生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)課件

PCR技術(shù)及其應(yīng)用生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)農(nóng)業(yè)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心制作人：張杰道2021/3/121目錄PCR的反應(yīng)原理PCR的類型和應(yīng)用PCR示例2021/3/12

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR：PolymeraseChainReaction)

KaryB.Mullis

PCR是由美國科學(xué)家穆利斯提出的一種體外簡化條件下模擬DNA體內(nèi)復(fù)制的DNA快速擴(kuò)增的方法，此技術(shù)獲得1993年諾貝爾化學(xué)獎。2021/3/12體內(nèi)DNA的復(fù)制體系DNA聚合酶（IIIIII）拓?fù)洚悩?gòu)酶解旋酶類SSB

引物dNTPMg2+5’3’2021/3/12Mullis的PCR構(gòu)思引物引物DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段2021/3/12Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)40506070809010010080604020耐熱DNA聚合酶Saiki（1988）將耐熱DNA聚合酶引入PCR，使利用熱變性解鏈DNA模板可行。2021/3/12PCR反應(yīng)循環(huán)72℃94℃55℃PCR循環(huán)變性退火延伸2021/3/12

PCR的指數(shù)擴(kuò)增（2n）引物延伸延伸5’5’3’3’變性、退火變性、退火2021/3/12TaqP1P2PCR反應(yīng)體系dATPdTTPdGTPdCTPMg2+模板：DNA引物：P1P2DNA聚合酶：Taq原料：dNTP反應(yīng)緩沖液輔助因子：Mg2+2021/3/121）PCR反應(yīng)成分（1）模板單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。DNA模板一般100ng/100L。模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。

PCR反應(yīng)條件2021/3/12（2）引物濃度

0.1-0.5mol/L濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯配,反應(yīng)特異性下降。（3）Taq

DNA聚合酶0.5-2.5U/50l酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。2021/3/12（4）dNTP

dNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長度四種dNTP濃度應(yīng)相等濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入,濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量dNTP可與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性。2021/3/12（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。適宜濃度為0.5-2.5mmol/L反應(yīng)體系。Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合,所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。2021/3/122）循環(huán)參數(shù)變性

使雙鏈DNA解鏈為單鏈94℃，20-30秒(2)退火

溫度由引物長度和GC含量決定。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。2021/3/12（3）延伸

70-75℃,一般為72℃延伸時間由擴(kuò)增片段長度決定（4）循環(huán)次數(shù)

主要取決于模版DNA的濃度一般為25-35次次數(shù)過多：擴(kuò)增效率降低錯誤摻入率增加2021/3/12PCR技術(shù)的特點(diǎn)1）高度的靈敏性30輪循環(huán)擴(kuò)增量達(dá)230個拷貝（109拷貝）PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍2021/3/122）特異性引物引物引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。引物設(shè)計(jì)的最大原則是最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性；同時盡可能減少非特異性擴(kuò)增。2021/3/12引物設(shè)計(jì)：（1)序列應(yīng)位于高度保守區(qū),與非擴(kuò)增區(qū)無同源序列。（2）引物長度以15-40bp為宜。（3）堿基盡可能隨機(jī)分布,G+C占40-60%。（4）引物內(nèi)部避免形成二級結(jié)構(gòu)。（5）兩引物間避免有互補(bǔ)序列。（6）引物3’端為關(guān)鍵堿基；5’端無嚴(yán)格限制。2021/3/123）操作簡便易行

利用PCR擴(kuò)增,只需要數(shù)小時,就可以擴(kuò)增出可用電泳法檢出的DNA，可用于檢測基因組中僅含數(shù)個拷貝的模板序列。

2021/3/121）不對稱PCR

目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,關(guān)鍵是限制性引物的絕對量。用途：制備核酸序列測定的模板；制備雜交探針；基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究

PCR的類型2021/3/12

高濃度引物低濃度引物2021/3/122)反向PCR(reversePCR)

用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段，對某個已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。

未知序列未知序列已知序列2021/3/12已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶2021/3/123）多重PCR（復(fù)合PCR）用于檢測特定基因序列的存在或缺失。2021/3/12電泳引物123412342021/3/124）LP-PCR（Labelledprimers)利用同位素、熒光素等對ＰＣＲ引物進(jìn)行標(biāo)記,用以直觀地檢測目的基因。特別適合大量臨床標(biāo)本的基因診斷可同時檢測多種基因成分2021/3/12標(biāo)記引物ＰＣＲ觀察PCR產(chǎn)物2021/3/125）錨定PCR（anchoredPCR,A-PCR）

錨定PCR首先合成第一鏈cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),與同聚物尾配對的3’錨定引物（帶有限制性內(nèi)切位點(diǎn)polydC)一起作PCR擴(kuò)增2021/3/12cDNA末端核酸轉(zhuǎn)移酶3’GG…GG5’CC…CC錨定引物3’GG…GG5’CC…CC3’GG…GGCC…CC2021/3/126）PCR固相分析法模板生物素化引物PCR擴(kuò)增探針親和固相介質(zhì)檢測探針信號可用于基因芯片的制作2021/3/127）原位ＰＣＲ原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（InStillPCR,Is－PCR）是由Haase等于1990年首創(chuàng)。它是利用完整的細(xì)胞作為一個微小的反應(yīng)體系來擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的目的片段,在不破壞細(xì)胞的前提下,利用一些特定的檢測手段來檢測細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物。直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細(xì)胞中進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增?？蛇M(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位和檢測病理切片中含量較少的靶序列。2021/3/12操作步驟1.細(xì)胞或組織固定：細(xì)胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理后便適于一般PCR試劑（包括引物和Taq酶）進(jìn)入2.PCR擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)目的片段3.原位雜交檢測擴(kuò)增產(chǎn)物A.陽性對照B.陰性對照C.原位檢測mRNA表達(dá)2021/3/128）ＲＴ－ＰＣＲ逆轉(zhuǎn)錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴(kuò)增2021/3/129)熒光定量PCR（real-timePCR)

通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針,對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤,實(shí)時在線監(jiān)控反應(yīng)過程,結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對結(jié)果進(jìn)行分析,計(jì)算待測樣品的初始模板量。內(nèi)摻式染料 SYBRGreenI序列特異性探針 Taqman MolecularBeacons DualProbes(FRET)引物特異性探針

Amplifluor(Intergen)2021/3/125’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-GreenI

2021/3/12實(shí)時熒光定量PCR儀梯度PCR儀普通PCR儀2021/3/12PCR示例一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)PCR分析的原理與技術(shù)。2021/3/121、材料：含1Kb插入片段的克隆載體Pmd18-T質(zhì)粒DNA2、儀器：微量移液器及吸頭、PCR儀及PCR管瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備3、試劑：10XPCR 反應(yīng)緩沖液25mmol/LMgCl2

10mmol/LdNTP10μmol/L引物1和引物2二、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑2021/3/121.按照如下體積向PCR管中按順序加入各試劑并混勻：

10XPCR反應(yīng)緩沖液2.5μL25mmol/LMgCl22.0μL

10mmol/LdNTP1.0μL10μmol/L引物11.0μL10μmol/L引物21.0μL質(zhì)粒DNA1.0μLTaq0.1μL(5U)水補(bǔ)充至25.0μL三、操作步驟2021/3/122.按照如下體積向PCR管中按順序加入各試劑并混勻：

10XPCR反應(yīng)緩沖液2.5μL25mmol/LMgCl22.0μL

10mmol/LdNTP1.0μL10μmol/L引物11.0μL10μmol/L引物21.0μL質(zhì)粒DNA1.0μL