《牛羊巴氏桿菌病分型診斷技術(shù)規(guī)程》

ICS01.040.65

CCSB04TB

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/NAIA×××-××××

牛羊巴氏桿菌病分型診斷技術(shù)規(guī)程

Technicalspecificationforclassificationanddiagnosisof

pasteurellosisincattleandsheep

(征求意見(jiàn)稿)

××××-××-××發(fā)布××××-××-××實(shí)施

寧夏化學(xué)分析測(cè)試協(xié)會(huì)發(fā)布

發(fā)布

牛羊巴氏桿菌病分型診斷技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了規(guī)?；?chǎng)羊場(chǎng)牛羊巴氏桿菌病分型診斷與防治技術(shù)的術(shù)語(yǔ)和定義、流行病學(xué)、

病理變化、分型診斷的技術(shù)規(guī)程。

本文件適用于規(guī)?；?chǎng)羊場(chǎng)牛羊巴氏桿菌病分型TaqManqPCR鑒別診斷的檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用

文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）

適用于本文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范

NY/T564豬巴氏桿菌病診斷技術(shù)

NY/T5030無(wú)公害農(nóng)產(chǎn)品獸藥使用準(zhǔn)則

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1多殺性巴氏桿菌Pasteurellamultocida,P.multocida

是指主要存在于動(dòng)物口腔、鼻咽和上呼吸道，可引起多種家畜、野生動(dòng)物及人類(lèi)的感染的一種

重要的人畜共患疾病病原體。

4儀器

4.1革蘭氏染液；

4.2PCR預(yù)混液；

4.3DL-500DNAMaker；

4.4pMD18-TVector；

4.5Taq-HSProbeqPCRPremix；

2

4.6二氧化碳培養(yǎng)箱；

4.7恒溫震蕩搖床（QYC-200）；

4.8CFX96Real-timePCR儀；

5診斷

5.1流行病學(xué)

多殺性巴氏桿菌病通常無(wú)明顯季節(jié)性，主要呈散發(fā)或地方流行性特征。封閉潮濕的氣候條件下，

應(yīng)激和動(dòng)物的整體健康不良情況本病更易發(fā)生，寒冷季節(jié)呈散發(fā)。誘發(fā)因素是病毒混合感染、斷奶

應(yīng)激、管理不善、飲食改變、天氣變化和運(yùn)輸?shù)取?/p>

5.2臨床癥狀

感染特征是急性呼吸道疾病，伴有高熱、流鼻涕、大量流涎，隨后迅速出現(xiàn)呼吸窘迫、膿毒性

休克，伴有出血，短時(shí)間內(nèi)死亡。潛伏期一般為2-5天，幼畜抵抗力較弱，較為易感。由于急性膿

毒癥發(fā)病較快，常迅速死亡，發(fā)病后死亡率接近100%。

5.3病理變化

氣管、肺、小腸和肝臟的極度充血。

5.4細(xì)菌分離及培養(yǎng)

巴氏桿菌培養(yǎng)基配制見(jiàn)附錄A.1，實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682規(guī)定。

牛羊動(dòng)物采樣選取精棉迅速擦去其鼻口周?chē)奈畚?，選用一次性無(wú)菌棉簽，插入牛羊鼻腔內(nèi)5～

10cm深度，輕輕旋轉(zhuǎn)后抽出棉簽，并置于裝有2mL生理鹽水的無(wú)菌管中，按照NY/T541規(guī)定貯

存樣品。后將采樣物接種于5%脫纖維羊血固體培養(yǎng)基的樣品在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，培

