DB37T 4754.2-2024動物疫病鑒別檢測技術(shù) 第2部分：兔出血癥病毒經(jīng)典型與兔出血癥病毒2型

37Animaldiseaseidentificationanddetectiontechnology—Part2:RHDVandRHD本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定動物疫病是影響山東省畜牧業(yè)健康發(fā)展的重要因素之一。不同病原或者相同病原的不同血清型/基動物疫病鑒別檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的建立，規(guī)定了對不同病原、相同病原的不同血清型/基因型以及弱毒疫苗兔出血癥（Rabbithaemorrhagicdisease，RHD）是由杯狀病毒科（Caliciviridae）兔病毒屬康發(fā)展。1984年，由RHDV經(jīng)典型引起的RHD首先在我國暴發(fā)，繼而在各大洲廣泛流行，并不斷發(fā)生遺傳演變，但抗原性保持相對穩(wěn)定。2010年，由RHDV2型引發(fā)的兔出血癥首先在法國暴發(fā)，不僅導(dǎo)致育肥兔RHDV2型的檢測技術(shù)對于該病的防控具有重要意義?！秳游镆卟¤b別檢測技術(shù)》擬由三個部分構(gòu)Ⅰ熒光RT-PCR鑒別檢測技術(shù)的操作，便于技術(shù)的操作，便于檢測技術(shù)在禽腺病毒病臨床診斷、流行病學(xué)調(diào)查、檢驗檢疫等方面動物疫病鑒別檢測技術(shù)第2部分：兔出血癥病毒經(jīng)典型與兔出血癥病毒2型2型（Rabbithaemorrhagicdiseasevirus2,RHDV2）實時熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Real-timeRT-本文件適用于兔及其產(chǎn)品中RHDV經(jīng)典型與RHDV2GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范曲線分析，由于擴增產(chǎn)物GC含量差異導(dǎo)致Tm值不同。本文件引物可通用檢測RHDV經(jīng)典型與RHDV2型靶基因，但由于RHDV經(jīng)典型擴增產(chǎn)物GC含量高于RHDV2型擴增產(chǎn)物，導(dǎo)致Tm值明顯高于后者，并依此適用于）：5.975%乙醇。取1mLDEPC加入水中至1000mL，充分震蕩混勻，靜置24h后，121℃高壓滅菌15min，4℃保存?zhèn)?.12乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝劑。2O1.5g，溶于80mL水中，充分溶解后定容至100mL，置于高壓滅5.14無核酸酶離心管（1.5mL）。5.16陽性對照樣品和陰性對照樣品。RHDV6.4微型低速離心機：轉(zhuǎn)速≤6000r/min。盈，用一次性無菌注射器（2.5mL）針頭穿刺靜脈采血1.8mL，并將新鮮血液與乙二胺四乙酸劑混合，體積比為9:1（V:V）。血液樣品保存和運輸按照NY在A型Ⅱ級生物安全柜處理。電子天平稱取1將血液樣品裝入1.5mL無核酸酶離心管中，-20℃冷凍30min后置室溫融化5min，反復(fù)3次，4℃、8.2核酸提取待檢樣品、陰性對照及陽性對照樣品的RNA可使用TRIzol試劑提取，也可使用商品化病毒核酸提取8.2.2.1根據(jù)待檢樣品、陽性對照和陰性對照的份水0.40.42.07.28.3.2.2加樣將制備的陰性對照、待檢樣品、陽性對照RT產(chǎn)物各2μL——第三階段：熔解曲線分析，按照各品牌儀器設(shè)備推薦程序進行。9結(jié)果判定根據(jù)儀器噪聲情況對閾值設(shè)定進行調(diào)整，以閾值線剛好9.3結(jié)果描述及判定被檢樣品同時符合9.3.1與9.3.2陰性對照、陽性對照、陽性樣品檢測結(jié)果的描述時，且Tm相差約RHDV陰性、陽性樣品Real-timePCR擴增曲線及熔解曲線見RHDV2陰性、陽性樣品Real-timePCR擴增曲線及熔解曲RHDV與RHDV2陰性、陽性樣品Real-timePCR擴增曲線及熔解曲線比較1——RHDV陽性對照樣品（Tm值