H7N9禽流感病毒核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)說明書

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【產(chǎn)品名稱】通用名稱：H7N9禽流感病毒核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）英文名稱：DetectionKitforAvianInfluenzaVirusSubtypeH7N9RNA(PCR-FluorescenceProbing)

【包裝規(guī)格】大包裝，48反應(yīng)/盒【預(yù)期用途】流感病毒可分為甲（Ａ）、乙（Ｂ）、丙（Ｃ）三型。其中，甲型流感依據(jù)流感病毒血凝素蛋白（HA）的不同可分為1-16種亞型，根據(jù)病毒神經(jīng)氨酸酶蛋白（NA）的不同可分為1-9種亞型，HA不同亞型可以與NA的不同亞型相互組合形成不同的流感病毒。而禽類特別是水禽是所有這些流感病毒的自然宿主，H7N9禽流感病毒是其中的一種。H7N9流感病毒既可以感染禽類，也可以感染人。人感染H7N9禽流感會出現(xiàn)嚴重肺炎，癥狀包括發(fā)燒、咳嗽、呼吸困難等。本試劑盒適用于檢測呼吸道樣本、血清、肺組織等樣本中H7N9禽流感病毒RNA，可用于該病毒感染的實驗室診斷和宿主動物的監(jiān)控。檢測結(jié)果僅供研究，不用于臨床診斷?！緳z驗原理】本試劑盒基于實時熒光PCR技術(shù)，分別選取H7N9禽流感病毒的HA基因和NA基因保守區(qū)作為擴增靶區(qū)域，設(shè)計特異性引物探針，通過一步法實時熒光PCR體系擴增對H7N9禽流感病毒進行定性檢測。反應(yīng)體系中除特異性引物和特異性熒光探針外，還配以對應(yīng)的PCR反應(yīng)Buffer、逆轉(zhuǎn)錄酶、Hot-StartTaq酶、核苷酸單體（dNTPs）、Mg2+等成分，可實現(xiàn)對H7N9禽流感病毒核酸靈敏特異地檢測?！局饕M成成分】組分名稱規(guī)格數(shù)量PCR檢測試劑AIVH7PCR反應(yīng)液A816μl/管1AIVN9PCR反應(yīng)液A816μl/管1AIVH7N9PCR反應(yīng)液B288μl/管1AIVH7N9內(nèi)標溶液240μl/管1質(zhì)控品陰性質(zhì)控品

