生物化學-課件

9.2FromGenestoGenomes特動養(yǎng)蜂甘海燕Chapter9

DNA-BASEDINFORMATION

TECHNOLOGIESContentsDNA數(shù)據(jù)庫提供了遺傳信息的專業(yè)目錄1聚合酶鏈式反應擴增特定DNA序列

2基因組序列提供了最終的遺傳數(shù)據(jù)庫39.2FromGenestoGenomes9.2FromGenestoGenomes

現(xiàn)代基因組科學可以從細胞尺度上研究DNA，也可以從單個基因至基因組完整的研究。加之基因組數(shù)據(jù)庫的正在建立，接下來測序就將作為一個新的里程碑。僅僅在21世紀的前十幾年中，生物學的大步發(fā)展就對信息資源的快速向前提供了各種支持。那么我們現(xiàn)在討論下對這些科學進展提供支持的各類技術。

DNA數(shù)據(jù)庫：

（包括互補DNA數(shù)據(jù)庫、基因組DNA數(shù)據(jù)庫等）

是DNA克隆的集合，聚集了各類不同片段的DNA資源，并尋找功能基因及探究基因的功能。根據(jù)DNA資源的差異，數(shù)據(jù)也不同。

最大的DNA數(shù)據(jù)庫就是基因組數(shù)據(jù)庫，通過將特定生物體的完整基因組裂解成數(shù)以千計的小片段后，把所有的片段插入克隆載體復制后獲得。

9.2FromGenestoGenomesDNA數(shù)據(jù)庫提供了遺傳信息的專業(yè)目錄1克隆基本步驟9.2FromGenestoGenomesDNA數(shù)據(jù)庫提供了遺傳信息的專業(yè)目錄1（1）首先應用限制性內切酶部分裂解要克隆的DNA，使其呈現(xiàn)不同長度的任意DNA序列。為了與克隆載體相匹配，同時為了保證數(shù)據(jù)庫中的克隆可以代表所有的序列，要選取片段大小要適當。（2）克隆載體，比如BAC或YAC質粒，用相同的限制性內切酶裂解，然后與染色體DNA片段相連接。（3）連接后的混合物用來改變細菌或酵母細胞以產(chǎn)生一個細胞類數(shù)據(jù)庫，其每個細菌或酵母都含有一套不同的重組DNA分子。（4）理想條件下，染色體的所有DNA均應包含在數(shù)據(jù)庫內。每個含有重組質粒的細菌長成一個菌落或者克隆成完全相同細胞，其中每個細胞都含有相同的重組質粒。

9.2FromGenestoGenomesDNA數(shù)據(jù)庫提供了遺傳信息的專業(yè)目錄1圖9－13DNA數(shù)據(jù)庫的克隆規(guī)則

這是一段假想的組織X的一段染色體，標記了序列標簽位點從A到Q（sequence-taggedsites，STSs—已知序列的DNA片段，包含了已知基因）。染色體下面是大量的規(guī)則BAC克隆，從1到9.。在遺傳圖譜上按序排列這些克隆是一個多階段過程。個別克隆上存在或者缺失的STSs由雜交過程確定－例如，用探針檢測每個克隆和STS的PCR擴增DNA。一旦每個BAC克隆體上的STSs被確認，這些克隆就能按序排列成圖譜。9.2FromGenestoGenomesDNA數(shù)據(jù)庫提供了遺傳信息的專業(yè)目錄1

