試驗(yàn)分組及劑量選擇

亞慢性毒性試驗(yàn)設(shè)一個(gè)對(duì)照組和3～4個(gè)劑量組以急性毒性的閾劑量為亞慢性毒性試驗(yàn)的最高劑量，或者以受試物的急性LD50值的1/10～1/5為最高劑量。最低劑量組動(dòng)物應(yīng)不出現(xiàn)毒性反應(yīng)接近亞慢性閾劑量水平，中間設(shè)1～2個(gè)劑量組

慢性毒性試驗(yàn)分組及劑量選擇亞慢性毒性試驗(yàn)設(shè)一個(gè)對(duì)照組和4～5個(gè)劑量劑量選擇可依據(jù)兩個(gè)途徑:以亞慢性毒性效應(yīng)的1/5～1閾劑量為慢性毒性試驗(yàn)的最高劑量，以亞慢性毒性效應(yīng)的1/50～1/10閾劑量為預(yù)計(jì)慢性閾劑量，以其1/100為最低劑量，在最高劑量與預(yù)計(jì)慢性閾劑量之間再加1～2個(gè)劑量組是以急性毒性效應(yīng)為出發(fā)點(diǎn)，以LD50(或LC50)為基礎(chǔ)，以l/10LD50為最高劑量，以1/100LD50為預(yù)計(jì)慢性閾劑量，以1/1000LD50為最低劑量。在1/10LD50與1/100LD50之間再加1～2個(gè)劑量組

接觸途徑

自然攝入但是如受試物有異味或易水解時(shí)，也可以用灌胃方式。為了保證給受試物的精確度，目前一般采用灌胃法，每日灌胃應(yīng)當(dāng)定時(shí)進(jìn)行。經(jīng)呼吸道吸入，每日吸入期時(shí)間的長(zhǎng)短依試驗(yàn)要求而定。對(duì)工業(yè)毒物進(jìn)行慢性毒性試驗(yàn)時(shí)，通常要求每日吸入4～6h。環(huán)境污染物一般要求每日吸入8h，甚至24h經(jīng)皮膚接觸一定要注意在每日固定的時(shí)間內(nèi)給相同的量。另外，根據(jù)人類接觸受試物的實(shí)際途徑，還可采用皮下、肌肉、靜脈、腹腔注射等，這些方法均可保證給予受試物較精確的量。受試物最好是每周7d連續(xù)給予，如試驗(yàn)期超過3個(gè)月時(shí)也可采用每周給6d。每天給受試物時(shí)間相同指標(biāo)觀察與測(cè)量

一般狀況指標(biāo)的觀察生物化學(xué)指標(biāo)的觀測(cè)病理學(xué)檢查分子生物學(xué)和免疫學(xué)指標(biāo)的測(cè)定檢測(cè)指標(biāo)的時(shí)間恢復(fù)期觀察各國測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)比較一般狀況指標(biāo)的觀察

中毒癥狀的觀察體重測(cè)量水和食物攝入量的觀測(cè)

生物化學(xué)指標(biāo)的觀測(cè)

肝臟功能腎臟功能血液學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)生物材料中受試物及其代謝產(chǎn)物的檢測(cè)病理學(xué)檢查

系統(tǒng)尸解臟器系數(shù)組織學(xué)檢查

臟器系數(shù)

是指某個(gè)臟器與單位體重之比值或稱臟/體比值。單位體重通常以100g體重計(jì),如肝/體比，即指(全肝濕重/體重)×100依據(jù)是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在到達(dá)成年末期或老年期之前,尤其是小動(dòng)物均隨著年齡的增加體重增長(zhǎng),且各臟器與體重之間的重量比值有一定規(guī)律若某臟器受到受試化學(xué)物損害,此比值將發(fā)生改變，在排除稱重前的失水、年齡、性別、營養(yǎng)不良等因素的影響后,臟器系統(tǒng)增大,表示臟器充血、水腫或增生肥大性變化等；臟器系數(shù)減小,表示臟器萎縮、退行性變化等一般包括心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、甲狀腺、睪丸、子宮、腦、前列腺等

第四節(jié)評(píng)價(jià)聯(lián)合毒性的方法

評(píng)價(jià)聯(lián)合毒性的方法

聯(lián)合毒性(jointaction或combinedeffect)指兩種或兩種以上毒物同時(shí)或前后相繼作用于機(jī)體而產(chǎn)生的毒性作用（已在第四章闡述）常用的方法：

聯(lián)合作用系數(shù)法等效應(yīng)線圖法

聯(lián)合作用系數(shù)法

混合化學(xué)物預(yù)期LD50計(jì)算公式

式中：A、B、------N，代表混合物中的各化合物；

a、b、------n，分別為各化合物在混合物中所占的比例，所以a+b+----+n=1.聯(lián)合作用系數(shù)法K值

通過動(dòng)物試驗(yàn)測(cè)定混合物的LD50，再求出混合物的預(yù)期LD50與實(shí)測(cè)混合物L(fēng)D50的比值，此比值即為K值如果各化學(xué)物是相加作用，則理論K值應(yīng)等于1，但由于測(cè)定LD50本身會(huì)有一定波動(dòng)，所以K值也會(huì)有一定波動(dòng)(K＝l±)。一般認(rèn)為K值在0.4～2.5之間表示相加作用；＜0.4表示拮抗作用；＞2.5表示協(xié)同作用等效應(yīng)線圖法

