海南師范大學(xué)海龜救助站救助海龜腸道菌群結(jié)構(gòu)特征分析

海南師范大學(xué)海龜救助站救助海龜腸道菌群結(jié)構(gòu)特征分析摘要：本研究以海南師范大學(xué)海龜救助站救助的海龜為研究對象，通過海龜糞便無損傷取樣，基于16SrRNA基因測序技術(shù)對救助海龜腸道細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。本研究共采取了3種海龜?shù)?3份糞便樣本和5份海水樣本，結(jié)果表明，海龜腸道中主要分布的菌群有擬桿菌門(43.75%)、厚壁菌門(33.4%)和梭桿菌門(13.89%)；綠海龜比玳瑁擁有更高的腸道菌群多樣性；玳瑁和太平洋麗龜腸道菌群中梭桿菌門占比顯著高于綠海龜(P＜0.05)，這可能與其飲食結(jié)構(gòu)相匹配。此外，海水中發(fā)現(xiàn)了龐大的微生物群落，其中發(fā)現(xiàn)了人畜共患致病菌(Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、Serratia)，志愿者在清潔龜池時(shí)務(wù)必做好防護(hù)以免感染。本研究豐富了海龜腸道微生物的生理學(xué)資料，并為未來海龜救助及放歸的條件提供指導(dǎo)。關(guān)鍵詞：海龜；腸道菌群；16SrRNA基因；海龜救助

目錄TOC\o"1-3"\h\u引言 41.研究方法 51.1.研究對象 51.2.樣品采集 61.3.樣品測序方法 62.結(jié)果 72.1.PCR擴(kuò)增結(jié)果 72.2.rRNA測序結(jié)果 82.3.Alpha和Beta多樣性分析 92.4.菌群組成和相對豐度 122.4.1.三種海龜腸道微生物群落組成結(jié)構(gòu)分析 122.4.2.海水與海龜微生物群落組成結(jié)構(gòu)比較分析 143.討論 164.結(jié)論 18參考文獻(xiàn) 19致謝 24

引言海龜是海洋生態(tài)系統(tǒng)的旗艦物種(Hamannetal.,2010)，對海洋生態(tài)系統(tǒng)的健康至關(guān)重要(Burkholderetal.,2013;Bloodgoodetal.,2020)，如維持珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)，并將基本營養(yǎng)物質(zhì)從海洋運(yùn)送到海灘和海岸沙丘等(Abdelrhmanetal.,2016)。目前全世界有7種海龜，全部被列入《瀕危野生動植物國際貿(mào)易公約》(CITES公約)附錄Ⅰ，其中分布在中國的海龜有五種，綠海龜(Cheloniamydas)、紅海龜(Carettacaretta)、棱皮龜(Dermochelyscoriacea)、玳瑁(Eretmochelysimbricata)和太平洋麗龜(Lepidochelysolivacea)，在我國，這5種海龜已全部列為國家一級重點(diǎn)保護(hù)野生動物。近年來，由于濫捕濫殺、非法貿(mào)易、過度開發(fā)、漁業(yè)誤捕及海洋污染等人為因素和環(huán)境因素的威脅(Chanetal.,2008;Hawkesetal.,2009)，海龜受傷擱淺的案例不斷增加，但僅一小部分受傷后的海龜會被送到救援中心進(jìn)行救助，恢復(fù)后放歸海洋。海南師范大學(xué)海龜救助站多年來收容和救助來自各地的海龜，通過救助、馴養(yǎng)等，經(jīng)評價(jià)健康后，將海龜放歸大海。但目前大量的放歸活動都未對放歸海龜?shù)牟≡瓟y帶狀況進(jìn)行有效的風(fēng)險(xiǎn)評估(Wu,2023)，這可能對海龜?shù)姆N群健康帶來威脅，海龜是高度洄游生物，其洄游路徑長，沿途所經(jīng)過的海域多，若將攜帶病原體的海龜放歸，會對海龜種群的安全造成極大的影響，甚至威脅海洋生態(tài)安全。我國海龜保護(hù)力度仍有待加強(qiáng)，急需提升海龜救助和保護(hù)水平，鼓勵更多力量參與海龜保護(hù)，促進(jìn)海南自貿(mào)港生態(tài)文明建設(shè)。腸道是動物機(jī)體內(nèi)重要的消化器官，其中棲息著龐大的微生物群落，腸道微生物影響著動物機(jī)體各種機(jī)能活動。宿主的飲食、基因和生理狀態(tài)是影響腸道微生物群落多樣性的重要原因(鐘春英等.2022)。隨著生物技術(shù)的重大進(jìn)步，腸道微生物組采樣和分析可能成為監(jiān)測圈養(yǎng)動物健康狀況的標(biāo)準(zhǔn)方案(Ahasanetal.,2017)，類似于血液化學(xué)分析(Franco-Duarteetal.,2019)。同時(shí)，盡管Lewbart等人通過檢測綠海龜血液生化指標(biāo)來評估綠海龜健康狀況，為綠海龜繁育過程中的疾病早期診斷和預(yù)防提供了依據(jù)(Lewbartetal.,2014;Chen,2017)，但細(xì)菌性病原感染也是威脅綠海龜健康的重要問題(Yeetal.,2022)，因此，僅僅依靠血液生化指標(biāo)很難全面評估放歸前海龜?shù)慕】禒顩r，我們需要探索更全面的評估方法來更好地促進(jìn)瀕危海龜種群的保護(hù)和恢復(fù)。動物腸道微生物的研究主要集中在哺乳動物，有關(guān)海龜腸道微生物的相關(guān)研究較少。目前有關(guān)海龜腸道微生物的研究基本集中在國外(Lietal.,2008;Al-Bahryetal.,2009;Camposetal.,2018)，國內(nèi)有關(guān)海龜腸道微生物的研究資料缺乏。此外，國外關(guān)于海龜?shù)南嚓P(guān)研究主要集中在綠海龜和紅海龜，而其他種類海龜?shù)哪c道菌群尚未見報(bào)道。