越來越多的基因序列變得有用，但基因數(shù)據(jù)庫的實用性卻在縮小，研究人員為了研究基因功能，正在建立更多專業(yè)的數(shù)據(jù)庫。例如，對某個生物體，甚至是某幾個細胞或是組織，數(shù)據(jù)庫中僅包含那些被轉錄成RNA的能表達的基因。這樣的數(shù)據(jù)庫缺乏在許多真核生物基因組中占很大比例的非編碼DNA。研究者首先從特定個體或細胞中提取mRNA，然后以此RNA為模板通過反轉錄酶合成互補的DNA（圖9-14）。把合成的雙鏈DNA插入到合適的載體中克隆，創(chuàng)建一個克隆群體，稱之為cDNA數(shù)據(jù)庫。尋找特定基因，可集中到由表達基因的細胞mRNA來構建cDNA數(shù)據(jù)庫。例如，當克隆球蛋白時，可從白細胞前體細胞制備cDNA數(shù)據(jù)庫，因為這些細胞有一半的mRNA編碼球蛋白。為了描繪大型基因組，cDNA數(shù)據(jù)庫對在隨機產(chǎn)生的一個有用類型的STS能編排局部序列，稱作表達序列標簽。ESTs,范圍從十幾到數(shù)百的堿基對，能定位更大的基因圖譜，提供表達基因標簽。成百上千的ESTs包含在詳細物理圖譜中，被用于作為人類基因組序列的向導。

9.2FromGenestoGenomes圖9－14以mRNA構建cDNA數(shù)據(jù)庫

實踐中，細胞mRNA包含了數(shù)千個基因的轉錄產(chǎn)物，而cDNA則與之相對應。反轉錄產(chǎn)生的雙鏈DNA被插入到合適的載體中如何制作特殊DNA數(shù)據(jù)庫

9.2FromGenestoGenomes

通過克隆一個cDNA片段可成為一個帶標記序列或報告基因的cDNA序列，能推出更專業(yè)的cDNA數(shù)據(jù)庫。兩個有用的標記是綠色熒光蛋白基因和表位標簽。一個標記基因與綠色熒光蛋白基因融合形成一個融合蛋白，有更強的熒光，可直接照亮（圖9-15a）。這些小分子蛋白在顯微鏡下能觀察，可以研究它們在細胞中的位置和運動。一個表位標簽是一個很短的蛋白序列，是缺乏緊密約束的單克隆抗體。標簽蛋白通過與抗體的相互作用從粗蛋白中提取沉淀（圖9-15b）。如果其他的任何蛋白與標簽蛋白捆綁，那些也將沉淀，提供細胞中蛋白與蛋白間相互作用的信息。專業(yè)DNA數(shù)據(jù)庫的多樣性和實用性每年都在增加。

DNA數(shù)據(jù)庫提供了遺傳信息的專業(yè)目錄19.2FromGenestoGenomes

（a）臨近綠色熒光蛋白GFP基因的cDNA的克隆創(chuàng)建了報告結構。RNA轉錄開始于相關基因（insertDNA）和報告基因，然后，mRNA轉錄作為融合蛋白開始表達。蛋白的GFP部分在熒光顯微鏡下是可見的。照片展示的是包含了GFP融合蛋白的線蟲，表達在第四“觸覺”神經(jīng)蔓延在它身體的整個長度。

9.2FromGenestoGenomes（b）如果克隆臨近含有抗原決定基標簽的基因，抗原和抗體會結合導致融合蛋白沉淀。與標記蛋白互相作用的任何其它蛋白也會沉淀，有助于闡明蛋白之間互相作用的機理。9.2FromGenestoGenomes

人類基因組計劃致力于測定人類基因組所有序列，也伴隨著對各種類型生物基因組的測序?；蚪M測序需要一個或更多個DNA數(shù)據(jù)庫，一旦測序完成就可不再借助數(shù)據(jù)庫快速克隆特定基因。如果知道特定基因的部分序列，則可通過聚合酶鏈反應大量擴增該基因的拷貝。擴增的序列可直接用于克隆或其他分析。PCR方法是由KaryMullis1983年發(fā)明的。