這種方法只能評(píng)定兩個(gè)化學(xué)物的聯(lián)合作用，具體步驟如下：

1、在同種試驗(yàn)動(dòng)物和相同接觸途徑條件下,分別算出兩種化學(xué)物(A和B)的LD50及其95%可信限，以縱座標(biāo)表示化學(xué)物A的劑量范圍，以橫座標(biāo)表示化學(xué)物B的劑量范圍，分別將兩種化學(xué)物在縱座標(biāo)與橫座標(biāo)上的LD50值及95%可信限的上下限值連成三條直線。

2、以等效應(yīng)劑量求出兩個(gè)化學(xué)物混合后的LD50值。

3、根據(jù)混合LD50，求出兩個(gè)化學(xué)物各含的實(shí)際劑量，分別在相應(yīng)的座標(biāo)線上找到各自的劑量位置，并由相應(yīng)劑量點(diǎn)作垂直線，視其交點(diǎn)所落的位置進(jìn)行評(píng)定。

4、如交點(diǎn)正好落在兩個(gè)化學(xué)物95%可信限的上下兩條線之間，表示為相加作用。如交點(diǎn)落到95%可信限下限以下，則表示為協(xié)同作用。如交點(diǎn)在95%可信限上限直線以外，則表示拮抗作用。

第五節(jié)致突變?cè)囼?yàn)

、、、基本概念

變異（variation）生物的個(gè)體和各代之間存在著種種差異突變（mutation）基于染色體和基因的變異才能夠遺傳，而遺傳變異稱為突變突變可分為：

自發(fā)突變(natural或sporadicmutation)和誘發(fā)突變(inducedmutation）誘發(fā)突變指由于物理、化學(xué)、生物等環(huán)境因素引起的突變誘發(fā)基因突變的原因物理因素有

X射線、γ射線、α射線、β射線、快中子和紫外線等

化學(xué)因素可大致分為烷化劑、堿基類似物、抗生素等，以及一些零星的化學(xué)誘變劑生物因素如黃曲霉毒素等突變的類型染色體畸變(chromosomeaberration)：

1、染色體數(shù)目的畸變

2、染色體結(jié)構(gòu)的畸變基因突變（genemutation）：

1、自然突變，又稱自發(fā)突變

（spontaneousmutation）

2、誘發(fā)突變（inducedmutation）

多Y綜合征

先天性卵巢發(fā)育不全癥（XO）

先天性卵巢發(fā)育不全癥（XO）21三體綜合征

基因突變的類型堿基置換（basesubstitution）

轉(zhuǎn)換（transition）

顛換（transvesion）移碼(frameshift)突變

顯性致死（非遺傳性改變）

接觸某種有效劑

性細(xì)胞突變

量的致突變物

能傳遞的遺傳改變

哺乳動(dòng)物

誘發(fā)突變

腫瘤

體細(xì)胞突變

畸胎（胚胎期接觸）

突變的后果

生殖

1、性致死突變（非遺傳的變異）∶

接

細(xì)

不能與異性細(xì)胞結(jié)合，胚胎早期死亡，故對(duì)基因庫無影響

觸

胞

2、遺傳性變異（非致死性突變）∶

有

突

（1）、染色體病

效

變

（2）、顯性突變遺傳（如多指、多趾

劑

（3）、隱性突變遺傳（如白化病）量

的

體

誘

細(xì)

1、胚胎或胎兒細(xì)胞受影響∶

變

胞

胚胎畸形、胚胎死亡劑

突

2、癌腫……

變受傷前的宋學(xué)文受傷后的宋學(xué)文美國明星約翰.韋恩

13年后的孫渤已是老氣橫秋

遺傳毒理學(xué)在環(huán)境監(jiān)測(cè)中的重要性和必要性傳統(tǒng)的理化分析不能滿足環(huán)境監(jiān)測(cè)的要求首先，遺傳毒物因其理化性質(zhì)以及數(shù)量很微或在環(huán)境中降解為某些未知產(chǎn)物，理化分析非常復(fù)雜或困難，因而環(huán)境樣品的生物實(shí)驗(yàn)常常顯示有致突變性而不能用理化方法測(cè)量出來第二，遺傳毒物僅占環(huán)境物質(zhì)中的一小部分，要單獨(dú)分離檢測(cè)這些遺傳毒物，顯然難度較大第三，環(huán)境中遺傳毒物對(duì)生物體的作用往往不是單個(gè)物質(zhì)的作用，而是多個(gè)物質(zhì)的聯(lián)合作用，僅用理化分析不能提供化學(xué)混合物中各組分對(duì)生物活性綜合效應(yīng)的資料致突變性評(píng)價(jià)方法

檢測(cè)外來化學(xué)物的致突變性一般通過致突變實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行。其目的主要有兩點(diǎn)：檢測(cè)外源化學(xué)物的致突變性，預(yù)測(cè)其對(duì)哺乳動(dòng)物和人的致癌性檢測(cè)外源化學(xué)物對(duì)哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞的遺傳毒性，預(yù)測(cè)其對(duì)人體的遺傳危害性實(shí)驗(yàn)方法的研究很快，原有方法日益完善，新方法也不斷建立，對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)所反映的事件的認(rèn)識(shí)不斷深化。目前，已有致突變實(shí)驗(yàn)兩百余種，但常用的較重要的僅十余種。致突變?cè)囼?yàn)在環(huán)境檢測(cè)（監(jiān)測(cè)）中的應(yīng)用

