《生物化學(xué)技術(shù)實驗》課件

生物化學(xué)技術(shù)實驗部分

(2010版)1完整版課件ppt

生物化學(xué)研究的核心任務(wù)：闡明生命現(xiàn)象的分子機理。2完整版課件ppt生物大分子物質(zhì)制備的基本過程：確定測定方法材料的選擇與處理抽提濃縮純化有效成分純度和性質(zhì)的分析3完整版課件ppt電泳

前處理濃縮、粗分離細分離生物組織

無細胞提取液破碎、溶解、差速離心、過濾沉淀法親和層析離子交換層析精制后的蛋白質(zhì)凝膠過濾吸附層析蛋白質(zhì)的制備：4完整版課件ppt一、蛋白質(zhì)的性質(zhì)：（1）兩性解離的性質(zhì)：pI（2）膠體性質(zhì)：不能通過半透膜（3）具有沉淀作用：等電點沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等（4）變性、復(fù)性（5）紫外吸收5完整版課件ppt二、分離純化蛋白質(zhì)的主要方法

（一）根據(jù)溶解度差異分離：選擇性沉淀法等電點沉淀法鹽析法有機溶劑沉淀法6完整版課件ppt有機溶劑沉淀法利用生化物質(zhì)在不同濃度的有機溶劑中溶解度差異而分離的方法。

7完整版課件ppt降低水活性，使溶液的介電常數(shù)下降，增加蛋白質(zhì)溶質(zhì)分子之間的作用力，因而聚集在一起。Membraneprotein■有機溶劑沉淀法Water-solubleprotein溶解度Water-solubleprotein-+++++------+++++-----------++++++++++-+-+++++----+++++------+++++-----有機溶劑Solvent%=hydrophilic8完整版課件ppt有機溶液沉淀法的優(yōu)缺點優(yōu)點分辨力比鹽析法高，溶劑易于除去和回收。缺點易使某些蛋白質(zhì)或酶變性。9完整版課件ppt常用的有機溶劑乙醇、丙酮丙酮沉淀能力比較強10完整版課件ppt用有機溶劑沉淀法時應(yīng)注意的問題①溫度的控制②有機溶劑的選擇③pH值的選擇④離子強度的選擇⑤分離溶液濃度的控制⑥及時處理沉淀物11完整版課件ppt溫度的控制全部操作過程應(yīng)在低溫條件進行，而且最好在同一溫度下進行。加入的有機溶劑溫度要預(yù)冷。12完整版課件pptpH值的選擇pH值影響蛋白質(zhì)在有機溶劑中溶解度，分級沉淀時更應(yīng)嚴格控制pH值。應(yīng)選擇pH值在等電點（PI）附近。13完整版課件ppt離子強度的選擇離子強度達到一定程度時，能增加蛋白質(zhì)或酶在有機溶劑中的溶解度。離子強度≤0.05mol/L為好，過大則需更多的有機溶劑來沉淀。由鹽析法沉淀得到的蛋白質(zhì)或酶，用有機溶劑沉淀前，一定要先透析除鹽。14完整版課件ppt分離溶液濃度的控制蛋白質(zhì)濃度愈大，加入有機溶劑后，蛋白質(zhì)沉淀量就愈多。蛋白質(zhì)濃度大時，可減少變性，節(jié)省有機溶劑用量。濃度過大，共沉淀現(xiàn)象增加，不利于分級沉淀。15完整版課件ppt及時處理沉淀物沉淀物要立即用水或緩沖液溶解，降低有機溶劑的濃度。

16完整版課件ppt（二）、根據(jù)分子大小和形狀的差異分離①透析和超濾法：除去小分子物質(zhì)半透膜阻留pr分子，而讓小的溶質(zhì)分子和水通過，以達到除去蛋白質(zhì)溶液中小分子（鹽、低分子酸等）。17完整版課件ppt施以一定的壓力使小分子溶質(zhì)通過一半透膜，而按半透膜的篩孔大小截留相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子18完整版課件ppt沉降的速度與顆粒的大小和密度有關(guān)。離心后按其沉降的速度不同，彼此分開形成區(qū)帶。再進行光學(xué)定位，針刺或冰凍切片采樣分析②密度梯度離心法19完整版課件ppt20完整版課件ppt凝膠過濾層析的原理:介質(zhì)：交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）;聚丙烯酰胺凝膠（Bio-GelP，）瓊脂糖凝膠（Sepharose，Bio-GelA）③凝膠過濾法21完整版課件ppt22完整版課件ppt23完整版課件ppt支持物的選擇：24完整版課件ppt（三）根據(jù)電荷性質(zhì)的差異分離