聚合酶鏈式反應擴增特定DNA序列

2PCR9.2FromGenestoGenomes聚合酶鏈反應擴增特定DNA序列2（1）合成與待擴增DNA兩條鏈互補的寡核苷酸片段作為引物，該引物與模板結合后從其3‘端開始啟動向另一端引物跨越目的DNA延伸的合成反應（圖9-16）。（2）加熱使做為模板的DNA變性，然后在合成的引物存在下冷卻，4種脫氧核苷酸被加在引物末端使其得以延長，模板則獲得選擇性復制。（3）在自動化儀器上經(jīng)過數(shù)小時將加熱、冷卻、復制過程重復25-30次，以使延引物擴增的DNA片段數(shù)量可達到用于克隆或分析的水平。9.2FromGenestoGenomes圖9－16用PCR擴增特異性DNA片段（a）整個過程分3步：①加熱使雙鏈DNA變性②過量的引物（藍色）退火到要擴增的邊緣部位③DNA聚合反應。這個循環(huán)重復25-30次。耐熱的DNA聚合酶Taq1（來源于生長在熱泉中的微生物Thermusapuaticus）不會在加熱的過程中發(fā)生變性。

9.2FromGenestoGenomes

PCR中使用耐熱的DNA聚合酶如TapⅠ聚合酶（來自一種耐90。C高溫的細菌），該酶在加熱后仍保持活性，使得在每一個循環(huán)后不用再添加聚合酶?？梢栽谝镏幸M限制性內切酶識別位點，這便于擴增的DNA用于隨后的克?。▓D9-16b）。

聚合酶鏈反應擴增特定DNA序列2另一種方法9.2FromGenestoGenomes（b）PCR擴增產(chǎn)生的DNA可以被克隆。引物末端可以引入非互補序列，該序列中包含限制性內切酶識別位點。雖然引物的這部分序列不能夠結合到目標DNA上，PCR過程可將其整合到將要擴增的DNA中。擴增產(chǎn)物經(jīng)限制性內切酶裂解后產(chǎn)生粘性末端便于連接到克隆載體中。

PCR的意義9.2FromGenestoGenomes

PCR是非常靈敏的方法，足以滿足任何樣品中少到一個DNA分子的檢測和擴增。盡管DNA隨著時間的延長會發(fā)生降解，但仍然借助PCR技術成功地從40000年前得樣品中克隆出了DNA。該技術已經(jīng)用于從人的木乃伊和已經(jīng)滅絕的動物如猛犸象的毛發(fā)中克隆了DNA，開創(chuàng)了分子考古學和分子古生物學的新領域。通過擴增古遺址埋藏中的DNA可以跟蹤人類的遷徙過程。流行病學家可以借助PCR技術從人類遺存中找到人類致病病毒的痕跡。除了在DNA克隆中的應用外，PCR還是法醫(yī)學中的有利工具。它還可以用來在癥狀出現(xiàn)前檢測病毒感染以及各種遺傳病的產(chǎn)前診斷。聚合酶鏈反應擴增特定DNA序列2時代背景9.2FromGenestoGenomes

基因組是生物體最終的信息來源，并且我們對自己基因組比對任何基因組更感興趣。不到10年，實用性的DNA的測序方法的發(fā)展已經(jīng)對人類基因組的30億堿基對序列的未來前景進行了嚴肅的討論。在二十世紀80年代晚期，國際人類基因組開始大型的資助項目。重大貢獻的最終成就來自于分布在六個國家（美國、英國、日本、法國、中國和德國）的20個測序中心。統(tǒng)籌的協(xié)調是由美國國家衛(wèi)生院基因組研究辦公室提供的，首先是詹姆斯·沃特森領導,之后是1992年由弗朗西斯·科林斯帶頭。最初的任務3×109Bp長的序列似乎是一個“泰坦尼克號”的工作，但技術卻得到逐年的進步。在2003年4月，人類基因組排序完成，提前了幾年的時間。