環(huán)境中采集樣品的遺傳毒性監(jiān)測(cè)現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境的遺傳毒性直接監(jiān)測(cè)環(huán)境化學(xué)物的“三致”效應(yīng)檢測(cè)環(huán)境放射性監(jiān)測(cè)

對(duì)特定環(huán)境中人類健康的監(jiān)測(cè)環(huán)境樣品的采集和前處理

根據(jù)研究目的設(shè)置污染區(qū)和對(duì)照區(qū)采樣點(diǎn)（包括部位與數(shù)量）、采集研究的環(huán)境樣品。重要的是采集的環(huán)境樣品能代表所關(guān)注的混合物，其次是隨機(jī)化采樣技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)化的采樣方法。合理的樣品前處理方法是有效遺傳毒性檢測(cè)的必要前提。1992年制定的《有機(jī)污染物遺傳性檢測(cè)的環(huán)境樣品前處理規(guī)范》，是國家環(huán)保局提出的標(biāo)準(zhǔn)，目的是制定污染物有機(jī)組分遺傳毒性檢測(cè)時(shí)環(huán)境樣品前處理的技術(shù)要求，保證將檢測(cè)結(jié)果的偏差減到最小，使實(shí)驗(yàn)室間的檢查結(jié)果具可比性，從而給具誘變性、致癌性、致畸性有機(jī)污染物的管理與控制提供科學(xué)的依據(jù)。樣品的處理通常采用兩種策略：即提取總的混合物和分離成不同組分（單個(gè)化合物或幾類化合物）?！队袡C(jī)污染物遺傳毒性檢測(cè)的環(huán)境樣品前處理規(guī)范》大氣可吸入顆粒物地面水及廢水非水液態(tài)廢棄物土壤及沉積固體廢棄物環(huán)境中采集樣品的遺傳毒性監(jiān)測(cè)

環(huán)境采集樣品的監(jiān)測(cè)就是先將環(huán)境介質(zhì)(空氣、水、土壤)或動(dòng)植物體內(nèi)的遺傳毒物提取出來，然后在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對(duì)微生物、高等植物、水生生物、哺乳動(dòng)物及人體細(xì)胞在體外或整體條件下，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行遺傳毒理學(xué)檢測(cè)，通過生物遺傳學(xué)效應(yīng)的測(cè)試，從而為環(huán)境中遺傳毒性的危險(xiǎn)度評(píng)價(jià)提供資料?？諝?/p>

空氣采樣通常采用大流量采樣器采集，另外也可采用個(gè)體采樣器采集。如研究大氣沉降灰塵則采用灰塵采樣罐。含懸浮顆粒物通常被收集在濾膜上，也可吸附在樹脂上；還可通過降溫方法收集冷凝物。采集在膜上的樣品根據(jù)污染物性質(zhì)和研究目的可用不同的有機(jī)溶劑提取，常用的有機(jī)溶劑有環(huán)己烷、苯-己烷-異丙醇混合物、二氯甲烷-丙酮、甲醇、環(huán)己烷-甲醇、丙酮、甲苯-丙酮、苯甲醇、硝基甲烷等。提取的樣品經(jīng)過濾（也可不過濾），然后濃縮至干，再定量溶于二甲基亞砜中供實(shí)驗(yàn)用。水少數(shù)情況可采用原水，大多數(shù)水體因有機(jī)物的總濃度低于1×10-6

mg/L，通常需要先對(duì)水樣中的有機(jī)物進(jìn)行濃集。濃集水中有機(jī)物的方法有多種，如液-液萃取法、凍干脫水法、吹氣提取法、吸附法等，其中以XAD樹脂吸附法應(yīng)用最廣。對(duì)于無懸浮固體的水樣直接通過樹脂柱濃集即可，對(duì)于含固體懸浮物的水樣，可先過濾再過柱，過柱后選擇適當(dāng)?shù)娜軇腋∥锵疵撓聛恚Ｓ玫慕馕鲇袡C(jī)溶劑有：乙醚、丙酮、甲醇、二醇、苯、乙酸乙酯、乙氰、石油醚等。為提高有機(jī)溶劑對(duì)XAD樹脂吸附物的洗脫力，可將兩種（或兩種以上）的溶劑混合或先后使用。土壤

通常采集1kg左右的土樣，經(jīng)陰干碾碎過篩，要求顆粒大小在1～10μm，再用苯-甲醇4∶1提取液（甲醇，氯仿等）于索氏提取器中提取，將提取液置于濃縮器中濃縮后真空干燥，二甲基亞砜定容，供實(shí)驗(yàn)用。動(dòng)植物

魚貝類剝?nèi)ヘ悮せ蝼[，將肉粉碎，也可取某些臟器或部位的組織加以粉碎，稱取一定量放于索氏提取器中，用乙醚等提取液提取，將提取液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中干燥，定容于二甲基亞砜中供實(shí)驗(yàn)用。蔬菜樣品，首先棄不可食部分，蒸餾水洗凈，烘干（60～65℃），碾磨，過篩，然后取一定量用索氏提取器提取有機(jī)物，提取液可采用苯-甲醇（4∶1）等適宜的溶劑，然后干燥定量供測(cè)試用。環(huán)境采集樣品遺傳毒性監(jiān)測(cè)方法微生物試驗(yàn)植物水生生物昆蟲兩棲類