200μl/管1AIVH7N9陽性質(zhì)控品200μl/管1

【儲存條件及有效期】保存于-20±5℃，反復(fù)凍融次數(shù)＜5次，有效期9個月?！具m用儀器】ABI7500、ABI7300、LightCycler480等熒光定量PCR儀?！緲颖疽蟆?適用樣本類型：呼吸道樣本、血清、肺組織。2樣品采集、保存與運送。標本采集、保存、運送請遵循《人感染H7N9禽流感病毒標本采集及實驗室檢測策略》?！緳z驗方法】1.核酸提取建議取200μl液態(tài)樣本進行核酸提??；組織樣本可以研磨液進行提取操作?？刹捎弥猩酱髮W(xué)達安基因股份有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑盒，請按照試劑盒說明書進行操作；也可選擇其他合適的商業(yè)化產(chǎn)品。本試劑盒中的內(nèi)標溶液參與提取過程，若提取試劑盒中未說明內(nèi)標的使用方法可在每200μl樣本中加入4μl內(nèi)標溶液后進行核酸提取。本試劑盒中的陰性質(zhì)控品參與提取，用于對環(huán)境進行監(jiān)控；AIVH7N9陽性質(zhì)控品不參與提取，用于PCR檢測試劑的質(zhì)控。2.PCR擴增（ABI7500儀器操作為例，ABI7300、LC480等儀器參照此操作及儀器操作手冊）2.1分別配制AIVH7RT-PCR反應(yīng)體系和AIVN9RT-PCR反應(yīng)體系2.1.1AIVH7RT-PCR反應(yīng)體系配制取適量PCR反應(yīng)管（按AIVH7反應(yīng)體系計算）；每管加入AIVH7PCR反應(yīng)液A17μl、AIVH7N9PCR反應(yīng)液B3μl（也可按照單個反應(yīng)的用量，計算PCR反應(yīng)液A、B各自所需總量，兩者混勻后分裝20μl于單個PCR反應(yīng)管中）。2.1.2AIVN9RT-PCR反應(yīng)體系配制取適量PCR反應(yīng)管（按AIVN9反應(yīng)體系計算）；每管加入AIVN9PCR反應(yīng)液A17μl、AIVH7N9PCR反應(yīng)液B3μl（也可按照單個反應(yīng)的用量，計算PCR反應(yīng)液A、B各自所需總量，兩者混勻后分裝20μl于單個PCR反應(yīng)管中）。2.2于上述PCR反應(yīng)管中分別加入處理后的陰性質(zhì)控品、AIVH7N9陽性質(zhì)控品、待測標本核酸各5μl，8,000rpm離心數(shù)秒，放入PCR擴增儀。2.3探針檢測模式設(shè)置為：ReporterDye1：FAM，QuencherDye：NONE，ReporterDye2：Vic，QuencherDye2：NONE，PassiveReference：NONE。反應(yīng)條件設(shè)置為：50℃15min，1個循環(huán)；95℃15分鐘，1個循環(huán)；94℃15秒→58℃45秒（收集熒光），45個循環(huán)。保存文件，運行。3.結(jié)果分析3.1反應(yīng)結(jié)束后保存檢測數(shù)據(jù)文件。3.2分析條件設(shè)置：根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值、stop值以及Threshold的Value值（用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，Start值可以在3～15、End值可設(shè)在5～20，調(diào)整陰性對照的擴增曲線平直或低于閾值線），點擊Analysis自動獲得分析結(jié)果，在Report界面察看結(jié)果?！举|(zhì)量控制】陰性質(zhì)控品：FAM檢測通路擴增曲線無對數(shù)增長期，VIC檢測通路擴增曲線為明顯對數(shù)增長期；陽性質(zhì)控品：FAM檢測通路擴增曲線有明顯對數(shù)增長期，且FAM檢測通道擴增曲線Ct值≤32；以上要求需在同一次實驗中同時滿足，否則，本次實驗無效，需重新進行?！窘Y(jié)果判定】1.如果檢測樣品的AIVH7及N9RT-PCR反應(yīng)體系FAM檢測通道均無擴增曲線或Ct值＞40，且在VIC檢測通道均有對數(shù)增長期，可判樣品為H7N9禽流感病毒陰性；2.如果檢測樣品的AIVH7及N9RT-PCR反應(yīng)體系擴增曲線在FAM,VIC檢測通道均有對數(shù)增長期且FAM檢測通道Ct值≤40；可判樣品為H7N9禽流感病毒陽性；3.如果檢測樣品的AIVH7或N9RT-PCR反應(yīng)體系僅其中之一的擴增曲線滿足判為陽性的要求，則需重復(fù)檢測；若重復(fù)檢測結(jié)果為H7及N9均陽性，則判H7N9禽流感病毒陽性；若重復(fù)檢測結(jié)果仍為H7（或N9）陽性，則只能判禽流感病毒H7（或N9）亞型陽性，并建議以其他方法做進一步確認?！緳z測方法的局限性】1.樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送及保存質(zhì)量有關(guān)。2.樣本處理時沒有控制好交叉污染，可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果。3.病毒在流行過程中的基因突變則也可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。4.由于不同提取方法的原理不同，采用不同核酸提取試劑進行樣本處理時核酸提取效率存在一定差異，本試劑盒推薦使用本公司生產(chǎn)的核酸提取試劑盒（離心柱法），用戶可根據(jù)具體要求進行選擇確認。5.本檢測結(jié)果僅供臨床參考，如需確診病例請結(jié)合臨床癥狀及其他檢測手段.【產(chǎn)品性能指標】根據(jù)產(chǎn)品分析性能評估結(jié)果，本試劑盒的分析靈敏度為1.0×103copies/ml。與感染部位相同或感染癥狀相似的其他病原體（甲型流感病毒H3亞型、甲型流感病毒H1亞型、乙型流感病毒、副流感病毒、禽流感H5亞型病毒、禽流感H9亞型病毒等）無交叉反應(yīng)?！咀⒁馐马棥?.實驗室管理應(yīng)嚴格按照PCR基因擴增實驗室的管理規(guī)范，實驗人員必須進行專業(yè)培訓(xùn)，實驗過程嚴格分區(qū)進行（試劑準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增和產(chǎn)物分析區(qū)），所用消耗品應(yīng)滅菌后一次性使用，實驗操作的每個階段使用專用的儀器和設(shè)備，各區(qū)各階段用品不能交叉使用；2.為試劑和標本準備階段提供生物安全柜，實驗過程中穿工作服，帶一次性手套，使用自卸管移液器；3.試劑使用前要完全解凍，8,000rpm離心數(shù)秒后使用；4.標本制備區(qū)所用過的吸頭請打入盛有消毒劑的容器，并與廢棄物一起滅菌后方可丟棄；5.實驗完畢用10%次氯酸或75%酒精或紫外線燈處理工作臺和移液器；6.本試劑盒內(nèi)陽性質(zhì)控品應(yīng)視為具有傳染性物質(zhì)，操作和處理均需符合相關(guān)法規(guī)要求：衛(wèi)生部《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通用準則》和《醫(yī)療廢物管理條例》。【生產(chǎn)企業(yè)】企業(yè)名稱：中山大學(xué)達安基因股份有限公司生產(chǎn)地址：廣州市高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)香山路19號；廣州市高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)荔枝山路6號郵