基因組序列提供了最終的遺傳數(shù)據(jù)庫39.2FromGenestoGenomes

這種進步是國際跨越14年精心設計得來的成就。研究小組第一次發(fā)展出了人類基因組詳細物理圖譜，來自每個染色體的克隆整理成一系列的長段片段毗連群（圖9－17）。每一個毗連群的間隔或少于100000bp處都包含一個STSs（序列標志位點）形式的標志。因此，基因映射被分割在國際測序中心，每個中心的BAC映射序列和YAC克隆都有相對應的特定的基因片段。因為許多的克隆序列超過了100000bp長，而現(xiàn)代測序技術一次僅能測600-750bp，每一個克隆不得不由小的片段拼接而成。使用鳥槍法測序，研究者應用新的自動定序儀對隨機給定的克隆片段測序，然后通過電腦處理識別重疊片段，對整個克隆序列排序?？寺⌒蛄衅蔚臄?shù)量應用統(tǒng)計學來確定，所以克隆序列的全長都平均測序4到6次。DNA測序可以使一個數(shù)據(jù)庫覆蓋整個基因組，而后在二十世紀90年代末，一個重要期刊年度報告上有對其進展進行了總結，圖譜的主要部分已經(jīng)到位。最初計劃在2005年完成整個計劃，但在外界條件和科學技術的幫助下，提前完成了計劃。

9.2FromGenestoGenomes圖9-17人類基因組計劃戰(zhàn)略

從染色體組庫中分離出的克隆體按規(guī)則排列成詳盡的物理圖譜，然后，通過鳥槍法將獨立的克隆排序。在商業(yè)化測序計劃下的戰(zhàn)略預估了建立遺傳圖譜物理圖譜的步驟，通過鳥槍法測序了整個的基因組。9.2FromGenestoGenomes

人類基因組序列帶來的商業(yè)競爭，首先是1997年J.CraigVenter新成立的公司Celera，Celera團隊利用不同的戰(zhàn)略，省略了對基因圖譜的組裝，該方法被稱為“全基因測序.鳥槍法”。相反，能對在基因組隨機選擇的DNA片段進行測序。序列片段通過計算機識別重疊序列進行拼接。一開始認為，如此規(guī)模的人類基因組計劃應用鳥槍法測序是不切實際的。然而，先進的計算機軟件和測序自動儀使其已接近可能。接下來在單個序列和全人類基因組序列之間都趕著時間完成項目。

2011年出版的人類基因組序列草案，隨后是兩年的后續(xù)工作，到消除近數(shù)千個不連續(xù)間隔以提供連接整個基因組的高質量的數(shù)據(jù)。

基因組序列提供了最終的遺傳數(shù)據(jù)庫39.2FromGenestoGenomes

人類基因組計劃標志著二十一世紀生物學的頂峰，也給新世紀的科學領域帶來了深遠的改變。人類基因組僅僅是一部分，許多其他物種的基因組也在測序中，包括啤酒酵母（1996年完成）和裂殖酵母（2002），線蟲（1998），果蠅（2000），植物擬南芥(2000)，小家鼠（2002），斑馬魚，眾多的細菌和古細菌屬（圖9-18）。早期的成果主要集中在實驗室常用的一些生物種類。然而，為了實驗的需要和科技的進步，基因組測序發(fā)展到發(fā)展到許多其他物種也是必然的。為了使基因圖譜研究領域更廣闊，正嘗試識別新型的蛋白和致病基因，許多其他的方案也在進行中。

基因組序列提供了最終的遺傳數(shù)據(jù)庫39.2FromGenestoGenomes圖9－18基因組測序時間表1980s中期的討論引導了1989測序計劃的展開?；I備工作包括廣泛性測序提供基因坐標，這占用了1990s的大部分時間。個別單獨的項目主要是針對對實驗研究有重要意義的組織的基因組的測序。第一階段完成的測序工作包括了許多菌類，酵母，線蟲，果蠅和一種農作物。哺乳動物基因組測序的完成包含的人類基因組，開始于2000年。每個基因組計劃都有一個網(wǎng)站作為服務的中央資源庫提供最新的數(shù)據(jù)?；蚪M序列提供了最終的遺傳數(shù)據(jù)庫39.2FromGenestoGenomes