微生物試驗(yàn)Ames試驗(yàn)SOS／umn試驗(yàn)發(fā)光細(xì)菌暗變種試驗(yàn)單細(xì)胞生物DNA損傷和修復(fù)的研究真核微生物單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)植物1978年Grant等報(bào)道了紫露草、蠶豆、玉米、大麥、大豆、豌豆、番茄、洋蔥、百合、煙草和還陽參12種植物的細(xì)胞染色體畸變檢測(cè)方法可作環(huán)境監(jiān)測(cè)1981年，美國環(huán)保局(EPA)把紫露草微核分析列入環(huán)境監(jiān)測(cè)項(xiàng)目之一。我國、日本、加拿大、墨西哥、印度、前蘇聯(lián)等也先后采用目前已用于DNA加合物測(cè)試的植物有豌豆、菜豆、大麥葉、紫色錐形花、煙草、番茄、紫露草、郁金香等水生生物脊椎動(dòng)物細(xì)胞遺傳學(xué)試驗(yàn)

除魚類外周血紅細(xì)胞微核外，還有顯性致死試驗(yàn)、SCE分析、程序外DNA合成試驗(yàn)及DNA加合物分析等非脊椎動(dòng)物如海膽、雙殼類軟體動(dòng)物的分裂后期染色體畸變分析、貝和海膽的微核試驗(yàn)、海膽的顯性致死試驗(yàn)、淡水渦蟲單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)、貝DNA加合物分析等。昆蟲

如果蠅伴性隱性致死試驗(yàn)、蚯蚓體腔細(xì)胞彗星試驗(yàn)等采用彗星試驗(yàn)技術(shù)檢驗(yàn)蚯蚓活體暴露過程中DNA損傷水平，并結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法對(duì)“彗星”尾矩、尾長(zhǎng)等參數(shù)表示的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，能夠更為準(zhǔn)確地定量描述化學(xué)品和土壤中污染物造成的動(dòng)物細(xì)胞DNA單鏈斷裂。該技術(shù)作為一種敏感、方便、快速的生物標(biāo)記方法，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和野外實(shí)地考察土壤整體環(huán)境質(zhì)量，判斷污染物質(zhì)的遺傳毒性效應(yīng)具有重要應(yīng)用意義。現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境的遺傳毒性直接監(jiān)測(cè)

現(xiàn)場(chǎng)生物的直接測(cè)試，是用現(xiàn)場(chǎng)被污染的生物直接進(jìn)行遺傳毒理學(xué)檢測(cè)來評(píng)價(jià)環(huán)境遺傳危險(xiǎn)度現(xiàn)場(chǎng)遺傳毒性監(jiān)測(cè)通常采用的生物是當(dāng)?shù)禺a(chǎn)的有花植物、水生脊髓動(dòng)物和無脊髓動(dòng)物、小的陸生哺乳動(dòng)物，也可使用替代個(gè)體或種系。替代生物可從溫室、實(shí)驗(yàn)室或農(nóng)場(chǎng)轉(zhuǎn)移到擬觀察現(xiàn)場(chǎng)，也可從觀察現(xiàn)場(chǎng)轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室或從某一現(xiàn)場(chǎng)轉(zhuǎn)移到另一現(xiàn)場(chǎng)。現(xiàn)場(chǎng)直接監(jiān)測(cè)的重要性

在環(huán)境中沒有一種生物系統(tǒng)是僅受單個(gè)化學(xué)作用的，由于環(huán)境化學(xué)物誘發(fā)的有害生物效應(yīng)大部分是某特定環(huán)境中各種化學(xué)和物理因素之間復(fù)雜作用的結(jié)果，即這些毒性效應(yīng)常常是復(fù)雜混合物中不同化學(xué)物相加、相乘或拮抗作用，以及與物理因素相互作用的結(jié)果。這種不同因素相互作用和動(dòng)態(tài)變化的環(huán)境，要在實(shí)驗(yàn)室里復(fù)制出來，幾乎是不可能的。進(jìn)入環(huán)境的很多氣態(tài)致突變物是短壽的，并且可能與其他化學(xué)物迅速發(fā)生相互作用，難于用采集環(huán)境樣品的方法來進(jìn)行生物監(jiān)試。因此，從危害性鑒定和環(huán)境評(píng)估來講，直接監(jiān)測(cè)現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境中生物體的遺傳毒性效應(yīng)是非常有價(jià)值的。環(huán)境化學(xué)物的“三致”效應(yīng)檢測(cè)

據(jù)估計(jì)，目前環(huán)境中大約已有10萬種人工合成的化學(xué)制劑，而且正以每年近1500種的速度遞增．其中10％的化合物的制造量足以威脅到環(huán)境的安全，因此，在將其排放到環(huán)境中之前，需要進(jìn)行必要的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估(riskassessment)．一般的化學(xué)監(jiān)測(cè)l方法雖然能對(duì)環(huán)境或生物體內(nèi)污染物含量進(jìn)行定量描述，但僅憑含量無法反映這些污染物對(duì)生物的效應(yīng)，而一般的毒性試驗(yàn)也無法反映具對(duì)生物體的潛在危害，即對(duì)下一代的影響，如“三致”效應(yīng)等。這須應(yīng)用環(huán)境遺傳毒理學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。環(huán)境放射性監(jiān)測(cè)