例如，Abdelrhman等報(bào)道了在救助中心住院的紅海龜腸道微生物和野外環(huán)境中相對健康的個(gè)體腸道微生物有差異(Abdelrhmanetal.,2016)；Shamim等發(fā)現(xiàn)野生捕獲的綠海龜腸道微生物中厚壁菌門占優(yōu)勢，這可能反應(yīng)海龜身體健康的自然狀態(tài)，而海龜醫(yī)院的海龜腸道微生物中變形菌門占優(yōu)勢(Shamimetal.,2017)。Bloodgood等首次描述了幼年綠海龜糞便的細(xì)菌群落組成會隨在救助中心的時(shí)間及救助期間飲食變化，而接受抗生素治療對海龜腸道菌群無顯著影響(Bloodgoodetal.,2020)。Biagi等研究發(fā)現(xiàn)腸道部分菌群的相對豐度與海龜背甲長度值相關(guān)，而未觀察到圈養(yǎng)池水微生物群對腸道菌群的影響(Biagietal.,2019)。Arizza等研究表明發(fā)育中的海龜，腸道菌群會適應(yīng)飲食變化(Arizzaetal.,2019)。由此可見，海龜腸道菌群易受環(huán)境條件的影響，當(dāng)海龜處于疾病或者不利生存環(huán)境中時(shí)，其腸道菌群可能發(fā)生較大改變。由于動物腸道中正常微生物區(qū)系的存在與動物的免疫、營養(yǎng)以及其他生命活動緊密相關(guān)，海龜腸道中核心微生物群成分的表征及變化亦是了解海龜健康的重要指標(biāo)。本研究采用高通量測序技術(shù)，查明海南師范大學(xué)海龜救助站的三種海龜腸道菌群的組成和結(jié)構(gòu)及海水環(huán)境中微生物與海龜腸道菌群的關(guān)系，通過與野生海龜?shù)哪c道菌群組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行對比，以期評價(jià)海龜?shù)慕】禒顩r，為未來海龜?shù)某晒Ψ艢w提供科學(xué)指導(dǎo)。研究方法研究對象海南師范大學(xué)海龜救助站內(nèi)救助的3種海龜：玳瑁(Eretmochelysimbricata,EI)、太平洋麗龜(Lepidochelysolivacea,LO)和綠海龜(Cheloniamydas,CM)為研究對象。海龜救助站內(nèi)兩天喂食一次，喂食的食材有燈光魚、魷魚、黃瓜、白菜、胡蘿卜、西藍(lán)花、海帶、瓊脂飼料，其中太平洋麗龜偏愛肉類，食材有燈光魚、魷魚、瓊脂飼料，并補(bǔ)充維生素、鈣片等。每周100％換水一次，換水時(shí)用碘伏給龜池和龜背進(jìn)行消毒，海水均來自?？谑行阌^(qū)假日海灘。樣品采集本實(shí)驗(yàn)采集海龜自然排便后的糞便樣本及圈養(yǎng)所用的海水樣本，在喂食后2h左右海龜便會排便，排便后立即采集樣本，具體方法為，戴手套取出海龜糞便，用消毒后的直頭鑷子和解剖直剪將糞便切割，將中心部位小塊糞便放入無菌的5mL凍存管中并立即放入-80℃冰箱保存，其中，玳瑁7個(gè)樣品，太平洋麗龜2個(gè)樣品，綠海龜4個(gè)樣品，海水5個(gè)樣品。樣品測序方法DNA提取使用MagAtrractPowerSoilProDNAKit提取樣本全部微生物基因組DNA(Qiagen,Hilden,Germany)。使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA的質(zhì)量，使用NanoDrop2000?ND-2000分光光度計(jì)(ThermoScientific,Wilmington,DE,USA)測定DNA的濃度和純度。并在-80℃下保持到后續(xù)使用。PCR擴(kuò)增使用ABIGeneAmp?9700PCR熱循環(huán)儀(GeneAmp9700,ABI,美國)對細(xì)菌16SrRNA基因的V3和V4區(qū)通用引物338F和806R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。細(xì)菌16SrRNA基因的引物為338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')(Liuetal.,2016)。每個(gè)樣品的PCR反應(yīng)在20μL反應(yīng)中進(jìn)行三次，其中TaqProMultiplexDNAPolymerase(10μL)，模板DNA(10ng)和每種引物(5uM,0.8μL)，補(bǔ)ddH2O至20μL。使用以下熱循環(huán)儀程序進(jìn)行擴(kuò)增:95℃預(yù)變性3min，29個(gè)循環(huán)(95℃變性30s，53℃退火30s,72℃延伸30s)，然后72℃穩(wěn)定延伸10min，最后在4℃進(jìn)行保存。使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用DNA凝膠回收純化試劑盒(PCRClean-UpKit，中國逾華)進(jìn)行回收產(chǎn)物純化，并用Qubit4.0(ThermoFisherScientific,USA)對回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測定量。IlluminaMiSeq測序及分析純化的擴(kuò)增子以等摩爾量混合，在IlluminaMiSeq上進(jìn)行雙端測序。在97%相似度下運(yùn)用QIIME軟件將其聚類為用于物種分類的OTU(OperationalTaxonomicUnit，分類操作單元)，通過RDPClassifier鑒定OTU代表性序列的微生物分類地位，并計(jì)算樣本的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Ace指數(shù)、Chao指數(shù)，以此來衡量樣本的物種多樣性。