具有潛在價值的數(shù)據(jù)庫不僅能加速生物學的進程，也能改變人類自我反思的方式。早期對人類基因組序列洞察興趣從著迷到意義深遠，然而我們并沒有想象的那么復雜。經(jīng)數(shù)十年估計，在人類基因組中，人類基因組中發(fā)現(xiàn)取代了之前我們認為的只有30000到35000個基因，事實上人類擁有近似于3.2×109bp長的基因約100000個。這或許比果蠅基因3倍還多，是線蟲的2倍。盡管人類進化相對較近，但人類基因組卻很久遠。早期1278個蛋白家族在早期確認，僅有94個是脊椎動物特有的。然而，我們與植物、蠕蟲和蒼蠅共有很多蛋白質類型，而我們在更多復雜的過程用到這些蛋白。選擇基因表達模式，允許由單一基因產(chǎn)生更多蛋白過程--人類和其它脊椎動物比細菌、蠕蟲、或任何其他形式的生命參與更多的過程。這些也允許從我們的基因補足物產(chǎn)生更復雜的蛋白質。

基因組序列提供了最終的遺傳數(shù)據(jù)庫39.2FromGenestoGenomes

現(xiàn)在我們知道的僅是實際編碼蛋白DNA的1.1%到1.4%（圖9-19）。短的重復序列組成的基因組超過50%，絕大部分的那些—全部基因的45%--來自轉座子，短的可動DNA序列為寄生生物分子。許多的轉座子已經(jīng)長時間不移動，現(xiàn)在改變使他們不再移動到新的基因組點。其他的仍然在低頻率的移動，幫助基因組在持續(xù)的動態(tài)下，進化成實體。至少幾個轉座子對細胞功能是有用的。

基因組序列提供了最終的遺傳數(shù)據(jù)庫3圖9-19人類基因組計劃的簡單映射此表顯示了我們基因組不同種類序列的百分比例。9.2FromGenestoGenomes基因組序列提供了最終的遺傳數(shù)據(jù)庫39.2FromGenestoGenomes

所有已知信息有什么是關于人類與其他物種區(qū)別有多大的嗎？人類群體有成千上萬的差異，成為單一核苷酸多態(tài)性或SNPs。每個人在每1000bp中約有1bp不同。從這些細小的基因差異發(fā)展到人類的不同，我們知道的有頭發(fā)的顏色、視力、對藥物的敏感性、腳的大小，甚至是一些不同程度的行為。一些SNPs與特定人群相關，并能提供發(fā)生在數(shù)千年前和更久遠的進化時期人類遷移的重要信息。與這進展同樣壯觀的是，人類基因組序列很容易與即將要努力去明白的每個基因的全部信息作比較。這正是每月更新國際數(shù)據(jù)庫的基因組序列的發(fā)展藍圖，描述那些我們尚不清楚描述的過程。同樣，對去發(fā)現(xiàn)新的蛋白和對應的生化機制的影響有著巨大的推動作用?；蚪M序列提供了最終的遺傳數(shù)據(jù)庫3ThankYou!9.2FromGenestoGenomes請多批評指正9.3FromGenomestoProteomes特動養(yǎng)蜂田柳青Chapter9

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TECHNOLOGIES9.3從基因組到蛋白組學Contents序列或結構的關系提供了蛋白功能的信息

1細胞表達模式可以揭示細胞中基因的功能

2蛋白質互作的檢測有助于鑒定分子和細胞的功能

39.3從基因組到蛋白組學研究背景9.3從基因組到蛋白組學

一個基因不是一個簡單的DNA序列，是能轉化成有用的結果的信息，是任何時候都能提供細胞所需蛋白或是功能性RNA的分子。探索基因組序列的第一步也是最重要的一步，是為基因組的產(chǎn)物編寫目錄。編碼RNA作為終產(chǎn)物的基因比編碼蛋白的基因更難鑒別，盡管后者在脊椎動物基因組中很難發(fā)現(xiàn)。劇增的DNA序列信息也透露了一個事實真相。盡管經(jīng)多年的生化進步，但對每個真核細胞（也有不少在細菌中)還有成千上萬的蛋白質是我們所不知道。這些蛋白質可能參與一些我們還未發(fā)現(xiàn)功能過程，也可能以一些我們能理解的卻又意想不到的方式參與一些過程。此外，有關蛋白質的三維結構或蛋白合成后怎樣修飾，基因組序列并未告訴我們。在細胞中起關鍵作用的這些蛋白，現(xiàn)在正成為全部細胞生物化學新研究策略的焦點。