隨著核技術(shù)的發(fā)展，放射性廢水的直接排放，造成了局部水域的放射性核素污染；例如：1945—1980年全世界共進(jìn)行的543次大氣層核試驗(yàn)和二戰(zhàn)后期日本廣島、長(zhǎng)崎原子彈爆炸產(chǎn)生了大量放射性裂變產(chǎn)物造成了全球范圍內(nèi)的人工放射性核素的污染；1986年4月前蘇聯(lián)切爾諾貝利核電站事故又導(dǎo)致大量放射性物質(zhì)的泄漏，污染了整個(gè)北半球；另外，燃煤發(fā)電、磷酸鹽礦開采、稀土工業(yè)等發(fā)展，使天然放射性核素發(fā)生了轉(zhuǎn)移和再分布。這些放射性核素經(jīng)自然沉降、雨水沖刷等造成了局部地區(qū)及全球江河水系的放射性污染，對(duì)水體構(gòu)成了一定的放射性污染，從而危害人體健康。為此，世界許多國家和地區(qū)對(duì)水體中放射性污染進(jìn)行了多方面的研究。對(duì)特定環(huán)境中人類健康的監(jiān)測(cè)人們?nèi)粘Ｉ罹幼〉沫h(huán)境是人類大環(huán)境中賴以生存和繁衍的特定環(huán)境，這種特定環(huán)境的質(zhì)量與否，對(duì)人類的重要性是不言而喻的。加強(qiáng)對(duì)特定環(huán)境的監(jiān)測(cè)，特別是遺傳毒學(xué)的檢測(cè)/監(jiān)測(cè)，是關(guān)系人們健康的重中之重的大事，應(yīng)為環(huán)境保護(hù)工作者所重視。人群監(jiān)測(cè)（humanpopulationmonitoring）是評(píng)價(jià)人類在生活和職業(yè)環(huán)境中接觸遺傳毒物的水平，以及對(duì)人體的生物效應(yīng)。常用的遺傳毒理學(xué)方法介紹

細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)

（Ames試驗(yàn))

哺乳動(dòng)物細(xì)胞株突變?cè)囼?yàn)

正常細(xì)胞突變細(xì)胞株（V-79細(xì)胞株

CHO細(xì)胞株）DNA合成時(shí)能利用具有不能利用堿基類似物，不中毒毒性的嘌呤堿類似物使中毒不能在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)

微核試驗(yàn)染色體畸變?cè)囼?yàn)顯性致死突變?cè)囼?yàn)（dominantlethalmutationtest）

本試驗(yàn)是檢測(cè)外來化合物對(duì)動(dòng)物生殖細(xì)胞染色體的致突變作用。與骨髓細(xì)胞染色體畸變分析不同之處在于前者觀察體細(xì)胞染色體本身的結(jié)構(gòu)和數(shù)目的變化，而本試驗(yàn)系觀察胎鼠的成活情況。因?yàn)椴溉閯?dòng)物生殖細(xì)胞染色體發(fā)生突變時(shí)（染色體斷裂或重組），往往不能與異性生殖細(xì)胞結(jié)合，或使受精卵在著床前死亡和胚胎早期死亡。

姐妹染色單體交換試驗(yàn)（SCE試驗(yàn)）單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)SCGE是一種在單細(xì)胞水平上檢測(cè)DNA鏈損傷的方法原理：包埋在瓊脂糖凝膠中的細(xì)胞在中性或堿性條件下經(jīng)裂解與解旋后，帶負(fù)電荷的DNA游離斷片，在電場(chǎng)作用下向陽極遷移。細(xì)胞經(jīng)溴乙錠（ethidiumbromide）染色后在熒光顯微鏡下觀察，受損DNA形成形似彗星的影象，故又稱“彗星試驗(yàn)”（CometAssay）實(shí)驗(yàn)流程加受試物染毒制片

細(xì)胞裂解解旋、電泳

中和EB染色

鏡檢計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)分析制單細(xì)胞懸液典型彗星圖象

果蠅遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)果蠅伴性隱性致死試驗(yàn)

果蠅的性染色體和人類一樣，雌蠅有一對(duì)x染色體，雄蠅則為xy。伴性隱性致死突變?cè)囼?yàn)的遺傳學(xué)原理，在于致突變物可變?cè)谛坌怨壟渥觴染色體上誘導(dǎo)隱性致死突變。將經(jīng)處理的雄蠅與未經(jīng)處理的雌蠅（x染色體上常有易鑒別的表型標(biāo)記，以區(qū)別父本或母本的x染色體）交配，此時(shí)產(chǎn)生的子1代（F1）雄蠅帶有來自父本的具致死突變的x染色體。但由于此種致死突變?yōu)殡[性，所以F1雌蠅仍然能正常生長(zhǎng)、發(fā)育、生殖。若將此類雌蠅F1與子1代雄蠅交配，則將有半數(shù)雄合子是含有經(jīng)受試物處理的雄蠅（P1）的x染色體。此時(shí)x染色體上隱性致死基因得以表現(xiàn)，引起此雄蠅死亡DNA加合物研究及其毒理學(xué)中的應(yīng)用

DNA加合物形成

DNA加合物是親電性加合物及其代謝產(chǎn)物和生物體內(nèi)的DNA形成的共價(jià)結(jié)合產(chǎn)物DNA加合物的形成被認(rèn)為是致癌過程的一個(gè)重要階段

32P后標(biāo)記法基本原理

1、

含有加合物的DNA鏈在內(nèi)切酶的作用下降價(jià)為3，單磷酸苷；2、

通過消除正常的核苷酸來富集加合物的核苷酸；3、

在特異的T4

多核苷酸激酶的作用下，將具有高度特異活性的32P-ATP的磷酸根基團(tuán)轉(zhuǎn)移到加合的核苷酸的5，-羥基末端，使其形成3，-5，二磷酸核苷；4、