養(yǎng)基上可觀察到淡灰白色、邊緣整齊、表面光滑、粘稠、濕潤(rùn)的露珠狀小菌落，無(wú)溶血現(xiàn)象。菌落

形態(tài)參見(jiàn)B.1。

5.5革蘭氏染色及鏡檢

用無(wú)菌接種環(huán)取一環(huán)無(wú)菌生理鹽水在潔凈載玻片上涂布呈直徑1cm大小的水膜。挑取單個(gè)菌

落均勻涂布在水膜后火焰固定。進(jìn)行革蘭氏染色。首先結(jié)晶紫染色液，染色1min~2min，流水緩

慢沖洗，干燥；繼續(xù)滴加革蘭氏碘液，染色1min~2min，流水緩慢沖洗，干燥；然后滴加95%

的乙醇，脫色10s~30s，流水緩慢沖洗，干燥；最后滴加復(fù)染液，復(fù)染1min，流水緩慢沖洗，自

然干燥。

5.6鏡檢

牛羊多殺巴氏桿菌為革蘭氏染色陰性、短小桿菌或球桿菌。

5.7巴氏桿菌分型

根據(jù)莢膜（A，B，D，E和F）的組成分為不同的血清型，根據(jù)表達(dá)的LPS抗原可進(jìn)一步分為

16種血清型。

5.8分離菌株多重TaqManqPCR鑒別診斷

5.8.1細(xì)菌基因組DNA模板制備：按照NY/T564中4.4.4的規(guī)定制備或選取市場(chǎng)售賣(mài)試劑盒進(jìn)行

DNA模板提取。

5.8.2引物：根據(jù)巴氏桿菌牛羊不同分型的基因序列（見(jiàn)附錄B），設(shè)計(jì)5對(duì)引物，商業(yè)合成，引物

序列參見(jiàn)附錄B.1。

5.8.3PCR反應(yīng)體系為20μL體系，反應(yīng)體系見(jiàn)附錄C.2。

5.8.4PCR反應(yīng)程序：95℃5min；95℃10s；59℃30s收集熒光信號(hào)，39Cycles。

6結(jié)果判定

反應(yīng)結(jié)果應(yīng)同時(shí)符合條件a，條件b，和條件c中的一項(xiàng)，否則實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)效。

a)符合5.1、5.2的特征判斷為疑似病例。

b)符合5.4、5.6和5.7的特征判斷為確診病例。

c)5.8中出現(xiàn)大小為99bp的hyaC-hyaD擴(kuò)增帶的為A型牛羊巴氏桿菌；出現(xiàn)大小為114bp的

bcbD擴(kuò)增帶為B型牛羊巴氏桿菌；出現(xiàn)大小為325bp的Cpa毒素?cái)U(kuò)增帶和大小為236bp的Cpb擴(kuò)

增帶的為C型牛羊巴氏桿菌；出現(xiàn)大小為107bp的dcbF擴(kuò)增帶的為D型牛羊巴氏桿菌；出現(xiàn)大小

為121bp的ecbJ擴(kuò)增帶的為E型產(chǎn)牛羊巴氏桿菌；出現(xiàn)大小為123bp的fcbD擴(kuò)增帶的為F型牛

羊巴氏桿菌。

7防控技術(shù)

7.1疫苗免疫

接種方法：用多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗進(jìn)行預(yù)防，體重100kg以上牛皮下或肌肉注射6mL，

低于100kg牛注射4mL，羊注射2mL。完成初免后1個(gè)月進(jìn)行加強(qiáng)免疫，基礎(chǔ)免疫完成后每間隔9

個(gè)月進(jìn)行加強(qiáng)免疫，高發(fā)地區(qū)每6個(gè)月免疫一次。

7.2藥物治療

推薦使用藥物：泰拉霉素、加米霉素、可那霉素、長(zhǎng)效土霉素、氟苯尼考。采用幾種康生物交

替使用，避免出現(xiàn)耐藥性。藥物使用符合NY/T5030規(guī)定。

4

附錄A

巴氏桿菌形態(tài)特征

B.1巴氏桿菌菌落形態(tài)

附錄B

C.1分型不同基因特異性引物和探針序列列表

表1分型不同基因特異性引物和探針序列列表

目的基因引物名稱(chēng)引物序列片段長(zhǎng)度

（5′→3′）（bp）

hyaC-hyaD-FGGGCATCACAAGGTATGTTTATG

hyaC-hyaDhyaC-hyaD-RTCAATTGACTGGCAGGATGT99

hyaC-hyaD-PTAATCGTCAGAAGCTCATGCGCTAGC

bcbD-FCTGAGTGTGGATGCGTTACT

bcbDbcbD-RGGCAGCTGCAACATTCTTC114

bcbD-PATAACGACTCTGCTGGTTTACCGTGG

dcbF-FGGTATCCTGCTGACTACATAAA

dcbFdcbF-RCTTGTTGACTCTACTTGGGAATA107

dcbF-PAGCAGCAATTGGATTACATGGTGTT

ecbJ-FGCTATGCCAATGGTAGCTTAT

ecbJecbJ-RTCAGCTTTGCCAACCATATC121

ecbJ-PACAACTATTTAGCGGATATGGCTCTGCC

fcbD