現(xiàn)代生物技術(shù)-06蛋白質(zhì)工程

6蛋白質(zhì)工程(gōngchéng)學(xué)習(xí)目的(mùdì)

初步了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，以及蛋白質(zhì)分子設(shè)計和蛋白質(zhì)修飾和表達(dá)等的基本原理。了解如何利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)和其他相關(guān)技術(shù)獲得更加符合人類需求且比天然蛋白質(zhì)更優(yōu)良的蛋白質(zhì)。共六十七頁6蛋白質(zhì)工程(gōngchéng)6.1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)6.1.1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本(jīběn)構(gòu)件

蛋白質(zhì)、核酸、多糖和脂類等生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能。蛋白質(zhì)工程共六十七頁6.1.1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(jiégòu)的基本構(gòu)建蛋白質(zhì)的化學(xué)組成基本元素:有機元素:碳、氫、氧和氮無機元素:堿金屬、堿土金屬和重金屬

蛋白質(zhì):、胨、肽氨基酸分類:非極性R基氨基酸、不帶電荷(diànhè)的極性R基氨基酸、帶正電荷的R基氨基酸、帶負(fù)電荷的R基酸性氨基酸

蛋白質(zhì)工程共六十七頁6.1.1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(jiégòu)的基本構(gòu)建

氨基酸的物理性質(zhì)

無色結(jié)晶特殊晶型溶點極高兩性離子形式存在氨基和羧基(suōjī)接受質(zhì)子和釋放質(zhì)子

兩性電解質(zhì)蛋白質(zhì)工程共六十七頁

蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)各種氨基酸的簡寫(jiǎnxiě)符號名稱三字母(zìmǔ)符號單字母(zìmǔ)符號名稱三字母(zìmǔ)符號單字母(zìmǔ)符號丙氨酸AlaA異亮氨酸IleI精氨酸ArgR亮氨酸LeuL天冬酰胺AsnN賴氨酸LysK天冬氨酸AspD蛋氨酸MetMAsn或AspAsxB苯丙氨酸PheF半胱氨酸CysC脯氨酸ProP谷氨酰胺GlnQ絲氨酸SerS谷氨酸GluE蘇氨酸ThrTGln或GluGlxZ色氨酸TrpW甘氨酸GlyG酪氨酸TyrY組氨酸HisH纈氨酸ValV6.1.1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本構(gòu)建蛋白質(zhì)工程共六十七頁蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)(jiégòu)多肽鏈:由許多(xǔduō)氨基酸按一定的排列順序通過肽鍵相連而成。酰胺鍵:一個氨基酸的氨基與另一氨基酸的羧基縮合失去一分子水。

肽鍵結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)工程共六十七頁共六十七頁多肽主鏈的空間(kōngjiān)限制

(一)酰胺平面與α-碳原子的二面角(φ和ψ)

(二)可允許的φ和ψ值：拉氏構(gòu)象圖二面角(φ和ψ)所規(guī)定的構(gòu)象能否存在取決于兩個相鄰(xiānɡlín)肽單位中非共價鍵合原子之間的接近有無阻礙。共六十七頁蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)(jiégòu)

XYZ人ThrThrIle豬AlaThrIle牛AlaAlaVal圖6-2豬、牛和人的胰島素的一級結(jié)構(gòu)(jiégòu)蛋白質(zhì)工程共六十七頁6.1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(jiégòu)基礎(chǔ)6.1.2蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)分子結(jié)構(gòu):一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)。分子構(gòu)象:空間結(jié)構(gòu)、高級結(jié)構(gòu)、立體結(jié)構(gòu)、三維結(jié)構(gòu)。二級結(jié)構(gòu)

:指多肽鏈主鏈骨架中的若干肽段，各自沿著某個軸盤旋或折疊，并以氫鍵維系，從而形成(xíngchéng)有規(guī)則的構(gòu)象。

α螺旋、β折疊和β轉(zhuǎn)角蛋白質(zhì)工程共六十七頁6.1.2蛋白質(zhì)的高級(gāojí)結(jié)構(gòu)α螺旋(luóxuán)結(jié)構(gòu)

β折疊結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)工程

共六十七頁6.1.2蛋白質(zhì)的高級(gāojí)結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu):在三維空間中沿著多方向進(jìn)行卷曲、折疊、盤繞而成的近似球形的結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)構(gòu)象作用力:R基之間的氫鍵(qīnɡjiàn)