編：510665

電

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網(wǎng)

址：【醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)許可證編號】粵食藥監(jiān)械生產(chǎn)許20040999號

附件2人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測實驗室生物安全保障基本要求

為加強人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測規(guī)范化管理，做好實驗室生物安全管理工作，根據(jù)《病原微生物實驗室生物安全管理條例》（國務(wù)院第424號令，以下簡稱《管理條例》）、《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理規(guī)定》（衛(wèi)生部45號令，以下簡稱《管理規(guī)定》）等有關(guān)要求，制定本標準。供醫(yī)院開展人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測時參考使用。一、樣本采集（一）進行人感染H7N9禽流感病毒相關(guān)樣本（以下簡稱“樣本”）采集的操作人員必須經(jīng)過生物安全培訓(xùn)合格，并具備相應(yīng)的操作技能。（二）樣本采集過程中，操作人員要加強防護，應(yīng)當穿戴防護服、眼罩、N95及以上水平的醫(yī)用防護口罩、雙層醫(yī)用乳膠手套、帽子等個體防護裝備。（三）用于樣本采集的主容器必須采用優(yōu)質(zhì)塑料材質(zhì)，且大小適合、帶螺旋蓋、內(nèi)有墊圈、無菌、耐冷凍的密閉容器。樣本采集后，主容器蓋必須蓋嚴、擰緊，表面應(yīng)當擦拭消毒。（四）對診療過程中采集的各種臨床樣本，醫(yī)療機構(gòu)應(yīng)當加強生物安全管理，在進行動態(tài)風(fēng)險溝通與評估基礎(chǔ)上，采取樣本登記造冊、專庫存放、專人負責(zé)以及必要的消毒處理等較嚴格的安全及安保管理措施。（五）樣本采集過程中產(chǎn)生的醫(yī)療廢物要分類收集，應(yīng)當在產(chǎn)生地點進行壓力蒸汽滅菌或可靠的化學(xué)消毒，然后按感染性、損傷性等醫(yī)療廢物收集處置。二、樣本包裝和運輸（一）負責(zé)樣本包裝和運輸?shù)娜藛T應(yīng)當經(jīng)過感染性物質(zhì)包裝、運輸相關(guān)的生物安全培訓(xùn)，并取得相應(yīng)資格。（二）運輸樣本必須采取三層包裝系統(tǒng)，由內(nèi)到外分別為主容器、輔助容器和外包裝。病毒培養(yǎng)物按照A類感染性物質(zhì)進行包裝運輸，其他感染性物質(zhì)按照B類感染性物質(zhì)進行包裝運輸。容器或包裝材料應(yīng)當達到國際民航組織《危險物品航空安全運輸技術(shù)細則》相應(yīng)包裝標準，符合防水、防破損、防外泄、耐高溫、耐高壓的要求。（三）樣本包裝過程中，操作人員要根據(jù)所處環(huán)境條件參照本標準第一條第二款的相關(guān)要求采取加強防護。（四）操作人員應(yīng)當規(guī)范包裝檢測樣本：1.應(yīng)當在實驗室核心操作區(qū)內(nèi)對裝有樣本的主容器外表面進行仔細檢查并擦拭消毒，確保無泄漏、表面無殘留物，并在外表面標明樣本編號、種類、姓名及采樣日期等信息。用足夠的吸收材料包裹主容器，然后放入輔助容器，擰緊（A類）或封嚴（B類）輔助容器，必要時消毒輔助容器外表面。若多個主容器裝入同一個輔助容器時，必須分別包裹，防止彼此接觸，并在多個主容器外面襯以足夠的吸收材料。2.