1、電泳和等電聚焦法：普通電泳、等電聚焦、雙向電泳、脈沖電泳、毛細管電泳支持物： PAGE、瓊脂糖膠等25完整版課件pptPolyacrylamideGelElectrophoresis(PAGE)Moleculesareseparatedbysizeandchargeinanelectricfield.26完整版課件ppt27完整版課件pptIsoelectricFocusingreliesonthemigrationofchargedproteinsinanelectricfield28完整版課件ppt等電聚焦法29完整版課件ppt30完整版課件ppt2、離子交換層析法

基質(zhì)：纖維素、交聯(lián)葡聚糖、樹脂電荷基團：陽離子交換劑31完整版課件ppt32完整版課件ppt（四）配體親和力的差異：親和層析

利用生物大分子能和其配體（例：酶和抑制劑，抗原和抗體，激素和受體）通過次級鍵專一性結(jié)合，而在一定的條件下又可解離的原理進行層析的方法。用這種層析方法，一次可將物質(zhì)提得很純，是一種專門用于分離生物大分子的層析方法。33完整版課件ppt34完整版課件ppt■親和層析作用機理：(1)(2)(3)ABSampleWashingElutionXB配體XBAA35完整版課件ppt親和吸附劑的制備分離純化一定數(shù)量的游離配體載體活化配體與載體偶聯(lián)36完整版課件ppt37完整版課件pptActivity■親和層析圖譜：ElutionvolumeProteinpH2.05*38完整版課件ppt（五）HPLC（highperformance/pressureliquidchromatography)HPLC的特點：1.支持介質(zhì)顆粒細，比表面積大。2.溶劑系統(tǒng)采取高壓，洗脫速度增大。HPLC是一項快速、靈敏、高效的分離技術(shù)。39完整版課件ppt純化方案的評價比活力：

活力單位數(shù)/mg蛋白純化倍數(shù)：

每步的比活力/粗抽提液的比活力回收率：

每步的總活力/粗提液的總活力×100%40完整版課件ppt親和層析純化胰蛋白酶手腦并用，知行合一41完整版課件ppt胰蛋白酶的制備

目前工業(yè)上提取胰蛋白酶主要有二種途徑：1、從動物胰臟中直接提取。2、從豬胰殘渣中提取。42完整版課件ppt胰蛋白酶

的性質(zhì)

43完整版課件ppt胰蛋白酶在pH3.0時最為穩(wěn)定，低于此pH時酶易變性；

當(dāng)高于pH5.0以上時，酶易自溶而會失去活性。提取制備胰蛋白酶的全部過程中應(yīng)注意溶液的pH值以及在冷室（0一5℃）中進行操作為宜。44完整版課件ppt胰蛋白酶是以無活性的酶原形式存在于動物的胰臟中。胰蛋白酶原先正常生理條件下，可以被腸激酶、鈣離子所激活或自我活化成為有活力的酶。45完整版課件ppt豬胰蛋白酶原分子量為24-25kDa之間，而豬胰蛋白酶原激活后，N-端丟失－個6肽，分子量變?yōu)?3.4kDa，分子構(gòu)象發(fā)生了一定的改變，pI變?yōu)?0.8。46完整版課件ppt胰蛋白酶對R1=Arg和Lys肽鍵具有選擇性水解作用，將蛋白質(zhì)水解為多肽或氨基酸。-HN-CH-CO-NH-CH-CO-R1R247完整版課件ppt由于血清含有非特異性胰蛋白酶抑制劑，使胰蛋白酶不會消化正常組織。

在胰臟、雞蛋清和大豆中，都含有相當(dāng)量的胰蛋白酶抑制劑。48完整版課件ppt胰蛋白酶不僅能夠水解Arg和Lys羧基所組成的肽鍵，而且也能水解酰胺鍵和酯鍵。對其催化水解活性的敏感度為：