Alpha多樣性為一個(gè)特定區(qū)域的多樣性，是反映豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)。在該分析中，Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)是反映菌群的多樣性。Shannon指數(shù)值越大，表示菌群的多樣性越高；Simpson指數(shù)值越小，則表示菌群的多樣性越高。Ace指數(shù)與Chao指數(shù)則反映菌群的豐富度，指數(shù)值越高，表示菌群物種的豐富度越高。Coverage值指測序深度指數(shù)，即覆蓋率，該數(shù)值越接近于1，則表示測序深度越合理。β多樣性通過基于未加權(quán)UniFrac距離分析的主坐標(biāo)分析(PCoA)進(jìn)行可視化(Schlossetal.,2009)，使用BrayCurtis相似性指數(shù)作為基于樣本之間OTU豐度的細(xì)菌群落之間相似性的度量。使用R中的BASE與VEGAN軟件包，進(jìn)行OTU的Venn圖分析(Jietal.,2017)。在門和屬水平上分析群落結(jié)構(gòu)，使用Python(v.2.7)中的PANDAS軟件包，基于tax_summary_a文件夾中的數(shù)據(jù)表，進(jìn)行Bar圖分析(相對豐度＜1%被合并為“others”)(Jietal.,2017)。使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)計(jì)算三種海龜及與海水之間顯著差異，P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)顯著性。結(jié)果PCR擴(kuò)增結(jié)果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳的結(jié)果表明，提取的樣品DNA條帶較清晰，純度較好，檢測結(jié)果無其他雜質(zhì)影響，可繼續(xù)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。rRNA測序結(jié)果16SrRNA基因的V3-V4可變區(qū)的測序共產(chǎn)生了1331714個(gè)原始序列數(shù)目，產(chǎn)生了1156877個(gè)優(yōu)化序列數(shù)目，序列以97％的同一性聚成1665個(gè)OTUs，序列的范圍為200至516bp，平均序列長度為415bp(Table1)。此外，對18個(gè)樣本細(xì)菌的多樣性進(jìn)行較好評估，根據(jù)coverage(圖1)進(jìn)行稀釋曲線分析，曲線末端趨向平坦，且該數(shù)值接近于1，說明測序深度合理。表1各樣本序列信息表Sample\InfoSeq_numBase_numMean_lengthMin_lengthMax_lengthEI18015932951143411.072281203512EI213207955177339417.760121259485EI37914032703231413.232638202505EI45646023460247415.519784337503EI57908933163273419.315872318430EI68122433569760413.298532226446EI75287222017638416.432857200482LO15409222548989416.863658262459LO27186329917111416.307571261516CM14843120142408415.899073284489CM24811520042937416.563172245492CM34473418673547417.435217245433CM45633123487584416.956631223443SW14372018332881419.324817318435SW25722123996955419.37322257491SW35826724145919414.401273250458SW47091429292285413.06773230442SW54216617551467416.246905261460注：EI為玳瑁(Eretmochelysimbricata)；LO為太平洋麗龜(Lepidochelysolivacea)；CM為綠海龜(Cheloniamydas)；SW為海水(Seawater)圖1樣本測序數(shù)據(jù)的稀釋曲線Alpha和Beta多樣性分析玳瑁(EI)、太平洋麗龜(LO)、綠海龜(CM)的Alpha多樣性指數(shù)(Shannon、Simpson、Ace、Chao)如圖2所示。玳瑁在Shannon指數(shù)上顯著低于綠海龜(P＜0.05)(圖2A)，在Simpson指數(shù)上顯著高于綠海龜(P＜0.05)(圖2B)，在Ace、Chao指數(shù)上均與綠海龜無顯著差異(P＞0.05)(圖2C、D)；太平洋麗龜在Shannon、Simpson、Ace、Chao指數(shù)上均與玳瑁、綠海龜無顯著差異(P＞0.05)。以上指標(biāo)表明綠海龜比玳瑁腸道細(xì)菌群落具有更高的多樣性。海龜(Seaturtle,ST)和海水(Seawater，SW)的Alpha多樣性指數(shù)(Shannon、Simpson、Ace、Chao)如圖3所示。海水菌群在Shannon、Ace、Chao指數(shù)上均顯著高于海龜腸道菌群(P＜0.01，圖3A、C、D)；海水菌群在Simpson指數(shù)上顯著低于海龜腸道菌群(P＜0.05,圖3B)。Beta多樣性分析表明，海水和海龜在排序圖中均相聚較遠(yuǎn)，ANOSIM分析顯示海水和海龜微生物群落之間存在顯著差異(R=0.7636,P＜0.05)。