實(shí)驗(yàn)一土壤中微生物的分離純化

實(shí)驗(yàn)一土壤中微生物的分離及純化（設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)）2025/1/111一、目的要求

掌握倒平板的方法和幾種分離純化微生物的基本操作技術(shù)。學(xué)習(xí)平板菌落計(jì)數(shù)的基本原理和方法。2025/1/112二、基本原理在土壤、水、空氣或人及動(dòng)、植物體中，不同種類的微生物絕大多數(shù)都是混雜生活在一起，當(dāng)我們希望獲得某一種微生物時(shí)，就必須從混雜的微生物類群中分離它，以得到只含有這一種微生物的純培養(yǎng)，這種獲得純培養(yǎng)的方法稱為微生物的分離與純化。2025/1/113為了獲得某種微生物的純培養(yǎng)，一般是根據(jù)該微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)、酸堿度、氧等條件要求不同，而供給它適宜的培養(yǎng)條件，或加入某種抑制劑造成只利于此菌生長(zhǎng)，而抑制其他菌生長(zhǎng)的環(huán)境，從而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀釋涂布平板法或稀釋混合平板法或平板劃線分離法等分離、純化該微生物，直至得到純菌株。土壤是微生物生活的大本營(yíng)，在這里生活的微生物無(wú)論是數(shù)量和種類都是極其多樣的，因此，土壤是我們開(kāi)發(fā)利用微生物資源的重要基地，可以從其中分離、純化到許多有用的菌株。2025/1/1142025/1/115平板菌落計(jì)數(shù)法是將待測(cè)樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個(gè)細(xì)胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，由每個(gè)單細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而形成肉眼可見(jiàn)的菌落，即一個(gè)單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個(gè)單細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數(shù)。但是，由于待測(cè)樣品往往不易完全分散成單個(gè)細(xì)胞，所以，長(zhǎng)成的一個(gè)單菌落也可來(lái)自樣品中的2～3或更多個(gè)細(xì)胞。因此平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果往往偏低。為了清楚地闡述平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果，現(xiàn)在已傾向使用菌落形成單位(colony-forming

units，cfu)而不以絕對(duì)菌落數(shù)來(lái)表示樣品的活菌含量。

2025/1/1162025/1/117三、器材高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基，盛9ml無(wú)菌水的試管，盛90ml無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶，無(wú)菌玻璃涂棒，無(wú)菌吸管，接種環(huán)，10％酚，無(wú)菌培養(yǎng)皿，鏈霉素，土樣等。大腸桿菌菌懸液、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。lm1無(wú)菌吸管，無(wú)菌平皿，盛有4.5ml無(wú)菌水的試管，試管架，恒溫培養(yǎng)箱等。2025/1/118四、操作步驟

1．稀釋涂布平板法（1）倒平板將肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基、馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基溶化，待冷至55—60℃時(shí)，向高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基中加入10％酚數(shù)滴，向馬丁氏培養(yǎng)基中加入鏈霉素溶液，使每毫升培養(yǎng)基中含鏈霉素30μg/mL。然后分別倒平板，每種培養(yǎng)基倒三皿，其方法是右手持盛培養(yǎng)基的試管或三角燒瓶，置火焰旁邊，左手拿平皿并松動(dòng)試管塞或瓶塞，用手掌邊緣和小指、無(wú)名指夾住拔出，如果試管內(nèi)或三角燒瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基一次可用完，則管塞或瓶塞不必夾在手指中。試管（瓶）口在火焰上滅菌，然后左手將培養(yǎng)皿蓋在火焰附近打開(kāi)一縫，迅速倒入培養(yǎng)基約15ml，加蓋后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布，平置于桌面上，待凝后即成平板。2025/1/1192025/1/1110