非極性R基之間的疏水基相互作用α螺旋和β折疊中的肽鏈內(nèi)或肽鏈間的氫鍵帶正負(fù)電荷的R基之間的離子鍵蛋白質(zhì)工程

共六十七頁共六十七頁穩(wěn)定(wěndìng)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的作用力a離子鍵b氫鍵(qīnɡjiàn)c疏水鍵d范德華引力

共六十七頁6.1.2蛋白質(zhì)的高級(gāojí)結(jié)構(gòu)亞基(三級結(jié)構(gòu))一條多肽鏈組成。數(shù)條多肽鏈組成，這些多肽鏈通常(tōngcháng)以二硫鍵相連接成為亞基。四級結(jié)構(gòu)亞基聚合而成亞基之間非共價鍵結(jié)合均一四級結(jié)構(gòu)非均一四級結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)工程共六十七頁6.1.2蛋白質(zhì)的高級(gāojí)結(jié)構(gòu)維持四級結(jié)構(gòu)的主要力:

疏水鍵、氫鍵(qīnɡjiàn)、離子鍵和范德華引力

常見的聚合體:

二聚體、三聚體、四聚體、五聚體，最多可聚合成六十聚體

蛋白質(zhì)工程共六十七頁6.1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(jiégòu)基礎(chǔ)6.1.3蛋白質(zhì)分子(fēnzǐ)之間的相互作用

蛋白質(zhì)工程共六十七頁6.1.3蛋白質(zhì)分子(fēnzǐ)之間的相互作用鉬鐵蛋白和鐵蛋白相互作用示意圖(引自Schlessmanetal.)鐵蛋白鉬鐵蛋白蛋白質(zhì)工程(gōngchéng)共六十七頁6.1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(jiégòu)基礎(chǔ)6.1.4蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(jiégòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)必須具備特定的結(jié)構(gòu)，才能表現(xiàn)特定的功能，在蛋白質(zhì)肽鏈中有一些基團(tuán)對特定功能而言是必需基團(tuán)，另一些是非必需基團(tuán)。在體內(nèi)，蛋白質(zhì)分子是如何利用它的特定結(jié)構(gòu)執(zhí)行特定的生物功能的。蛋白質(zhì)工程共六十七頁6.1.4蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能(gōngnéng)的關(guān)系同源(tónɡyuán)蛋白質(zhì)指在不同的有機體中實現(xiàn)同一功能的蛋白質(zhì)，但這些同源蛋白質(zhì)中的氨基酸序列存在著種屬的差異性。

結(jié)構(gòu)域

多肽鏈之間以共價鍵方式連接功能區(qū)域

蛋白質(zhì)工程共六十七頁6.1.4蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(jiégòu)與功能的關(guān)系

鐵蛋白的分子結(jié)構(gòu)是由鐵核和蛋白質(zhì)殼組成的。鐵蛋白的隧道可分為電子隧道和物質(zhì)交換隧道，前者起著傳遞電子的作用，后者起著物質(zhì)交換的通道作用。鐵蛋白蛋白質(zhì)殼通過柔性調(diào)節(jié)產(chǎn)生(chǎnshēng)電子傳遞現(xiàn)象。蛋白質(zhì)工程共六十七頁6.1.4蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(jiégòu)與功能的關(guān)系

鐵蛋白分子結(jié)構(gòu)(fēnzǐjiéɡòu)圖A：蛋白質(zhì)殼；B：鐵核；C：三相物質(zhì)交換隧道A蛋白質(zhì)工程共六十七頁6.1.4蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能(gōngnéng)的關(guān)系proteaseinhibitor-proteasecomplexinhibitor

絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serpins)抑制(yìzhì)蛋白酶活性的途徑與機理蛋白質(zhì)工程共六十七頁6.1.4蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能(gōngnéng)的關(guān)系

模擬(mónǐ)核小體分子

蛋白質(zhì)工程共六十七頁6蛋白質(zhì)工程(gōngchéng)6.2蛋白質(zhì)工程的研究(yánjiū)方法6.2.1蛋白質(zhì)工程的研究策略蛋白質(zhì)工程的基本途徑：從預(yù)期功能出發(fā)，設(shè)計期望的結(jié)構(gòu)，合成目的基因且有效克隆表達(dá)或通過誘變、定向修飾和改造等一系列工序，合成新型優(yōu)良蛋白質(zhì)。