以上分析表明海水中有龐大的微生物菌群。圖2玳瑁(EI)、太平洋麗龜(LO)和綠海龜(CM)腸道菌群的Alpha多樣性。Shannon、Simpson、Ace、Chao數(shù)據(jù)通過S-W和A-D檢驗(yàn)均不顯著(P>0.05)，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，因此T檢驗(yàn)用于統(tǒng)計(jì)顯著性檢驗(yàn)具有意義。通過Shannon、Simpson、Ace、Chao測量三種海龜?shù)腁lpha多樣性。P值表示統(tǒng)計(jì)分析的置信水平；P<0.05反映了統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。*代表P<0.05。圖3海水(SW)和海龜(ST)菌群的Alpha多樣性。Shannon、Chao數(shù)據(jù)通過S-W和A-D檢驗(yàn)均不顯著(P>0.05)，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，因此T檢驗(yàn)用于統(tǒng)計(jì)顯著性檢驗(yàn)具有意義。通過Shannon、Chao測量三種海龜?shù)腁lpha多樣性。P值表示統(tǒng)計(jì)分析的置信水平；P<0.05反映了統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。**代表P<0.01，***代表P<0.001。圖4基于海水(SW)和海龜(ST)中細(xì)菌群落的未加權(quán)UniFrac距離的Beta多樣性主成分分析(PCoA)圖。主坐標(biāo)(PC1和PC2)在軸中表示，它們的相對貢獻(xiàn)由括號中的百分比表示。通過ANOSIM方差分析。R值范圍(-1,1)。R值接近0表示組間和組內(nèi)沒有顯著差異。接近1的R值表示組間差異大于組內(nèi)差異。P值表示統(tǒng)計(jì)分析的置信水平；P<0.05反映了統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。

菌群組成和相對豐度三種海龜腸道微生物組成結(jié)構(gòu)分析基于門分類水平進(jìn)行分析在門的水平上，三種海龜平均以擬桿菌門(Bacteroidota)(43.75%)、厚壁菌門(Firmicutes)(33.4%)、梭桿菌門(Fusobacteriota)(13.89%)為主。在玳瑁中平均以擬桿菌門(Bacteroidota)(34.42％)、厚壁菌門(Firmicutes)(33.34％)、梭桿菌門(Fusobacteriota)(18.84％)、疣微菌門(Verrucomicrobia)(7.07％)、脫硫彌菌門(Deferribacterota)(4.67％)為主；在太平洋麗龜中平均以擬桿菌門(Bacteroidota)(56.32％)、梭桿菌門(Fusobacteriota)(22.45％)、厚壁菌門(Firmicutes)(18.03％)、脫硫彌菌門(Deferribacterota)(2.97％)為主；在綠海龜中平均以擬桿菌門(Bacteroidota)(53.79％)、厚壁菌門(Firmicutes)(41.32％)、梭桿菌門(Fusobacteriota)(0.95％)、放線菌門(Actinobacteriota)(1.95％)為主(圖5A)。玳瑁和綠海龜在梭桿菌門(Fusobacteriota)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、放線菌門(Actinobacteriota)上存在顯著差異(P＜0.05)(圖5B)，其中玳瑁腸道菌群中梭桿菌門、疣微菌門顯著高于綠海龜，放線菌門顯著低于綠海龜。圖5海龜微生物群落在門水平比較分析A，菌群條形圖；B，菌群在門水平上差異顯著的物種使用維恩圖分別顯示三種海龜?shù)墓蚕砗酮?dú)特細(xì)菌微生物群落(圖6)。玳瑁共有643個(gè)OTUs，太平洋麗龜共有302個(gè)OTUs，綠海龜共有529個(gè)OTUs。在三種海龜?shù)目偣?26個(gè)OTUs中，136個(gè)OTUs(14.69%)在三組間共享，其中擬桿菌門(Bacteroidota)(共享的43.81%)，厚壁菌門(Firmicutes)(共享的33.49%)，梭桿菌門(Fusobacteriota)(共享的13.91%)；對于玳瑁共有253個(gè)OTUs(占總數(shù)的27.32%)是獨(dú)特的，其中粘菌門(Myxococcota)(獨(dú)特的66.67%)，浮霉菌門(Planctomycetota)(獨(dú)特的33.33%)(圖3A)；對于太平洋麗龜共有63個(gè)OTUs(占總數(shù)的6.80%)是獨(dú)特的，其中沒有獨(dú)特的門；對于綠海龜共有198個(gè)OTUs(占總數(shù)的21.38%)是獨(dú)特的，其中只有Campilobacterota是獨(dú)特的。圖6維恩圖顯示了三種海龜(EI、LO、CM)中獨(dú)特和共享的微生物OTU基于屬分類水平進(jìn)行分析在屬的水平上，玳瑁中平均以unclassified_o__Bacteroidales(26.65％)、Cetobacterium(8.38％)、Fusobacterium(10.47％)、Bacteroides(4.07％)為主，其他菌群(50.45%)未被檢測到；在太平洋麗龜中平均以unclassified_o__Bacteroidales(49.88％)、Cetobacterium(22.43％)、Bacteroides(4.66％)為主，其他菌群(23.05%)未被檢測到；在綠海龜中平均以unclassified_o__Bacteroidales(8.98％)、Cetobacterium(0.89％)、Bacteroides(15.61％)為主，其他菌群(74.45%)未被檢測到(圖6A)。