9.3從基因組到蛋白組學蛋白質組：基因組所表達的全部蛋白質這詞最早出現(xiàn)在1995年的研究文獻。這個概念迅速演變成一個獨立的研究領域,被稱為蛋白質組學。通過蛋白質組學解決問題很簡單，盡管解決方案不容易。每一個基因組為我們提供了成千上萬編碼的蛋白質的基因,在理想條件下，我們想要知道所有的蛋白質結構與功能。經(jīng)過多年研究許多蛋白質帶來了驚喜的成果，要形成一個完整的蛋白質組學研究卻是艱巨的事業(yè)。簡單地發(fā)現(xiàn)新蛋白的功能要求大量的工作。生物化學家利用新的快速發(fā)展的寬微列陣技術找到了快捷途徑。

9.3從基因組到蛋白組學蛋白質功能分三個水平：（1）表型功能指一個蛋白質在整個生物機體的作用。例如，缺少該蛋白可能導致組織生長遲緩，改變發(fā)育模式或是死亡。（2）細胞功能指參與細胞間相互作用的一種蛋白質。在細胞內與其他蛋白相互作用，幫助確定蛋白質參與的各種代謝過程。（3）分子功能指蛋白質的生化活性精確,包括了某些細節(jié),例如酶催化反應或配體與受體的結合。

9.3從基因組到蛋白組學研究蛋白質功能有三種主要途徑：（1）比較已知功能蛋白和基因的序列與結構（2）確定基因在什么位置什么時期表達（3）研究該蛋白與其他蛋白間的相互作用。

9.3從基因組到蛋白組學序列或結構的關系提供了蛋白功能的信息

1比較基因組學：指用基因組比較來確定基因功能。直系同源：指通過以前研究的另一個或相同物種的同源性基因，發(fā)現(xiàn)一個新的基因，由于這種關聯(lián)其功能也能全部或部分確定。一個基因存在于不同物種間，卻擁有相同功能關系的序列。旁系同源：指在單個物種中有相似的基因。如果知道某物種一個基因的功能特點，則根據(jù)直系同源體基因功能關系去找第二個物種。比較關系相近的物種的基因組最容易確定同一性，比如老鼠和人類，在細菌和人類之間也發(fā)現(xiàn)了許多同源基因。有時染色體上的基因保存了關系相近物種間基因組的大部分片段（圖9-20）。保守基因序列，稱同線性，為相同位置相關片段基因的同源關系提供了額外的證據(jù)。

9.3從基因組到蛋白組學序列或結構的關系提供了蛋白功能的信息

1圖9-20老鼠和人類基因組的同線型

老鼠和人類基因組的大量片段有著許多相關的基因，在染色體上按著相通的規(guī)則排列成一行，此關系稱為同線型。此表展示了人類染色體9和老鼠染色體2的片段。這些片段基因展示出了高程度的同分異構樣，和相同的基因排列規(guī)則?；蜃帜傅牟煌Q反應了兩種不同生物的命名規(guī)定。9.3從基因組到蛋白組學選擇性的鑒定特定序列與特定結構類型的相關性可以判定某一蛋白質。特定結構的存在，或許暗示了其能促進ATP水解，或結合DNA，或形成一個復雜的鋅離子，能幫助確定分子功能。這些關系的確定得益于日益復雜的計算機程序，突破了基因信息、蛋白質結構、特定序列與特定結構類型的相關性的限制。

序列或結構的關系提供了蛋白功能的信息

19.3從基因組到蛋白組學為了進一步了解結構與功能關系,一個大型結構蛋白質組學項目已經(jīng)開展了。目標是在許多幾乎沒有任何有關蛋白功能的信息情況下，能確定盡可能多的蛋白質及其結構域。這項計劃由一些繁瑣步驟的蛋白質結晶自動化操作來協(xié)助。這將有助于結構數(shù)據(jù)庫的構建。最終有助于確定結構類型發(fā)生何種程度的變化。當新發(fā)現(xiàn)蛋白質的結構褶皺,且與數(shù)據(jù)庫已知功能類型明確相關,說明這是蛋白質的某一分子功能。