也可將平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夾住管塞并打開(kāi)培養(yǎng)皿，再注入培養(yǎng)基，搖勻后制成平板，如圖Ⅶ-1所示。最好是將平板放室溫2—3天，或37℃培養(yǎng)24小時(shí)，檢查無(wú)菌落及皿蓋無(wú)冷凝水后再使用。2025/1/1111（2）制備土壤稀釋液稱取土樣10g，放入盛90ml無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振搖約20分鐘，使土樣與水充分混合，將菌分散。用一支1ml無(wú)菌吸管從中吸取1ml土壤懸液注入盛有9ml無(wú)菌水的試管中，吹吸三次，使充分混勻。然后再用一支1ml無(wú)菌吸管從此試管中吸取1ml注入另一盛有9ml無(wú)菌水的試管中，以此類推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6各種稀釋度的土壤溶液。2025/1/1112（3）涂布將上述每種培養(yǎng)基的三個(gè)平板底面分別用記號(hào)筆寫(xiě)上10-4、10-5和10-6三種稀釋度，然后用三支1ml無(wú)菌吸管分別由10-4、10-5和10-6三管土壤稀釋液中各吸取0.2ml對(duì)號(hào)放入已寫(xiě)好稀釋度的平板中，用無(wú)菌玻璃涂棒在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻，如圖Ⅶ-2所示。2025/1/1113（4）培養(yǎng)將高氏1號(hào)培養(yǎng)基平板和馬丁氏培養(yǎng)基平板倒置于28℃溫室中培養(yǎng)3—5日，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃溫室中培養(yǎng)2—3日。（5）挑菌落將培養(yǎng)后長(zhǎng)出的單個(gè)菌落分別挑取接種到上述三種培養(yǎng)基的斜面上，分別置28℃和37℃溫室中培養(yǎng)，待菌苔長(zhǎng)出后，檢查菌苔是否單純，也可用顯微鏡涂片染色檢查是否是單一的微生物，若有其他雜菌混雜，就要再一次進(jìn)行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。2025/1/11142．平板劃線分離法（1）按稀釋涂布平板法倒平板，并用記號(hào)筆標(biāo)明培養(yǎng)基名稱。（2）劃線在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑取上述10-1的土壤懸液一環(huán)在平板上劃線（圖Ⅶ-5）。劃線的方法很多，但無(wú)論哪種方法劃線，其目的都是通過(guò)劃線將樣品在平板上進(jìn)行稀釋，使形成單個(gè)菌落。2025/1/11152025/1/1116常用的劃線方法有下列二種：1）用接種環(huán)以無(wú)菌操作挑取土壤懸液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線3—4條，再轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約70°角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過(guò)第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同法通過(guò)第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和通過(guò)第三次平行劃線部分作第四次平行劃線劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于溫室培養(yǎng)。2）將挑取有樣品的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置溫室培養(yǎng)。2025/1/1117（3）挑菌同稀釋涂布平板法，一直到菌分純?yōu)橹?、平板菌落計(jì)數(shù)法

l）編號(hào)

取無(wú)菌平皿9套，分別用記號(hào)筆標(biāo)明10-4、10-5、10-6。(稀釋度)各3套。另取6支盛有4.5mL無(wú)菌水的試管，依次標(biāo)是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。2025/1/1118

2）稀釋

用lmL無(wú)菌吸管吸取lmL已充分混勻的大腸桿菌菌縣液(待測(cè)樣品)，精確地放0.5ml至10-1的試管中，此即為10倍稀釋。將多余的菌液放回原菌液中。

將10-1試管置試管振蕩器上振蕩，使菌液充分混勻。另取一支lml吸管插入10

1試管中來(lái)回吹吸菌懸液三次，進(jìn)一步將菌體分散、混勻。吹吸菌液時(shí)不要太猛太快，吸時(shí)吸管伸人管底，吹時(shí)離開(kāi)液面，以免將吸管中的過(guò)濾棉花浸濕或使試管內(nèi)液體外溢。用此吸管吸取10-1菌液lmL，精確地放0.5mL至10-2試管中，此即為100倍稀釋。……其余依次類推，整個(gè)過(guò)程如圖VIII-3所示。