將標(biāo)記的加合物通過薄層層析分離；

5、放射自顯影及定量分析。

參與形成DNA加合物的活性化合物

外源性的（天然的和人工合成的）化合物，例如多種環(huán)境污染物某些藥物（抗癌藥物）內(nèi)源性化合物（如雌二醇）DNA加合物的實(shí)際應(yīng)用DNA加合物作為生物標(biāo)志物用于腫瘤流行病學(xué)研究DNA加合物的水毒理學(xué)研究

DNA加合物在環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用用DNA加合物作為指標(biāo)檢測(cè)和篩選致癌物用DNA加合物作為指標(biāo)檢測(cè)和篩選致癌物建立用魚進(jìn)行致癌物檢測(cè)與篩選的模式系統(tǒng)對(duì)日常生活中常用的化學(xué)品的潛在致癌性進(jìn)行研究對(duì)天然水體中魚樣的DNA加合物測(cè)定及相應(yīng)水體的水和沉積物誘導(dǎo)形成DNA加合物的能力的實(shí)驗(yàn)室研究

第六節(jié)致畸試驗(yàn)

基本概念

器官形態(tài)結(jié)構(gòu)的異常稱為畸形（malformation）胎兒出生時(shí)即具有整個(gè)身體或某一部分的外形或器官的解剖學(xué)上的形態(tài)結(jié)構(gòu)異常稱為先天畸形（congenitalmalformation）畸形的胚胎，稱為畸胎（terate）凡在一定劑量下，能通過母體對(duì)胚胎正常發(fā)育過程造成干擾，使子代出生后具有畸形的化合物稱為致畸物（teratogen）或致畸原評(píng)定外源化學(xué)物是否具有致畸作用的試驗(yàn)，稱為致畸試驗(yàn)發(fā)育毒性

某些化合物可具有干擾胚胎的發(fā)育過程，影響正常的發(fā)育作用，即發(fā)育毒性。發(fā)育毒性的具體表現(xiàn)可分為：

1、生長(zhǎng)遲緩(growthretardation)2、致畸作用(teratogenicity)3、功能不全和異常

4、胚胎致死作用(embryolethality)環(huán)境因素與人體健康原生環(huán)境指天然形成的環(huán)境條件，主要是地質(zhì)條件。如高山區(qū)地質(zhì)性原因形成的缺碘區(qū)、高氟地區(qū)以及高放射本底地區(qū)等有害于健康的環(huán)境次生環(huán)境是隨人口密集、工業(yè)發(fā)展、能源利用、生活和生產(chǎn)中產(chǎn)生的廢棄物大量排放、人為造成的污染環(huán)境原生環(huán)境與出生缺陷

※

碘地區(qū)與碘缺乏病（IDD）

※高氟地區(qū)與先天性氟中毒

※水質(zhì)硬度有關(guān)的出生缺陷

※高放射活性地區(qū)與畸形發(fā)生率

※氣象與胎兒畸形克汀病印度一名患有氟骨癥的男子在他嫂子的幫助下進(jìn)食印度患有氟骨癥的8歲男孩巴拉克試圖站立起來彩圖9美國明尼蘇達(dá)州畸形豹蛙彩圖15五條腿的黃牛60年代初，歐洲發(fā)生的反應(yīng)停（塞利米多，thalidomide）事件揭開了化學(xué)致畸性研究的序幕

美國的一個(gè)“反應(yīng)停”受害女孩，已經(jīng)學(xué)會(huì)用她僅有的一只手繪畫馬丁·施奈德斯是荷蘭第一個(gè)“反應(yīng)停兒童”。在年紀(jì)很小的時(shí)候，他就已學(xué)著以殘疾之身生活下去，并逐漸掌握了一系列技能，包括彈奏電風(fēng)琴。

被反應(yīng)停奪去胳膊的孩子們

致畸原的特點(diǎn)不同類型的致畸原，導(dǎo)致不同類型先天缺陷致畸原的理化性質(zhì)作用劑量作用時(shí)間不同類型的致畸原，導(dǎo)致不同類型先天缺陷

X-射線可引起腦小畸形、小眼球癥；反應(yīng)停引起短肢畸形；甲基汞引起嬰兒腦性麻痹及精神遲鈍等。致畸物的吸收及在體內(nèi)的代謝、分解

分子量小，極性小，未電離，高脂溶性未與母體血漿蛋白質(zhì)結(jié)合均易透過胎盤屏障。但母體接受的化學(xué)物劑量大，在血中產(chǎn)生足夠的濃度時(shí)，即使是脂溶性低和呈離子態(tài)的，也能到達(dá)胎兒血；某些化學(xué)物能迅速穿過胎盤，進(jìn)入胎兒血，達(dá)到比母體血中還高的濃度，如氨芐青霉素，胎兒血中的濃度，比母體可高出7倍致畸物的化學(xué)結(jié)構(gòu)

化學(xué)物質(zhì)好的致畸作用還與其化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。在孕期中蛋白質(zhì)代謝紊亂可能會(huì)引起畸胎，例如，某些農(nóng)藥好的化學(xué)結(jié)構(gòu)中有嘌呤基，可能直接或間接地對(duì)體內(nèi)的嘌呤基代謝起作用，從而破壞了胚胎的正常發(fā)育過程，而形成畸胎。在某些有致畸性的化學(xué)物質(zhì)中有維生素拮抗劑、氨基酸拮抗劑、核酸拮抗劑和烷化劑等，這些物質(zhì)都可以起著抗代謝的作用，也可能引起畸胎