其中玳瑁和綠海龜在Bacteroides、Cetobacterium、Paludibacter、Akkermansia上存在顯著差異(P＜0.05)(圖6B)。圖7海龜微生物群落在屬水平比較分析A，菌群條形圖；B，菌群在屬水平上差異顯著的物種海水與海龜微生物群落組成結(jié)構(gòu)比較分析在海水中，優(yōu)勢門是變形菌門(Proteobacteria)(36.83%)，之后依次是擬桿菌門(Bacteroidota)(29.61%)和厚壁菌門(Firmicutes)(24.1%)(圖8A)。海水和海龜在Proteobacteria、Bdellovibrionota、Campilobacterota等門上存在顯著差異(P＜0.01)(圖8B)；在Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、Nautella、Pseudophaeobacter、Serratia等屬上存在顯著差異(P＜0.01)(圖9)。圖8海水和海龜微生物群落在門水平比較分析海水菌群在門水平餅狀圖；B，菌群在門水平上差異顯著的物種圖9海水和海龜微生物群落在屬水平上差異顯著的物種討論本研究初步分析了海南師范大學(xué)海龜救助站三種海龜?shù)哪c道菌群結(jié)構(gòu)特征，結(jié)果表明，在玳瑁中平均以擬桿菌門(Bacteroidota)(34.42％)、厚壁菌門(Firmicutes)(33.34％)、梭桿菌門(Fusobacteriota)(18.84％)為主；在太平洋麗龜中平均以擬桿菌門(Bacteroidota)(56.32％)、梭桿菌門(Fusobacteriota)(22.45％)、厚壁菌門(Firmicutes)(18.03％)為主；在綠海龜中平均以擬桿菌門(Bacteroidota)(53.79％)、厚壁菌門(Firmicutes)(41.32％)、梭桿菌門(Fusobacteriota)(0.95％)為主(圖5A)。在菌群α和β多樣性上，綠海龜與玳瑁腸道菌群具有顯著差異(P＜0.05，圖2A)，這種差異主要在梭桿菌門(Fusobacteriota)及在鯨桿菌屬(Cetobacterium)、擬桿菌屬(Bacteroides)、梭桿菌屬(Fusobacterium)上的多樣性和相對豐度造成的(圖5B；圖6B)，海水菌群和海龜腸道菌群具有顯著差異(圖3；圖4)，這種差異主要是在Proteobacteria、Bdellovibrionota門及在Nautella、Serratia、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia屬上的多樣性和相對豐度造成的(圖8；圖9)?？梢?，綠海龜比玳瑁擁有更高的腸道菌群多樣性，這與Chen等的研究相同(Chenetal.,2022)；海水中擁有龐大的微生物群落。盡管海龜?shù)膩碓?、大小和健康狀況不同，但在三種海龜樣本中主要分布的菌群為擬桿菌門、厚壁菌門和梭桿菌門。厚壁菌門在以植物性飲食為主個(gè)體的腸道微生物群中處于優(yōu)勢門，代謝植物多糖并將纖維素降解為揮發(fā)性脂肪酸(Davidetal.,2014)，研究推測，高比例厚壁菌門可能是由于該細(xì)菌門具有分解植物源多糖的能力(Ahasanetal.,2017)，從而促進(jìn)纖維素豐富的食物的消化，例如構(gòu)成綠海龜主要食物的海草物種；梭桿菌門在海洋哺乳動物的腸道微生物群中處于優(yōu)勢門，尤其是那些以魚類為主食的動物，如海豚(Soverinietal.,2016)、海豹(Numbergeretal.,2016)和短吻鱷(Keenanetal.,2013)，相反，在食草爬行動物(如蜥蜴、鬣蜥、陸龜和加拉帕戈斯巨龜)的腸道微生物群中，梭桿菌屬處于次優(yōu)勢或不存在(Hongetal.,2011；Koholetal.,2017)。在本研究中，厚壁菌門在綠海龜、玳瑁和太平洋麗龜腸道細(xì)菌群落中的占比分別為41.32％、33.34％、18.03％；梭桿菌門在在綠海龜、玳瑁和太平洋麗龜腸道細(xì)菌群落中的占比分別為0.95％、18.84％、22.45％，且綠海龜顯著低于玳瑁和太平洋麗龜。與之前的研究不一致，Shamim等發(fā)現(xiàn)海龜救助站救助海龜?shù)哪c道微生物中變形菌門占優(yōu)勢，而野生捕獲的綠海龜腸道微生物中厚壁菌門占優(yōu)勢(Shamimetal.,2017)，可能表明本研究的海龜呈現(xiàn)較為健康的自然狀態(tài)。此外，本研究結(jié)果也與海龜救助站救助海龜?shù)氖承越Y(jié)構(gòu)相匹配，救助站的綠海龜和玳瑁為雜食性，其中綠海龜不挑食，蔬菜、肉類都取食，而玳瑁挑食，部分蔬菜不取食(如胡蘿卜)、肉類都取食；救助站的太平洋麗龜偏肉食性，很少取食蔬菜、偏愛肉類。總之，厚壁菌門和梭桿菌門在三種海龜中的分布表明腸道微生物為飲食和環(huán)境提供了適應(yīng)性功能，并且海龜?shù)慕】禒顩r良好。我們的研究發(fā)現(xiàn)，救助海龜玳瑁的腸道菌群中發(fā)現(xiàn)了梭桿菌屬(Fusobacterium)，梭桿菌可能與炎癥性腸病(IBD)有關(guān)，包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病(Neutetal.,2002;Straussetal.,2011)，可以引發(fā)宿主促炎癥反應(yīng)，并具有促進(jìn)其與宿主上皮細(xì)胞粘附的毒力特征(Bachrachetal.,2005;Uittoetal.,2005)及其侵入上皮細(xì)胞的能力，包括口腔、頭頸部感染和局部\o"Skinulcers"皮膚潰瘍(ShangandLiu,2018)，救助海龜玳瑁中Fusobacterium的發(fā)現(xiàn)表明，玳瑁更容易患炎癥等疾病，并且玳瑁的放生可能會增加野生海龜及人類的患病風(fēng)險(xiǎn)。