放菌液時(shí)吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接觸一個(gè)稀釋度的菌懸液，否則稀釋不精確，結(jié)果誤差較大。2025/1/11193）取樣

用三支1mL無(wú)菌吸管分別吸取10-4、10-5和10-6。的稀釋菌懸液各lmL，對(duì)號(hào)放入編好號(hào)的無(wú)菌平皿中，每個(gè)平皿放0.2mL。

不要用lmL吸管每次只靠吸管尖部吸0.2mL稀釋菌液放入平皿臼，這樣容易加大同一稀釋度幾個(gè)重復(fù)平板間的操作誤差。4）倒平板．

盡快向上述盛有不同稀釋度菌液的平皿中倒入融化后冷卻至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基約15毫升/平皿，置水平位置迅速旋動(dòng)平皿，使培養(yǎng)基與菌液混合均勻，而又不使培養(yǎng)基蕩出平皿或?yàn)R到平皿蓋上。

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由于細(xì)菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培養(yǎng)皿后，應(yīng)盡快倒入融化并于已冷卻至45℃左右的培養(yǎng)基，立即搖勻，否則細(xì)菌將不易分散或長(zhǎng)成的菌落連在一起，影響計(jì)數(shù)。

待培養(yǎng)基凝固后，將平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

5）計(jì)數(shù)

培養(yǎng)48h后，取出培養(yǎng)平板，算出同一稀釋度三個(gè)平板上的菌落平均數(shù)，并按下列公式進(jìn)行計(jì)算，

每毫升中菌落形成單位(cfu)=同一稀釋度三次重復(fù)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×5

2025/1/1122菌落記數(shù)儀2025/1/1123

一般選擇每個(gè)平板上長(zhǎng)有30~300個(gè)菌落的稀釋度計(jì)算每毫升的含菌量較為合適。同一稀釋度的三個(gè)重復(fù)對(duì)照的菌落數(shù)不應(yīng)相差很大，否則表示試驗(yàn)不精確。實(shí)際工作中同一稀釋度重復(fù)對(duì)照平板不能少于三個(gè)，這樣便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，減少誤差。由10-4、10-5、10-6三個(gè)稀釋度計(jì)算出的每毫升菌液中菌落形成單位數(shù)也不應(yīng)相差太大。

平板菌落計(jì)數(shù)法，所選擇倒平板的稀釋度是很重要的。一般以三個(gè)連續(xù)稀釋度中的第二個(gè)稀釋度倒平板培養(yǎng)后所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個(gè)左右為好，否則要適當(dāng)增加或減少稀釋度加以調(diào)整。

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平板菌落計(jì)數(shù)法的操作除上述傾注倒平板的方式以外，還可以用涂布平板的方式進(jìn)行。二者操作基本相同，所不同的是后者先將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基融化后倒平板，待凝固后編號(hào)，并于37℃左右的溫箱中烘烤30min，或在超靜工作臺(tái)上適當(dāng)吹干，然后用無(wú)菌吸管吸取稀釋好的菌液對(duì)號(hào)接種于不同稀釋度編號(hào)的平板上，并盡快用無(wú)菌玻璃涂棒將菌液在平板上涂布均勻，平放于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上20～30min，使菌液滲入培養(yǎng)基表層內(nèi)，然后倒置37℃的恒溫箱中培養(yǎng)24～48h。

涂布平板用的菌懸液量一般以0.1ml較為適宜，如果過(guò)少菌液不易涂布開(kāi)，過(guò)多則在涂布完后或在培養(yǎng)時(shí)菌液仍會(huì)在平板表面流動(dòng)，不易形成單菌落。2025/1/1125五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1．結(jié)果在你所實(shí)驗(yàn)的三種培養(yǎng)基平板上長(zhǎng)出的菌落分屬于哪個(gè)類群？簡(jiǎn)述它們的菌落形態(tài)特征。

2025/1/1126六、思考題

1）在平板劃線法（a）中，為什么每次