序列或結構的關系提供了蛋白功能的信息

1二維凝膠電泳法

1DNA微列陣

2蛋白質芯片

39.3從基因組到蛋白組學細胞表達模式可以揭示細胞中基因的功能

2最新測序的基因組，并沒發(fā)現(xiàn)編碼蛋白的基因與已知基因或蛋白結構有關。這種情況下，需要通過其他的方法去探究與基因功能相關的信息。鑒別其組織的某個基因的表達或是什么情況下能觸發(fā)基因表達，都將提供一些有價值的信息。為了研究這些項目開發(fā)了許多不同的方法。

9.3從基因組到蛋白組學二維凝膠電泳法

1細胞表達模式可以揭示細胞中基因的功能

2

二維凝膠電泳法能在一塊凝膠上分開顯示1000個不同的蛋白質。質譜分析法常用于對個別蛋白點的測序，并指出其基因歸類。觀察來自不同組織或相同組織的，或者不同發(fā)育階段，或是模仿不同化學條件下的樣品，針對其特定蛋白斑點的有無以判定幫助判定分子功能。

9.3從基因組到蛋白組學DNA微列陣

2細胞表達模式可以揭示細胞中基因的功能

2

將DNA數(shù)據(jù)庫、PCR和雜交技術結合在一起產(chǎn)生的稱為DNA微列陣的新技術，這種方法可用來同時快速篩選數(shù)千個基因。已知基因的DNA序列，成百上千的核苷酸通過PCR擴增，利用自動點樣裝置將微量DNA（精確到納升）點到固相支持體表面。在數(shù)平方厘米內布置著數(shù)千個預先設計的樣品點。另一種方法就是直接在固體表面合成DNA片段（圖9-21）。一旦芯片構成，可用來探測來自特定細胞類型或細胞培養(yǎng)的mRNAs或cDNAs，或鑒定基因在細胞中表達的。

9.3從基因組到蛋白組學圖9－21影印平板技術－制備微列陣

充分利用了核苷酸前體，因為核苷酸前體在光照下具有活性，光致反應下能連接一個核苷酸和臨近的核苷酸?；钚院塑账岜绘i定以便每次循環(huán)中只有一個核苷酸被加載在鏈上。覆蓋在表面的擋板在編碼接受特殊核苷酸分子的表面上，然后在未覆蓋區(qū)域一道閃光參與核苷酸成為聚合體。

9.3從基因組到蛋白組學細胞表達模式可以揭示細胞中基因的功能

2微列陣分析可以回答諸如某個機體發(fā)育的特定階段有哪些基因表達這樣的問題。在兩個不同的發(fā)育階段提取細胞的總mRNA，然后用反轉錄酶合成cDNA，同時進行熒光標記。將這兩種熒光標記cDNA混合作為探針與DNA微列陣上的互補DNA雜交（圖9-22）。如圖，兩種樣品制作出來的cDNA標記的核苷酸發(fā)兩種不同的熒光，來自兩個樣本的cDNA混合在一起當成了微列陣的探針。綠色熒光的點表示單細胞期表達水平高的基因，而紅色代表后來發(fā)育中表達過高的基因。DNA微列陣

29.3從基因組到蛋白組學

這種用混合探針來檢測相對而不是絕對水平的表示方法可以糾正在微列陣點樣中所產(chǎn)生的誤差。熒光點陣使得可以了解并獲得整個細胞染色體范圍的各種基因的表達水平。對于未知基因而言，表達的時間和環(huán)境可以提供其在細胞內發(fā)揮作用的重要線索。這里，mRNA收集自兩個不同發(fā)育時期的青蛙細胞。兩種cDNA用不同顏色的熒光素標記，混合后作為探針檢測微列陣中互補基因的序列。發(fā)出綠色熒光的點代表在單細胞期表達較高的基因，而發(fā)出紅色熒光的點代表在后來的發(fā)育階段表達較高的基因。9.3從基因組到蛋白組學細胞表達模式可以揭示細胞中基因的功能

