T-JAASS 144-2024 土壤微生物胞外酶活性測(cè)定熒光法

ICS65.020.99JAASSDeterminationofsoilmicrobialextracellularenzymeactivityFluorescencemethodIT/JAASS144—2024前言 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4原理 25土壤采集和試劑配制 26實(shí)驗(yàn)儀器 37具體操作 38結(jié)果計(jì)算 4附錄A（資料性）MUB或AMC標(biāo)準(zhǔn)曲線配制 5T/JAASS144—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由江蘇省農(nóng)學(xué)會(huì)提出并歸口。本文件起草單位：寧波大學(xué)、寧波市鄞州區(qū)農(nóng)技推廣站、中國科學(xué)院南京土壤研究所、寧波（北侖）中科海西產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心。本文件主要起草人：祝貞科、葛體達(dá)、王先挺、張廣斌、李剛、劉瓊、張昊青、魏亮。1T/JAASS144—2024土壤微生物胞外酶活性測(cè)定熒光法本文件描述了土壤微生物胞外酶活性利用微孔熒光法的測(cè)定方法。本文件適用于使用微孔熒光法檢測(cè)土壤中與碳、氮、磷循環(huán)相關(guān)的關(guān)鍵水解酶活性，且酶底物熒光指示劑需是4-甲基傘形酮或7-氨基-4-甲基香豆素。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。CB/T603化學(xué)試劑試驗(yàn)方法中所用制劑及制品的制備GB7172土壤水分測(cè)定法GB/T32722土壤質(zhì)量土壤樣品長(zhǎng)期和短期保存指南GB/T36197土壤質(zhì)量土壤采樣技術(shù)指南HJ613土壤干物質(zhì)和水分的測(cè)定重量法T/GSSF004土壤樣品采集、制備及保存技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1β-1.4-葡萄糖苷酶β-1.4-Glucosidase：BG是一種碳降解酶，在碳循環(huán)過程中降解β-1.4-葡聚糖和纖維素，將纖維二糖水解為葡萄糖。3.2是一種碳降解酶，碳循環(huán)過程中水解低聚木糖生成木糖。3.3纖維二糖葡萄糖苷酶B-D-cellobioside：CBH是一種碳降解酶，碳循環(huán)過程中從纖維素分子的非還原端水解纖維二糖二聚體。3.4β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶β-N-acetylglucosaminidase：NAG是一種氮降解酶，氮循環(huán)過程中在幾丁質(zhì)和其他β-1.4-連接的氨基葡萄糖聚合物的降解中發(fā)揮作3.5亮氨酸氨基肽酶Leucineaminopeptidase：LAP是一種氮降解酶，氮循環(huán)過程中從多肽的N端水解亮氨酸和其他疏水性氨基酸。3.6磷酸酶Acidphosphatase：PHOS是一種磷降解酶，磷循環(huán)過程中水解磷酸單酯或磷酸二酯，釋放出磷酸。3.74-甲基傘形酮4-Methylumbelliferone：MUB是一種水溶性的強(qiáng)熒光染料，在測(cè)定過程中，通過酶的催化作用，標(biāo)記有傘形酮的底物發(fā)生分子內(nèi)消除反應(yīng)，導(dǎo)致傘形酮脫落，形成與原底物具有不同的光學(xué)特征的產(chǎn)物。目前廣泛使用的底物有4-甲基傘型酮β-1.4-葡萄糖苷(4-MUB-β-D-glucoside)、4-甲基傘型酮β-木糖苷（4-MUB-β-Xylosidase）、2T/JAASS144—20244-甲基傘型酮纖維二糖苷(4-MUB-β-D-cellobioside)、4-甲基傘形酮乙酰氨基葡萄糖苷(4-MUB-β-N-acetylglucosaminidase)、4-甲基傘形酮磷酸酯(4-MUB-Phosphate)，分別是β-1.4-葡萄糖苷酶、β-木糖苷酶、纖維二糖葡萄糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、亮氨酸氨基肽酶、磷酸酶的熒光指示劑。