此外，梭狀芽孢桿菌是首先從受污染的土壤、泥漿和廢水中分離出來的，它的存在表明可能宿主能夠適應(yīng)污染的環(huán)境，甚至能夠凈化污染物(Inglettetal.,2011)，可能是對全球污染的海洋環(huán)境的適應(yīng)性特征。在本研究中，海龜腸道微生物中發(fā)現(xiàn)了梭狀芽孢桿菌，這些細(xì)菌菌株能夠?qū)ξ⑺芰匣蛑亟饘俚任廴疚锂a(chǎn)生抗性，在未來海洋生物發(fā)現(xiàn)細(xì)菌或許可在生物修復(fù)、緩解或適應(yīng)污染環(huán)境方面發(fā)揮作用。在所有海水樣本中優(yōu)勢微生物群落主要是變形菌門，其次分別是擬桿菌門和厚壁菌門，梭桿菌門幾乎沒有發(fā)現(xiàn)，海水和海龜微生物群落在屬分類水平上具有顯著差異，表明海洋中具有豐富的微生物菌群，其中Nautella是一種海洋細(xì)菌，海水在Nautella菌屬顯著高于海龜，表明海龜?shù)哪c道微生物群與周圍水生環(huán)境的微生物菌株交換率較低；Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia廣泛分布于自然界中的土壤、水、植物和動物體內(nèi)，是感染常見病原菌之一(Jonesetal.,2004)，該菌傳染性強(qiáng)，可通過直接接觸傳播，嚴(yán)重威脅人類健康(Shabanetal.,2008)；Serratia屬于腸桿菌科，其中Serratiamarcescens是一種條件致病菌，它不僅會導(dǎo)致人類患病，還可導(dǎo)致各類經(jīng)濟(jì)動物感染甚至死亡(張志祥等.2013)。另外，海水組內(nèi)差異較大，這可能與采樣海水的時(shí)間有關(guān)，救助站志愿者在參與清潔活動時(shí)，務(wù)必戴好手套、做好防護(hù)工作，避免感染。結(jié)論本研究以海南師范大學(xué)海龜救助站救助的海龜為研究對象，通過海龜糞便無損傷取樣，基于16SrRNA基因測序技術(shù)對救助海龜腸道細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。結(jié)果表明,海龜腸道中主要分布的菌群有擬桿菌門(43.75%)、厚壁菌門(33.4%)和梭桿菌門(13.89%)；綠海龜比玳瑁擁有更高的腸道菌群多樣性；玳瑁和太平洋麗龜腸道菌群中梭桿菌門占比顯著高于綠海龜(P＜0.05)，這與其飲食結(jié)構(gòu)相匹配；海洋中有龐大的微生物菌群。此外，海水組中發(fā)現(xiàn)了人畜共患致病菌(Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、Serratia),志愿者在清潔龜池時(shí)務(wù)必做好防護(hù)以免感染。本研究豐富了海龜腸道微生物的生理學(xué)資料，并為未來海龜救助及放歸的條件提供指導(dǎo)。

參考文獻(xiàn)Wu,S.N.(2023).Completegenomesequencing、analysis、detectionandepidemiologicalstudyofnovelgreenturtles(Cheloniamydas)virus.HNNU.doi:10.27719/ki.ghnsf.2022.000413Ahasan,M.S.,Waltzek,T.B.,Huerlimann,R.,andAriel,E.(2017).Fecalbacterialcommunitiesofwild-capturedandstrandedgreenturtles(Cheloniamydas)ontheGreatBarrierReef.FEMSMicrobiolEcol93,fix139.doi:10.1093/femsec/fix139Franco-Duarte,R.,?ernáková,L.,Kadam,S.,S.Kaushik,K.,Salehi,B.,Bevilacqua,A.,etal.(2019).AdvancesinChemicalandBiologicalMethodstoIdentifyMicroorganisms—FromPasttoPresent.Microorganisms7,130.doi:10.3390/microorganisms7050130Lewbart,G.A.,Hirschfeld,M.,Denkinger,J.,Vasco,K.,Guevara,N.,García,J.,etal.(2014).BloodGases,Biochemistry,andHematologyofGalapagosGreenTurtles(CheloniaMydas).PLoSONE9,e96487.doi:10.1371/journal.pone.0096487Ye,M.B.,Ma,Y.P.,Liang,Z.L.,Ma,J.Y.,Feng,G.Q.,Chen,H.L.,etal.(2022).EpidemiologicalSurveyofBacterialDiseaseainCheloniamydas.Chin.J.Zool43,1037–1047.Liu,C.,Zhao,D.,Ma,W.,Guo,Y.,Wang,A.,Wang,Q.,etal.(2016).Denitrifyingsulfideremovalprocessonhigh-salinitywastewatersinthepresenceofHalomonassp.ApplMicrobiolBiot100,1421–1426.doi:10.1007/s00253-015-7039-6Schloss,P.D.,Westcott,S.L.,Ryabin,T.,Hall,J.R.,Hartmann,M.,Hollister,E.B.,etal.