2圖9-23就是一個很好的例子，顯示該技術取得了顯著的效果。經(jīng)過完全測序的6000多個酵母基因片段分別用PCR擴增，然后被點在固體表面制成DNA微列陣。9.3從基因組到蛋白組學細胞表達模式可以揭示細胞中基因的功能

2圖9-23

DNA微列陣放大后的圖像

微列陣中每一個發(fā)光點都包含了酵母基因組6200基因中的某個基因的DNA，列陣呈現(xiàn)了每一個基因。列陣使用來自mRNA獲得熒光標記核酸進行探測（1）當細胞正常培養(yǎng)生長時（2）四個小時細胞開始形成芽孢。綠色的點代表在正常生長時基因表達水平更高；紅色點代表在芽孢形成中基因表達水平更高。黃色點代表在芽孢形成中基因不能改變表達水平。這個圖是放大的；微列陣事實上只有1.8*1.8cm。

DNA微列陣

29.3從基因組到蛋白組學細胞表達模式可以揭示細胞中基因的功能

2蛋白質芯片

3蛋白質固定在固體表面可以幫助確定樣品中是否有蛋白質。例如，實驗者排列特異蛋白抗體固定在固體表面上單獨的點上。添加蛋白質樣品，如果能夠結合抗體的蛋白出現(xiàn)在樣品中，能通過固態(tài)形式的酶聯(lián)免疫吸附劑測定分析檢驗出來。許多其它類型和運用的蛋白芯片還在發(fā)展當中。9.3從基因組到蛋白組學蛋白質互作的檢測有助于鑒定分子和細胞的功能

3基因組成分的比較

1蛋白質復合物的分離純化

2酵母雙雜交分析

3鑒定任何蛋白質功能的關鍵是確定誰與之結合。就拿蛋白質互相作用來說，未知功能的蛋白質和已知功能蛋白質結合能提供有用的令人信服的“牽連性結合”。正是這一方面技術的使用表現(xiàn)出了多樣性。

9.3從基因組到蛋白組學蛋白質互作的檢測有助于鑒定分子和細胞的功能

3基因組成分的比較

1雖然沒有直接的關聯(lián)性證據(jù)，越來越多特殊基因組中基因結合的出現(xiàn)暗示了其蛋白質的功能。我們能簡要的搜尋特殊基因的基因組數(shù)據(jù)庫，然后判定其它的基因出現(xiàn)在同一染色體上（圖9-24）。當兩個基因總是出現(xiàn)在同一個染色體上時，就可能暗示它們編碼的蛋白功能上相關。如果至少有一個蛋白質的功能已知，那么這樣的相關性是最有用的。9.3從基因組到蛋白組學圖9-24比較基因組學的使用以鑒定功能相近的基因功能基因組學的作用之一是為研究系統(tǒng)發(fā)生的輪廓以鑒定總是一起出現(xiàn)在基因組中的基因。這個例子就是比較了四個不同組織的基因，但事實上，電腦檢索能辨出數(shù)十個品種。命名的P1、P2等等涉及了每一物種編碼的蛋白質。這項技術并不需要相應的蛋白質。在這個例子中，由于蛋白質P3、P6總是同時出現(xiàn)在基因組中，它們很可能是功能相關的。進一步測驗是將需要確認這種推論9.3從基因組到蛋白組學蛋白質互作的檢測有助于鑒定分子和細胞的功能

3蛋白質復合物的分離純化

2

關于與抗原表位標簽相連融合的基因的cDNA的數(shù)據(jù)庫的構建，運用抗體蛋白結合抗原決定基的方法，實驗者使用免疫沉淀反應沉淀基因的蛋白產(chǎn)物（圖9-15b）。如果標記蛋白在細胞中表達，另一些與之結合的蛋白可能也參與了表達。這些關聯(lián)蛋白的鑒定證明了標記蛋白的蛋白互相作用機制。

9.3從基因組到蛋白組學蛋白質互作的檢測有助于鑒定分子和細胞的功能

3蛋白質復合物的分離純化

2各種不同