蛋白質(zhì)工程共六十七頁基因工程在原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)，這些天然蛋白質(zhì)是生物在長期進(jìn)化(jìnhuà)過程中形成的，它們的結(jié)構(gòu)和功能符合特定物種生存的需要，卻不一定完全符合人類生產(chǎn)和生活的需要。一、蛋白質(zhì)工程(gōngchéng)崛起的緣由共六十七頁6.2.1蛋白質(zhì)工程的研究(yánjiū)策略

蛋白質(zhì)工程的主要研究手段:利用所謂的反向生物學(xué)技術(shù)，其基本思路是按期望的結(jié)構(gòu)尋找最適合的氨基酸序列，通過計算機設(shè)計，進(jìn)而模擬特定的氨基酸序列在細(xì)胞內(nèi)或在體內(nèi)環(huán)境中進(jìn)行多肽折疊而成三維結(jié)構(gòu)的全過程，并預(yù)測蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和表達(dá)(biǎodá)出生物學(xué)功能的可能及其高低程度。

蛋白質(zhì)工程共六十七頁6.2.1蛋白質(zhì)工程的研究(yánjiū)策略蛋白質(zhì)工程(gōngchéng)共六十七頁三、蛋白質(zhì)工程(gōngchéng)的基本原理基因(jīyīn)DNA氨基酸序列多肽鏈蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)期功能生物功能mRNA轉(zhuǎn)錄翻譯折疊DNA合成分子設(shè)計共六十七頁實例(shílì)1：干擾素的保存天然的干擾素在體外保存相當(dāng)困難。如果將其分子上的一個(yīɡè)半胱氨酸變成絲氨酸，那么在—70℃的條件下，可以保存半年。蛋白質(zhì)工程實例：共六十七頁實例(shílì)2：玉米中賴氨酸的含量比較低如果對賴氨酸合成過程中的兩個關(guān)鍵(guānjiàn)酶進(jìn)行改造,可以使玉米葉片和種子中的游離賴氨酸分別提高5倍和2倍。原因：賴氨酸合成過程中兩個關(guān)鍵酶——天冬氨酸激酶和二氫吡啶二羧酸合成酶的活性，受細(xì)胞內(nèi)賴氨酸濃度的影響。當(dāng)賴氨酸濃度達(dá)到一定量時，就會抑制這兩種酶的活性。共六十七頁實例(shílì)3:工業(yè)用酶許多工業(yè)用酶是在改變天然酶的特性后，才使之適應(yīng)(shìyìng)生產(chǎn)和使用需要的。共六十七頁在已研究過的幾千種酶中，只有極少數(shù)可以應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，絕大多數(shù)酶都不能應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，這些酶雖然在自然狀態(tài)下有活性，但在工業(yè)生產(chǎn)中沒有活性或活性很低。這是因為工業(yè)生產(chǎn)中每一步的反應(yīng)體系中常常會有酸、堿或有機溶劑存在(cúnzài)，反應(yīng)溫度較高，在這種條件下，大多數(shù)酶會很快變性失活。提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性是工業(yè)生產(chǎn)中一個非常重要的課題。一般來說，提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性包括：延長酶的半衰期，提高酶的熱穩(wěn)定性，延長藥用蛋白的保存期，抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性喪失等。3、蛋白質(zhì)工程(gōngchéng)產(chǎn)物：是自然界原本不存在的新的蛋白質(zhì)。共六十七頁6.2蛋白質(zhì)工程的研究(yánjiū)方法6.2.2蛋白質(zhì)的全新設(shè)計(shèjì)設(shè)計目標(biāo)的選擇蛋白質(zhì)全新設(shè)計功能設(shè)計、結(jié)構(gòu)設(shè)計。研究重點和難點從結(jié)構(gòu)設(shè)計出發(fā)，從蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)開始，以摸索蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)工程共六十七頁6.2.2蛋白質(zhì)的全新(quánxīn)設(shè)計蛋白質(zhì)設(shè)計技術(shù)與方法常用的蛋白質(zhì)設(shè)計思路是否存在蛋白質(zhì)多聚體狀態(tài)；二級結(jié)構(gòu)與預(yù)期目標(biāo)是否吻合。是否具有預(yù)定的三級結(jié)構(gòu)。圓二色譜和核磁共振技術(shù)可用于研究蛋白質(zhì)。是否以單分子或多聚體形式存在。三級結(jié)構(gòu)測定目前主要依靠熒光和核磁共振技術(shù)。體積排阻色譜法也可以用于判斷分子體積大小(dàxiǎo)、聚合體數(shù)目和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是處于無規(guī)則狀態(tài)或三級結(jié)構(gòu)等生化參數(shù)。蛋白質(zhì)工程共六十七頁6.2.2蛋白質(zhì)的全新(quánxīn)設(shè)計天然(tiānrán)的鋅指多肽FSD-1多肽(從頭設(shè)計)蛋白質(zhì)工程共六十七頁6.2蛋白質(zhì)工程的研究(yánjiū)方法6.2.3改變現(xiàn)有蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分離純化目標(biāo)(mùbiāo)蛋白質(zhì)。分析目標(biāo)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)；分析目標(biāo)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)以及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。根據(jù)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)設(shè)計引物，克隆目的基因。根據(jù)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及蛋白質(zhì)改造的目的設(shè)計改造方案。對目的基因進(jìn)行人工定點突變。改造后的基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)。分離純化表達(dá)的蛋白質(zhì)并分析其功能，評價是否達(dá)到設(shè)計目的。蛋白質(zhì)工程共六十七頁6.2.3改變現(xiàn)有(xiànyǒu)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)