酯鍵＞酰胺鍵＞肽鍵

49完整版課件ppt胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶(糜蛋白酶)和彈性蛋白酶三種酶在理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上均十分接近，利用一般常用的提取分離方法，很難將它們之間彼此徹底分開。為了獲得高純度的胰蛋白酶制品，采用親和層折技術(shù)進一步純化后，可達到十分滿意的效果。50完整版課件ppt胰蛋白酶的天然抑制劑

雞卵類粘蛋白(CHOM)

51完整版課件ppt

CHOM在中性及偏酸性溶液中對熱及高濃度的脲、有機溶劑有較高的耐受性，在堿性條件下易變性，在50%的丙酮或者10%三氯醋酸溶液中仍然有較好的溶解度。因此選擇合適的pH值、丙酮或三氯醋酸的濃度，可以從雞蛋清中除去大量的非卵類粘蛋白，從而獲得較純的CHOM。CHOM的理化性質(zhì)（分離純化的依據(jù)）52完整版課件ppt

CHOM是一種糖蛋白，存在于雞蛋清中，是一種專一性很強的胰蛋白酶的抑制劑。CHOM對豬和牛的胰蛋白酶有很強的抑制作用，而對糜蛋白酶無抑制作用。在pH7.6—pH8.0的范圍內(nèi)，豬或牛的胰蛋白酶能牢固地吸附在CHOM上，在pH2.5-3.0的范圍內(nèi)，又能從CHOM上被洗脫下來。CHOM的性質(zhì)（作為親和層析配體純化胰蛋白酶的依據(jù)）53完整版課件ppt一分子的CHOM能抑制一分子的胰蛋白酶。1mg雞卵類粘蛋白能抑制0.86mg胰蛋白酶。54完整版課件ppt

采用雞卵類粘蛋白作為配基合成親和吸附劑，可以從豬胰臟的粗提液中，通過親和層析柱直接獲得純度很高的豬胰蛋白酶。比活力常?？梢赃_到15000--20000BAEE單位/mg蛋白，相當(dāng)于五次重結(jié)晶的胰蛋白酶，純化效率可提高10-20倍。親和層析純化胰蛋白酶的效果55完整版課件ppt胰蛋白酶活性的測定及CHOM抑制活性的測定

56完整版課件ppt

在任何蛋白質(zhì)純化過程中，關(guān)鍵的第一步是建立自始至終都要用的測活方法，這是策略上要作的最重要的決定，測活方法應(yīng)始終是可信的。57完整版課件ppt

胰蛋白酶除了能水解蛋白質(zhì)中堿性氨基酸的羧基與其它氨基酸所組成的肽鍵外，還能水解堿性氨基酸所組成的酯鍵。胰蛋白酶也能催化由堿性氨基酸的羧基所形成的酯鍵和酰胺鍵，而其高度的專一性仍表現(xiàn)為對堿性氨基酸的羧基一側(cè)的選擇。依據(jù)58完整版課件ppt

底物：N-苯甲酰－L一精氨酸乙酯（簡稱BAEE）BAEE在胰蛋白酶催化下水解成N-苯甲酰－L一精氨酸（簡稱

BA），BAEE在波長253nm下的紫外光吸收遠遠弱于BA，隨著BA逐漸增多，反應(yīng)體系在波長253nm下的紫外光吸收亦隨之相應(yīng)增加，用紫外吸收法測定BA的增加，可以作為測定胰蛋白酶活性及雞卵類粘蛋白抑制活性的專一性方法。方法59完整版課件ppt胰蛋白酶的BAEE單位定義為：在下列實驗條件下，引起每分鐘光吸收值A(chǔ)253nm增加0.001的酶量。

底物（BAEE）濃度為1mmol/L

反應(yīng)液為0.05mol/LTris-HCl,pH7.6

光程1cm

反應(yīng)溫度25℃

波長253nm

OD值遞增0.001/min60完整版課件ppt1、

以雞蛋清為原料經(jīng)過提取、分離、純化等手段得到一個純度較高的胰蛋白酶的天然抑制劑雞卵類粘蛋白（簡稱CHOM），以豬胰臟為原料經(jīng)過提取、分離、激活等步驟得到胰蛋白酶的粗提液。并且對所得到的雞卵類粘蛋白和豬胰蛋白酶的含量、純度及其生物活性進行測定。