(2009).Introducingmothur:Open-Source,Platform-Independent,Community-SupportedSoftwareforDescribingandComparingMicrobialCommunities.ApplEnvironMicrob75,7537–7541.doi:10.1128/AEM.01541-09David,L.A.,Maurice,C.F.,Carmody,R.N.,Gootenberg,D.B.,Button,J.E.,Wolfe,B.E.,etal.(2014).Dietrapidlyandreproduciblyaltersthehumangutmicrobiome.Nature505,559–563.doi:10.1038/nature12820Ahasan,M.S.,Waltzek,T.B.,Huerlimann,R.,andAriel,E.(2017).Fecalbacterialcommunitiesofwild-capturedandstrandedgreenturtles(Cheloniamydas)ontheGreatBarrierReef.FEMSMicrobiolEcol93,fix139.doi:10.1093/femsec/fix139Neut,C.,Bulois,P.,Desreumaux,P.,Membré,J.-M.,Lederman,E.,Gambiez,L.,etal.(2002).ChangesinthebacterialfloraoftheneoterminalileumafterileocolonicresectionforCrohn’sdisease.AmJGastroenterol97,939–946.doi:10.1111/j.1572-0241.2002.05613.xStrauss,J.,Kaplan,G.G.,Beck,P.L.,Rioux,K.,Panaccione,R.,Devinney,R.,etal.(2011).Invasivepotentialofgutmucosa-derivedFusobacteriumnucleatumpositivelycorrelateswithIBDstatusofthehost.InflammBowelDis17,1971–1978.doi:10.1002/ibd.21606Bachrach,G.,Ianculovici,C.,Naor,R.,andWeiss,E.I.(2005).FluorescencebasedmeasurementsofFusobacteriumnucleatumcoaggregationandoffusobacterialattachmenttomammaliancells.FEMSMicrobiolLett248,235–240.doi:10.1016/j.femsle.2005.05.055Uitto,V.-J.,Baillie,D.,Wu,Q.,Gendron,R.,Grenier,D.,Putnins,E.E.,etal.(2005).Fusobacteriumnucleatumincreasescollagenase3productionandmigrationofepithelialcells.InfectImmun73,1171–1179.doi:10.1128/IAI.73.2.1171-1179.2005Shang,F.-M.,andLiu,H.-L.(2018).Fusobacteriumnucleatumandcolorectalcancer:Areview.WorldJGastrointestOncol10,71–81.doi:10.4251/wjgo.v10.i3.71Soverini,M.,Quercia,S.,Biancani,B.,Furlati,S.,Turroni,S.,Biagi,E.,etal.(2016)Thebottlenosedolphin(Tursiopstruncatus)faecalmicrobiota.FEMSMicrobiolEcol92:fiw055.Kohl,K.D.,Brun,A.,Magallanes,M.,Brinkerhoff,J.,Laspiur,A.,Acosta,J.C.,etal.(2017)Gutmicrobialecologyoflizards:insightsintodiversityinthewild,effectsofcaptivity,variationacrossgutregionsandtransmission.MolEcol26:1175–1189.RivasML,Rodríguez-CaballeroE,EstebanN,CarpioAJ,Barrera-VilarmauB,FuentesMMPB,RobertsonK,AzanzaJ,LeónY,OrtegaZ.2023.Uncertainfutureforglobalseaturtlepopulationsinfaceofsealevelrise.SciRep13:5277.ChenY,XiaZ,LiH.2022.Metagenomiccomparisonofgutcommunitiesbetweenhawksbills(Eretmochelysimbricata)andgreenseaturtles(Cheloniamydas).ArchMicrobiol204:450.BiagiE,MusellaM,PalladinoG,AngeliniV,PariS,RoncariC,ScicchitanoD,RampelliS,FranzellittiS,CandelaM.2021.ImpactofPlasticDebrisontheGutMicrobiotaofCarettacarettaFromNorthwesternAdriaticSea.FrontMarSci8:637030.ScheelingsTF,MooreRJ,VanTTH,KlaassenM,ReinaRD.2020.Microbialsymbiosisandcoevolutionofanentirecladeofancientvertebrates:thegutmicrobiotaofseaturtlesanditsrelationshiptotheirphylogenetichistory.AnimalMicrobiome2.ScheelingsT,MooreR,VanT,KlaassenM,ReinaR.2020.Thegutbacterialmicrobiotaofseaturtlesdiffersbetweengeographicallydistinctpopulations.EndangSpeciesRes42:95–108.BloodgoodJCG,HernandezSM,IsaiahA,SuchodolskiJS,HoopesLA,ThompsonPM,WaltzekTB,NortonTM.2020.Theeffectofdietonthegastrointestinalmicrobiomeofjuvenilerehabilitatinggreenturtles(Cheloniamydas).PLoSONE15:e0227060.AhasanMS,WaltzekTB,OwensL,ArielE.2020.Characterisationandcomparisonofthemucosa-associatedbacterialcommunitiesacrossthegastrointestinaltractofstrandedgreenturtles,Cheloniamydas.AIMSMicrobiol6:361–378.NiemuthJN,HarmsCA,StoskopfMK.2019.SeaTurtleTears:ANovel,MinimallyInvasiveSamplingMethodfor1H-NMRMetabolomicsInvestigationswithColdStunSyndromeasaCaseStudy.JournalofWildlifeDiseases55:868.BiagiE,D’AmicoF,SoveriniM,AngeliniV,BaroneM,TurroniS,RampelliS,PariS,BrigidiP,CandelaM.2019.FaecalbacterialcommunitiesfromMediterraneanloggerheadseaturtles(Carettacaretta).EnvironMicrobiolRep11:361–371.ArizzaV,VecchioniL,CaracappaS,SciurbaG,BerlinghieriF,GentileA,PersichettiMF,ArculeoM,AlduinaR.2019.NewinsightsintothegutmicrobiomeinloggerheadseaturtlesCarettacarettastrandedontheMediterraneancoast.PLoSONE14:e0220329.CamposP,GuivernauM,Prenafeta-BoldúFX,CardonaL.2018.FastacquisitionofapolysaccharidefermentinggutmicrobiomebyjuvenilegreenturtlesCheloniamydasaftersettlementincoastalhabitats.Microbiome6:69.AhasanMS,WaltzekTB,HuerlimannR,ArielE.2018.Comparativeanalysisofgutbacterialcommunitiesofgreenturtles(Cheloniamydas)pre-hospitalizationandpost-rehabilitationbyhigh-throughputsequencingofbacterial16SrRNAgene.MicrobiolRes207:91–99.PriceJT,PaladinoFV,LamontMM,WitheringtonBE,BatesST,TanyaS,Bok-LuelL.2017.Characterizationofthejuvenilegreenturtle(Cheloniamydas)microbiomethroughOTUanontogeneticshiftfrompelagictoneritichabitats.PLoSONE12:e0177642.AhasanMdS,WaltzekTB,HuerlimannR,ArielE.2017.Fecalbacterialcommunitiesofwild-capturedandstrandedgreenturtles(Cheloniamydas)ontheGreatBarrierReef.FEMSMicrobiologyEcology93.AbdelrhmanKFA,BacciG,MancusiC,MengoniA,SerenaF,UgoliniA.2016.AFirstInsightintotheGutMicrobiotaoftheSeaTurtleCarettacaretta.FrontMicrobiol7.Al-BahryS,MahmoudI,ElshafieA,Al-HarthyA,Al-GhafriS,Al-AmriI,AlkindiA.2009.BacterialfloraandantibioticresistancefromeggsofgreenturtlesCheloniamydas:Anindicationofpollutedeffluents.MarinePollutionBul