作用劑量

在同一發(fā)育階段，致畸率及程度隨致畸原好的劑量（或強(qiáng)度）增加而升高，且呈劑量—反應(yīng)關(guān)系。各種致畸原均有其引起畸形發(fā)生的閾作用劑量，高于此劑量時(shí)開始出現(xiàn)畸胎。劑量越大，畸胎率越高，致畸敏感期越長(zhǎng)。劑量再增大時(shí)則出現(xiàn)胚胎死亡，此時(shí)由于有缺陷好的胚胎死亡，畸形率反而降低；劑量進(jìn)一步增加則可造成母體死亡。致畸帶

典型的致畸原的致畸作用劑量—反應(yīng)曲線是很陡的，有時(shí)從“無作用”到胚胎死亡僅有2～4倍之差，如給予小鼠環(huán)磷酰胺5～10mg/kg未見畸形發(fā)生，而40mg/kg則可引起100%胚胎死亡。在“無作用”劑量到胚胎死亡劑量時(shí)，存在劑量帶，稱致畸帶。如放線菌D的致畸帶很窄，而脒基硫脲和反應(yīng)停的致畸帶特別寬。致畸帶愈寬的致畸物，危險(xiǎn)性愈大。此外劑量還可影響易感期，劑量愈大，常使易感期延長(zhǎng)。作用時(shí)間

胚胎發(fā)育的不同階段，對(duì)于致畸因子的感受性不同,呈現(xiàn)不同的敏感性器官有對(duì)致畸因子不同易感期

患風(fēng)疹的孕婦，在不同時(shí)期感染，引起胎兒不同的先天畸形∶妊娠第4周

無腦兒和/或脊髓裂

第5周

無肢畸形第6周

先天性白內(nèi)障

第5～10周

心臟缺陷

第6～9周

牙的畸形

第7～9周

耳聾器官有對(duì)致畸因子不同易感期

致畸作用由于外源化學(xué)物的干擾，胎兒出生時(shí)，某種器官表現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)異常致畸作用所表現(xiàn)的形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，在出生后立即可被發(fā)現(xiàn)胚胎發(fā)育的不同階段，呈現(xiàn)不同的敏感性遺傳因子的影響不同種屬與品系的動(dòng)物對(duì)致畸原的敏感性不同動(dòng)物的不同種屬不同品系之間這種致畸作用差異，可能是由于它們對(duì)致畸物的代謝過程不同，胎盤構(gòu)造亦有差異所致。其本質(zhì)可能是遺傳因素，即基因型的差異

環(huán)境污染與致畸先天性水俁病農(nóng)藥枯葉劑（2，4，5—T）環(huán)境激素引起的性機(jī)能異常電離輻射與致畸作用2，3，7，8—TCDD電離輻射與致畸作用

1945年日本廣島和長(zhǎng)崎上空爆炸的二顆原子彈接受到爆炸輻射的孕婦所產(chǎn)生的種種畸形所證實(shí)。例如，日本的廣島遭到原子彈爆炸時(shí)，距離爆炸中心1200米的11名婦女，其中除4名由于有鋼筋混凝土的原墻掩護(hù)而幸免輻射損傷，其余7名婦女所產(chǎn)嬰兒全是畸形（小頭），并伴有精神發(fā)育達(dá)緩。環(huán)境荷爾蒙引起的性機(jī)能異常

近二三十年以來，性機(jī)能障礙和疾病的發(fā)生率在世界各地以異常速度急劇上升。起初,引起人們關(guān)注的并不是“人”本身，而是自然界發(fā)生的動(dòng)物突然變異現(xiàn)象。例如，美國佛羅里達(dá)州的湖泊，7年時(shí)間，生息的鱷魚減少了90%，后經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在這兒棲息的鱷魚與正常鱷魚相比，生殖器萎縮變小的鱷魚占到85%，并且在鱷魚蛋的蛋黃里檢查出了環(huán)境荷爾蒙的DDT和DDE成分

在日本沿海的海螺雌雄同體現(xiàn)象已經(jīng)遍及全國，造成這種現(xiàn)象的原因是由于涂在船底和網(wǎng)上的涂料含有機(jī)錫化合物產(chǎn)生了污染。涂抹這種涂料的目的是為了殺死附著在船底和魚網(wǎng)上的生物。此外，在美國五大湖水鳥雌雄同體現(xiàn)象，也是由于DDT污染所致。

由于受到環(huán)境荷爾蒙的威脅，而呈現(xiàn)世界性男性精子減少現(xiàn)象，已成為目前全世界新聞媒介渲染關(guān)注的大問題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，本世紀(jì)50年代出生的男性的精子數(shù)為1億/ml，70年代出生的男性減少到7500萬個(gè)，以這種速度推測(cè)，90年代出生的男孩成人以后，可能減少到5000萬個(gè)。1ml精液所含的精子數(shù)低于2000萬個(gè)以下，便可能成為男性不育癥，400萬以下便是完全的男性不育癥。輿論界驚呼∶按此速度發(fā)展下去，不出21世紀(jì)，全人類便會(huì)面臨消亡的危機(jī)！造成恐龍消失的原因不是由恐龍本身造成的，而造成人類滅絕的原因恰恰是人類自身。與致畸作用有關(guān)的機(jī)理基因突變和染色體畸變生物合成的原料和能量不足