2、以SEPHAROSE4B為載體經(jīng)過活化，偶聯(lián)合成一個具有專一性的特殊配基--卵類粘蛋白作為親和吸附劑。

3、用自己合成的親和吸附劑，通過親和層析技術(shù)得到非常純的豬胰蛋白酶。

實驗內(nèi)容提要61完整版課件ppt實驗流程

62完整版課件ppt1.雞卵類粘蛋白的制備?雞卵類粘蛋白粗品的制備?雞卵類粘蛋白粗品的精制

2.親和吸附劑的合成

載體的活化

配體與載體的偶聯(lián)親和吸附劑的裝柱

3.豬胰蛋白酶粗提液的制備及酶的精制

豬胰蛋白酶原的提取

胰蛋白酶原的激活上親和層析柱純化

三大任務(wù)63完整版課件ppt!做明白人，干明白事。先動腦，再動手。

！實驗無小事，事事不馬虎。

!實驗結(jié)果和數(shù)據(jù)及時保存及處理

!保持實驗室整潔

。。。。。N項注意64完整版課件ppt*胰蛋白酶標準品的比活力（BAEE單位/mg蛋白）*雞卵類粘蛋白粗品和純品的抑制比活力（BAEE單位/mg蛋白）*胰蛋白酶粗提液及純品的比活力（BAEE單位/mg蛋白）*.雞卵類粘蛋白產(chǎn)率(mg/100ml):

100ml雞蛋清得到雞卵類粘蛋白的mg數(shù)。*.偶聯(lián)率(mg/g):1gSepharose4B偶聯(lián)雞卵類粘蛋白的mg數(shù)。*.親和吸附率(mg/g):1gSepharose4B結(jié)合胰蛋白酶的mg數(shù)。*.活性回收率:經(jīng)親和層析后的胰蛋白酶總活性除以上樣胰蛋白酶總活性。*.純化倍數(shù):親和層析純化的胰蛋白酶比活性與上樣前的比活性之比。需要得到的結(jié)果65完整版課件ppt*SephadexG-25柱層析雞卵類粘蛋白脫鹽的層析圖66完整版課件ppt*DE-32纖維素離子交換柱層析分離雞卵類粘蛋白的層析圖67完整版課件ppt*繪制親和層析分離胰蛋白酶的層析圖68完整版課件ppt操作步驟

69完整版課件ppt用具清洗和試劑配制70完整版課件ppt0.02mol/L,pH6.5磷酸緩沖液

(磷酸氫二鈉磷酸二氫鈉緩沖液)

注意：

0.2mol/L是指Na2HPO4和NaH2PO4的總濃度。先配制10倍的母液（0.2mol/L），用時稀釋10倍。1、查附錄中緩沖液配制表，確定Na2HPO4和

NaH2PO4的比例；2、分別配制0.2mol/L的Na2HPO4和NaH2PO4溶液；3、按比例混合0.2mol/LNa2HPO4溶液和0.2mol/LNaH2PO4溶液，直至pH為6.5。71完整版課件pptpH0.2mol/LNa2HPO4/ml0.2mol/LNaH2PO4/mlpH0.2mol/LNa2HPO4/ml0.2mol/LNaH2PO4/ml5.88.092.07.061.039.06.012.387.77.272.028.06.426.573.57.481.019.06.531.568.57.687.013.06.637.562.57.891.58.56.849.051.08.094.75.3磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液

（0.2mol/L,pH5.8-8.0）（25℃）0.2mol/L磷酸氫二鈉：Na2HPO4·12H2O71.64g/1,000ml0.2mol/L磷酸二氫鈉：NaH2PO4·2H2O31.21g/1,000ml72完整版課件ppt雞卵類粘蛋白的制備

73完整版課件ppt50毫升雞蛋清+50毫升10%三氯醋酸的鹽溶液，產(chǎn)生白色沉淀，pH應(yīng)為3.5。

室溫靜置4小時以上，3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。上清液用濾紙過濾。pH為3.5。

緩慢加入3倍體積的預(yù)冷丙酮。在冰浴中靜置4小時。

2、SephadexG-25凝膠層析脫鹽

稱取30克SephadexG-25，用0.02mol/L,pH6.5磷酸緩沖液室溫溶脹24小時。

真空脫氣后裝柱，用0.02mol/L,pH6.5磷酸緩沖液平衡柱床，直至記錄儀繪出穩(wěn)定基線。取20毫升雞卵類粘蛋白粗提液上柱脫鹽（上樣量不超過柱床體積的1/6），用0.02mol/L,pH6.5磷酸緩沖液洗脫，收集第一峰。1.雞卵類粘蛋白的制備74完整版課件ppt3、雞卵類粘蛋白粗品的精制