改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(jiégòu)的核心技術(shù)

基因人工定點突變技術(shù)M13載體法PCR擴增法蛋白質(zhì)工程共六十七頁Consequencesofpointmutationswithinacodingsequence(gene)fortheproteinSilentmutations:->changeinnucleotidesequencewithnoconsequencesforproteinsequence

->Changeofaminoacid->truncationofprotein->changeofc-terminalpartofprotein->changeofc-terminalpartofprotein共六十七頁6.2.3改變現(xiàn)有(xiànyǒu)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)M13載體法該法的原理是利用人工合成帶突變(tūbiàn)位點的寡聚核苷酸作為引物，利用M13噬菌體載體系統(tǒng)合成突變(tūbiàn)基因。蛋白質(zhì)工程共六十七頁M13載體(zàitǐ)法M13載體法基因人工定點(dìnɡdiǎn)突變示意圖（引自吳乃虎，1998）蛋白質(zhì)工程共六十七頁共六十七頁ＰＣＲ擴增法

該法的原理也是利用人工合成帶突變位點的誘變(yòubiàn)引物，通過ＰＣＲ擴增而獲得定點突變的基因。PCR定點誘變(yòubiàn)法可分為重組PCR定點誘變(yòubiàn)法和大引物誘變(yòubiàn)法兩種。

蛋白質(zhì)工程(gōngchéng)6.2.3改變蛋白質(zhì)的現(xiàn)有結(jié)構(gòu)共六十七頁重組(zhònɡzǔ)PCR定點突變法示意圖（引自吳乃虎，1998）

蛋白質(zhì)工程(gōngchéng)PCR擴增法共六十七頁

大引物誘變(yòubiàn)法示意圖（引自吳乃虎，1998）

蛋白質(zhì)工程(gōngchéng)PCR擴增法共六十七頁PCR技術(shù)適合(shìhé)進(jìn)行基因的定點誘變5`5`3`3`5`5`3`3`abcd5`3`3`5`變性(biànxìng)、退火5`5`3`3`加klenowDNA聚合酶5`3`5`3`加入引物a、d5`3`5`3`3`5`3`共六十七頁6蛋白質(zhì)工程(gōngchéng)

6.3蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用實例6.3.1胰蛋白酶

223個氨基酸殘基和以異亮氨酸為N端的單肽鏈。Arg117位自溶點的缺失突變，得到缺失突變體，其結(jié)果表明該突變體的穩(wěn)定性明顯提高。將酶分子表面的正電荷改變成負(fù)電荷，以提高胰蛋白酶催化活性中心His57的pKa值，在pH較高的條件下顯示(xiǎnshì)出對精氨酸具有更高的專一性。蛋白質(zhì)工程共六十七頁6.3蛋白質(zhì)工程(gōngchéng)的應(yīng)用實例

