【生工技術(shù)】多重?zé)晒舛縋CR熒光選擇指南

【生工技術(shù)】多重?zé)晒舛縋CR熒光選擇指南多重qPCR的優(yōu)勢(shì)常規(guī)的qPCR，在一個(gè)反應(yīng)管中僅檢測(cè)單一指標(biāo)，如果檢測(cè)的指標(biāo)很多或者檢測(cè)的樣本很多，對(duì)qPCR試劑以及樣本無(wú)疑是一種巨大的浪費(fèi)。在多重qPCR中，單反應(yīng)管擴(kuò)增檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)。每一個(gè)靶標(biāo)都被一套不同（或相同）的引物擴(kuò)增，并且一個(gè)特異的探針區(qū)分每一個(gè)PCR擴(kuò)增。因此，你可以快速測(cè)量幾個(gè)靶標(biāo)或目的基因的表達(dá)水平。這種多個(gè)指標(biāo)在單個(gè)反應(yīng)管中同時(shí)完成檢測(cè)的方法極大地減少了相關(guān)試劑的用量，即使擁有足夠的qPCR酶，多重qPCR也會(huì)節(jié)省您的樣本處理時(shí)間及其他試劑耗材。多重qPCR的要求——以探針?lè)橹饔捎诙鄠€(gè)指標(biāo)是在一管內(nèi)完成檢測(cè)，要區(qū)分這幾個(gè)指標(biāo)的信號(hào)，就無(wú)法使用常規(guī)的SYBRGreenI染料來(lái)標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物。水解探針?lè)ㄊ亲畛Ｓ玫慕鉀Q方案，即針對(duì)每一個(gè)指標(biāo)，設(shè)計(jì)特異性的探針，利用不同探針上標(biāo)記的不同波長(zhǎng)的熒光基團(tuán)來(lái)區(qū)分每個(gè)指標(biāo)的熒光變化。多重qPCR探針的熒光基團(tuán)的要求1.避免熒光基團(tuán)相互干擾多重qPCR的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求比單一反應(yīng)體系的要復(fù)雜的多。檢測(cè)不同指標(biāo)的探針必須攜帶不同光譜范圍的熒光基團(tuán)。下圖是幾種常用的熒光基團(tuán)的發(fā)射光譜（圖片來(lái)自于IDT），由圖中可見(jiàn)，很多熒光光譜相近的熒光基團(tuán)，它們雖然最大發(fā)射波長(zhǎng)不同，但是在附近的波段內(nèi)還是會(huì)有相互重疊的，一定要避免熒光基團(tuán)發(fā)射光譜之間的相互干擾。2.根據(jù)熒光強(qiáng)度分配檢測(cè)指標(biāo)不同熒光基團(tuán)的熒光強(qiáng)度是有高有低的，例如FAM就是一個(gè)熒光強(qiáng)度相對(duì)較高的基團(tuán)，我們偏向于將其安排給相對(duì)表達(dá)量比較低的目的基因，而熒光強(qiáng)度相對(duì)較低的基團(tuán)可以用于檢測(cè)表達(dá)量比較高的如看家基因等，這樣會(huì)達(dá)到擴(kuò)增曲線平臺(tái)期接近的目的，結(jié)果會(huì)比較美觀。3.按照熒光定量PCR儀來(lái)選擇熒光基團(tuán)不同熒光定量PCR儀的激發(fā)光和發(fā)射光都是不相同的，因此需要根據(jù)對(duì)應(yīng)的儀器選擇適配的熒光基團(tuán)。目前最廣泛通用的熒光基團(tuán)為FAM（FITC），因此，絕大多數(shù)多重qPCR策略首選的一個(gè)通道為FAM。如果使用儀器不適配的熒光基團(tuán)，則在此之前必須對(duì)儀器針對(duì)這種熒光基團(tuán)進(jìn)行矯正。目前，主流的熒光定量PCR儀還是能夠支持較多通道的多重檢測(cè)的，小編根據(jù)IDT的數(shù)據(jù)進(jìn)行了整理，貢獻(xiàn)出下表供您選擇：4.搭配淬滅基團(tuán)的選擇在選完探針的熒光基團(tuán)之后，根據(jù)熒光基團(tuán)的種類(lèi)搭配淬滅基團(tuán)即可，多重qPCR并不要求淬滅基團(tuán)的不同，例如兩重qPCR分別選擇了FAM及VIC作為熒光基團(tuán)，淬滅基團(tuán)可以統(tǒng)一選擇BHQ-1。除此之外，多重qPCR還需要優(yōu)化引物探針序列的特異性，防止其相互產(chǎn)生干擾；確定最佳的引物