（離子交換纖維素層析）

稱取DE-32粉10克，用150ml0.5mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl溶液浸泡20分鐘，抽濾，用蒸餾水洗至中性后，抽去水分。

用150ml0.5mol/LHCl

溶液浸泡20分鐘，抽濾，用蒸餾水洗至中性后，抽去水分。

用150ml0.02mol/L,pH6.5的磷酸緩沖液浸泡10分鐘，脫氣裝柱。

75完整版課件ppt將脫鹽后的雞卵類粘蛋白粗提液上柱，以0.02mol/L,pH6.5的磷酸緩沖液洗去雜蛋白。用0.3mol/LNaCl-0.02mol/LpH6.5磷酸緩沖液洗脫，收集第二峰。將經(jīng)DE-32純化的雞卵類粘蛋白溶液裝入透析袋內(nèi)，用蒸餾水透析，直到用1%硝酸銀檢查無氯離子為止。

調(diào)pH至4.0,加3倍體積的預(yù)冷丙酮，冰浴靜置4小時以上，離心取沉淀，即得雞卵類粘蛋白純品。

76完整版課件ppt標準胰蛋白酶比活性的測定CHOM粗品/純品抑制比活性的測定CHOM純品的要求：品質(zhì)：比活力≥8,000BAEEunit/mgprotein數(shù)量：≥200mg77完整版課件ppt親和吸附劑的合成

78完整版課件ppt載體Sepharose4B的活化稱取12克（濕重）Sepharose4B凝膠，用100ml0.5mol/NaCl溶液淋洗，再用蒸餾水洗去NaCl，抽干。

加10ml2mol/LNaOH,5ml環(huán)氧氯丙烷，5ml乙晴。室溫下攪拌活化16-20小時。

用蒸餾水洗去未反應(yīng)得殘留試劑，再用0.1mol/LpH9.5NaCO3緩沖液洗滌,處理好待用。一步都不能出錯！不要忘記測定和計算！79完整版課件ppt活化載體與雞卵類粘蛋白（配體）的偶聯(lián)用10毫升0.1mol/LpH9.5NaCO3緩沖液溶解雞卵類粘蛋白，加入到活化好得Sepharose4B凝膠中，室溫下，攪拌20-24小時。偶聯(lián)終止后，抽濾。用0.5mol/NaCl溶液洗去未被偶聯(lián)的雞卵類粘蛋白，再用蒸餾水洗去NaCl。用0.1mol/L甲酸-0.5mol/LKCl,pH2.5的溶液洗，破壞殘存的環(huán)氧基。再用蒸餾水洗至中性。用30毫升親和柱平衡液浸泡10分鐘，脫氣裝柱。一步都不能出錯！不要忘記測定和計算！80完整版課件ppt豬胰蛋白酶粗提液的制備及酶原的激活取胰臟50克，加150毫升預(yù)冷的乙酸酸化水，用組織搗碎機搗碎。

勻漿。在5-10℃提取4小時以上。四層紗布過濾。濾液用2.5mol/LH2SO4調(diào)pH2.5-3.0。靜置2-4小時，過濾收集濾液就是胰蛋白酶粗提液。

酶原粗提液用NaOH調(diào)節(jié)pH8.0,加入固體CaCl2使溶液的Ca++濃度達到0.1mol。加2mg結(jié)晶豬胰蛋白酶，攪勻，于4℃冰箱中激活12-16小時。待酶比活力達到800-1000BAEE/mg停止激活，用2.5mol/LH2SO4調(diào)pH2.5-3.0，濾去CaSO4沉淀物，備用。不要忘記測定和計算！81完整版課件ppt親和吸附劑裝柱→上樣→洗脫親和層析純化胰蛋白酶不要忘記測定和計算！82完整版課件ppt價格表品名價格Sepharose4B4100元/1LDEAE-32cellulose2600元/100gSephadexG-251800元/100gAcetone………83完整版課件ppt時間安排84完整版課件ppt

★講授實驗原理及操作★清洗用具、配制試劑（注意貼好標簽）★提取CHOM(做到丙酮沉淀CHOM，過夜）★溶脹SephadexG-25（干粉）