應(yīng)在實驗室清潔區(qū)采用適當?shù)囊r墊材料將輔助容器固定在貼有統(tǒng)一標識的外包裝箱內(nèi)，冰排或制冷器件應(yīng)放在輔助容器和外包裝之間。樣本送檢單、樣本接收證明、準運證書、運送人員資質(zhì)證明、發(fā)送和接收人員信息等相關(guān)文件材料應(yīng)當放入防水的塑料袋中，置于外包裝箱內(nèi)上方。（五）樣本運輸前應(yīng)當聯(lián)系接收機構(gòu)實驗室，告知樣本送檢目的、樣本種類、數(shù)量和預(yù)計送達的時間等。（六）負責(zé)運輸樣本的醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)，應(yīng)當按照《管理規(guī)定》有關(guān)要求，向省級衛(wèi)生行政主管部門或中國疾病預(yù)防控制中心申請辦理《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本準運證書》。在每次運輸結(jié)束后，運輸單位須將運輸情況向省級衛(wèi)生行政主管部門或中國疾病預(yù)防控制中心書面報告。（七）包裝合格的樣本（三層包裝系統(tǒng)）可通過航空或陸路運輸。陸路運輸應(yīng)專車運輸，并由2名或以上經(jīng)培訓(xùn)合格的人員護送。運輸途中樣本主容器應(yīng)始終保持直立，運輸車輛內(nèi)應(yīng)攜帶具備清單及有效物品的應(yīng)急處置箱（包），其中包括個體防護裝備、感染性材料溢灑處置器具、皮膚及創(chuàng)口處置器具、醫(yī)療廢物收集器具以及“生物危險”、“禁止通過”等警示標識。有關(guān)單位或者個人不得通過公共電（汽）車和城市鐵路運輸相關(guān)樣本。三、樣本接收和包裝開啟（一）負責(zé)樣本接收與包裝開啟的操作人員應(yīng)具備相應(yīng)的操作技能，通過生物安全培訓(xùn)并取得相應(yīng)資質(zhì)。（二）樣本包裝的開啟應(yīng)在生物安全二級及以上級別的實驗室進行。樣本送檢單、準運證書、人員上崗證等相關(guān)文件材料的核查、登記，以及相關(guān)風(fēng)險溝通/評估和開具樣本接收證明等工作應(yīng)在實驗室清潔區(qū)內(nèi)進行。（三）包裝開啟過程中，操作者要根據(jù)所處環(huán)境條件參照本標準第一條第二款相關(guān)要求適時加強防護。（四）實驗室操作人員應(yīng)規(guī)范接收檢測樣本、開啟包裝：1.操作人員應(yīng)當在生物安全柜內(nèi)開啟三層包裝系統(tǒng)的第二層輔助容器，并仔細檢查主容器表面有否破損、泄漏或殘留物，發(fā)現(xiàn)異常情況應(yīng)當立即執(zhí)行實驗室應(yīng)急處置程序，同時登記并報告實驗室負責(zé)人。2.操作者應(yīng)當在生物安全柜內(nèi)消毒主容器表面，核對樣本信息，進行下一步的實驗室檢測活動，或轉(zhuǎn)移至指定的保存/保藏地點及位置。（五）包裝開啟和樣本核查結(jié)束后，應(yīng)當在實驗室清潔區(qū)完成交接手續(xù)，開具樣本接收證明，交還外包裝和輔助容器等。實驗室操作人員應(yīng)對所有異常情況進行詳細記錄，運輸和接受樣本的雙方人員簽字確認。四、樣本分裝和檢測（一）負責(zé)樣本分裝、檢測的操作人員應(yīng)當具備人感染H7N9禽流感病毒相應(yīng)的實驗操作能力，經(jīng)過生物安全培訓(xùn)，并取得培訓(xùn)合格資質(zhì)。（二）實驗室用于人感染H7N9禽流感病毒檢測的設(shè)備、設(shè)施必須運行良好，生物安全柜和壓力蒸汽滅菌器應(yīng)當年檢合格。（三）在生物安全二級實驗室從事相關(guān)實驗活動時，操作人員應(yīng)當配戴眼罩、N95及以上水平的醫(yī)學(xué)防護口罩，穿戴防護服、雙層乳膠手套等個