細(xì)胞毒作用酶的抑制對(duì)細(xì)胞膜損傷非特異性發(fā)育毒性作用

母體及胎盤的正常功能受到基因突變和染色體畸變

致畸胎物質(zhì)進(jìn)入母體到達(dá)胚胎，影響控制正常的生長(zhǎng)發(fā)育方面的基因，使這種基因的控制偏離了正常的軌道，就會(huì)產(chǎn)生胎兒死亡、流產(chǎn)及先天性畸形。但是這種畸形并不具有遺傳染色體畸變與基因突變的情況相似，可能有程度上的不同。一般認(rèn)為它常導(dǎo)致胚胎死亡，如不死亡，也可產(chǎn)生畸形和功能障礙。自然流產(chǎn)的40%可見到染色體畸變，懷孕4周內(nèi)自然流產(chǎn)中100%有畸形，其中75%有染色體異常。生物合成的原料和能量不足

現(xiàn)已證實(shí)水楊酸鹽抑制粘多糖的合成，而粘多糖為結(jié)締組織的主要成分，它的缺乏可導(dǎo)致畸形；EDTA與鋅絡(luò)合，可使胎兒鋅水平下降；同樣其它原因所致某些特殊營養(yǎng)成分，如鎂、錳、葉酸、泛酸等缺乏，將導(dǎo)致畸形；RNA或DNA合成前體物不足，如嘌呤類、嘧啶類等以及蛋白質(zhì)合成原料的不足，也可誘發(fā)畸形。細(xì)胞毒作用

在正常情況下，在器官發(fā)生期細(xì)胞增殖速度極高，如大白鼠妊娠第8～11天胚胎DNA含量增加可達(dá)1000倍。在此期間對(duì)外源化學(xué)物反應(yīng)極為敏感，如接觸一定劑量的外源化學(xué)物，可表現(xiàn)出細(xì)胞毒性作用。常見有細(xì)胞毒性的外源化學(xué)物有烷化劑、抗癌劑以及致突變物等。當(dāng)接觸劑量較低時(shí)，也可引起細(xì)胞死亡，但其速度和數(shù)量可被存活細(xì)胞的增殖所補(bǔ)償，故在出生時(shí)并不表現(xiàn)畸形酶的抑制

細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化及器官生長(zhǎng)發(fā)育等過程均有酶參與。例如，DNA合成酶、RNA轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶以及碳酸酐酶等，它們?cè)诩?xì)胞分化增殖過程以及維持正常代謝中起著重要的作用。當(dāng)這些重要酶類被抑制或破壞，將影響胚胎正常發(fā)育過程，并引起畸形對(duì)細(xì)胞膜損傷

在細(xì)胞膜正常結(jié)構(gòu)以及滲透性等生物物理性質(zhì)改變的情況下，也可出現(xiàn)畸形。大劑量的維生素A給予大鼠所致的致畸作用被認(rèn)為是高濃度維生素A破壞了胚胎細(xì)胞膜的超微結(jié)構(gòu)。細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的正常及一定好的滲透壓為維持細(xì)胞增殖及細(xì)胞代謝所必需，一旦受到損害，將影響細(xì)胞正常功能及增殖過程，導(dǎo)致畸形。非特異性發(fā)育毒性作用

非特異性發(fā)育毒性作用的特點(diǎn)是對(duì)全部胚胎組織細(xì)胞基本生命現(xiàn)象的干擾。例如，損傷線粒體功能、抑制線粒體呼吸和ATP的產(chǎn)生、抑制細(xì)胞色素氧化酶活性和降低細(xì)胞能量供給等。它與前述細(xì)胞毒性作用不同，不會(huì)出現(xiàn)靶部位或靶組織，也不可能有部分組織受損與畸形幼仔出生，它可使全部組織受到損害，引起胚胎全面生長(zhǎng)遲緩，甚至胚胎死亡母體及胎盤的正常功能受到干擾

胚胎的正常發(fā)育與母體及胎盤的正常功能發(fā)揮有密切的聯(lián)系。當(dāng)母體必需的某種營養(yǎng)素如VA和葉酸的缺乏、營養(yǎng)失調(diào)如蛋白質(zhì)和熱能供給不足、營養(yǎng)成分由母體至胚胎的轉(zhuǎn)運(yùn)受阻、子宮和胎盤血液循環(huán)障礙等均可影響胚胎的發(fā)育，造成畸形甚至胚胎死亡和生長(zhǎng)遲緩。發(fā)育毒性的評(píng)定方法致畸物體內(nèi)篩檢試驗(yàn)法傳統(tǒng)常規(guī)致畸試驗(yàn)其它試驗(yàn)

1、全胚胎培養(yǎng)法

2、器官培養(yǎng)法

3、細(xì)胞培養(yǎng)法

生殖毒性和發(fā)育毒性三階段一代試驗(yàn)法人群調(diào)查致畸試驗(yàn)（teratogenesistest）動(dòng)物選擇一般多采用大鼠、小鼠和家兔，其中以大鼠為首選劑量分組一般以LD50的1/3-1/2為最高劑量組，LD50的1/30-1/100為低劑量組。鼠類每組不少于15~20只，家兔7~8只。受試動(dòng)物處理選擇一批性成熟未交配過的雌鼠和雄鼠，按一雄一雌或一雄二雌比例，同籠過夜，次日清晨檢查雌鼠是否受孕。發(fā)現(xiàn)陰栓或精蟲，則表示受孕，查到日為孕期“0”天，次日為第一天