6.3.2人白細(xì)胞介素-2

由133個氨基酸殘基組成，共有三個半胱氨酸。二硫鍵的錯誤配對將降低(jiàngdī)其生物學(xué)活性并對人具有抗原性。用基因定點突變方法可將IL-2的125位Cys改為絲氨酸（Ser）或丙氨酸（Ala），避免錯誤配對的產(chǎn)生，而且其熱穩(wěn)定性等方面也有較明顯的改善。蛋白質(zhì)工程共六十七頁StabilityandActivityofVariousModifiedVersionsoftPA共六十七頁ModifyingMetalRequirementsSerineproteaseforlaundrydetergentRequirecalciumCalciuminducesconformationchangenecessaryforactivityModifyaminoacidsequencetoachieveconformationandstabilitywithoutcalcium共六十七頁蛋白質(zhì)高級(gāojí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測

共六十七頁HomologyModeling1.搜索已知三級結(jié)構(gòu)的同源蛋白質(zhì)序列(模板)PSI-BLASTmultiplesequencealignment(MSA)2.選取與給定序列相似性最高的結(jié)構(gòu)作為模板3.將氨基酸殘基替換到結(jié)構(gòu)模板中對應(yīng)的位置上，降低(jiàngdī)自由能4.準(zhǔn)確性好序列相似性高

模型可靠性高>30%sequenceidentity5.常用工具：MODELLER，Swiss-model共六十七頁截至2008年6月，與迅速增長的龐大基因組核酸數(shù)據(jù)相反，已知三級結(jié)構(gòu)的蛋白數(shù)量(shùliàng)還不到6萬個。（來自蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)PDB的統(tǒng)計）共六十七頁從待測蛋白質(zhì)序列出發(fā)，搜索(sōusuǒ)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（如PDB,SWISS-PROT等），得到許多相似序列（同源序列），選定其中一個（或幾個）作為待測蛋白質(zhì)序列的模板；待測蛋白質(zhì)序列與選定的模板進(jìn)行再次比對，插入各種可能的空位使兩者的保守位置盡量對齊；建模：調(diào)整待測蛋白序列中主鏈各個原子的位置，產(chǎn)生與模板相同或相似的空間結(jié)構(gòu)，待測蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)模型；利用能量最小化原理，使待測蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)處于能量最小的位置。同源建模法預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)一般(yībān)由四步完成：共六十七頁SWISS-MODEL蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(jiégòu)預(yù)測

SWISS-MODEL利用同源建模的方法實現(xiàn)對一段未知序列的三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。該服務(wù)創(chuàng)建于1993年，開創(chuàng)了自動建模的先河(xiānhé)，并且它是訖今為止應(yīng)用最廣泛的免費服務(wù)之一。//SWISS-MODEL.html

共六十七頁FirstApproachmode(簡捷模式）這種模式提供一個簡捷的用戶介面：用戶只需要輸入一條氨基酸序列，服務(wù)器就會自動選擇合適的模板。如果一條模板與提交的目標(biāo)序列相似度大于25%，建模程序(chéngxù)就會自動開始運行，結(jié)果以Email形式返回。共六十七頁常用觀看蛋白(dànbái)三級結(jié)構(gòu)的軟件RasMolWPDBCn3D共六十七頁共六十七頁共六十七頁共六十七頁6.4蛋白質(zhì)組學(xué)針對有關(guān)基因或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的生物體或組織/細(xì)胞，建立其蛋白質(zhì)組或亞蛋白質(zhì)組及其蛋白質(zhì)組連鎖群，即組成性蛋白質(zhì)組學(xué)研究。以重要(zhòngyào)生命過程或人類重大疾病為對象，進(jìn)行重要(zhòngyào)的生理/病理體系或過程的局部蛋白質(zhì)研究，即比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究

。蛋白質(zhì)組學(xué)支撐技術(shù)平臺或生物信息學(xué)研究。6蛋白質(zhì)工程(gōngchéng)蛋白質(zhì)工程共六十七頁6.4蛋白質(zhì)組學(xué)

部分醫(yī)學(xué)科學(xué)(kēxué)重點研究領(lǐng)域研究細(xì)胞的增殖、分化、異常轉(zhuǎn)化、腫瘤形成等方面，涉及白血病、乳腺癌、結(jié)腸癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤等重大疾病。

蛋白質(zhì)工程(gōngchéng)共六十七頁目前國內(nèi)研究進(jìn)展

重大疾?。ㄈ绺伟?ɡānái)）、維甲酸誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡啟動模型。