3.87-氨基-4-甲基香豆素7-Amino-4-methylcoumarin：AMC是一種水溶性的強(qiáng)熒光染料，是亮氨酸氨基肽酶底物特有的熒光指示劑。4原理熒光酶測(cè)定使用來自底物熒光的差異來測(cè)量酶反應(yīng)。熒光是當(dāng)吸收不同波長(zhǎng)的光后分子發(fā)出一個(gè)波長(zhǎng)的光，其與特定底物結(jié)合時(shí)熒光特性消失，當(dāng)酶分解其特異性底物時(shí)，通過酶的水解作用，底物中包含的熒光物質(zhì)MUB或AMC被釋放出來，由于MUB和AMC在365nm波長(zhǎng)處激發(fā)，在450nm處檢測(cè)到熒光，進(jìn)而設(shè)定365nm激發(fā)波長(zhǎng)和450nm檢測(cè)波長(zhǎng)，通過檢測(cè)其熒光量來表征酶活性。5土壤采集和試劑配制5.1土壤樣品采集及保存5.1.1樣品采集土壤樣品采集應(yīng)符合GB/T36197和T/GSSF004的規(guī)定。5.1.2樣品保存采集的樣品按照GB/T32722和T/GSSF004的規(guī)定4℃儲(chǔ)存，7天之內(nèi)測(cè)定。5.2試劑配制試劑應(yīng)按照GB/T603的規(guī)定進(jìn)行制備。5.2.1標(biāo)準(zhǔn)物——標(biāo)準(zhǔn)物1：MUB稱取17.5mgMUB溶于80mL無菌去離子水中，將其轉(zhuǎn)移至100mL棕色容量瓶，用無菌去離子水定容至100mL，濃度為1mmol/L?！獦?biāo)準(zhǔn)物2：AMC稱取17.5mgAMC溶于80mL無菌去離子水中，將其轉(zhuǎn)移至100mL棕色容量瓶，用無菌去離子水定容至100mL，濃度為1mmol/L。5.2.21MNaOH溶液稱取NaOH4.00g溶于80mL無菌去離子水中，將其轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶，用無菌去離子水定容到100mL，濃度為1mol/L。5.2.3乙酸鈉緩沖液稱取乙酸鈉6.804g于1L燒杯中，加無菌去離子水至800mL，用冰醋酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至測(cè)定樣品的適宜值，再將其轉(zhuǎn)移至1L容量瓶中，用無菌去離子水定容至1L，配制成濃度為50mmol/L。pH具體值需要根據(jù)采集土壤的pH分布及均值確定，調(diào)節(jié)至土壤最適pH。5.2.4Tris（三羥甲基氨基甲烷）緩沖液稱取6.057gTris堿溶于800mL無菌去離子水中，再將其轉(zhuǎn)移至1L容量瓶中，用無菌去離子水定容至1L，用NaOH溶液調(diào)至適宜pH，配制成濃度為50mmol/L。5.2.5不同底物溶液3T/JAASS144—2024——BG酶底物：稱取6.77mg4-甲基傘型酮β-1.4-葡萄糖苷溶于80mL無菌去離子水中，再將其轉(zhuǎn)移至100mL棕色容量瓶中，用無菌去離子水定容至100mL，濃度為200μmol·L-1，棕色玻璃瓶保存?！猉YL酶底物：稱取6.17mgβ-木糖苷溶于80mL無菌去離子水中，再將其轉(zhuǎn)移至100mL棕色容量瓶中，用無菌去離子水定容至100mL，濃度為200μmol·L-1，棕色玻璃瓶保存?！狢BH酶底物：稱取0.01g4-甲基傘型酮纖維二糖苷溶于80mL無菌去離子水中，再將其轉(zhuǎn)移至100mL棕色容量瓶中，用無菌去離子水定容至100mL，濃度為200μmol·L-1，棕色玻璃瓶保存。——NAG酶底物：稱取7.59mg4-甲基傘形酮乙酰氨基葡萄糖苷溶于80mL無菌去離子水中，再將其轉(zhuǎn)移至100mL棕色容量瓶中，用無菌去離子水定容至100mL，濃度為200μmol·L-1，棕色玻璃瓶保存?！狶AP酶底物：稱取6.5mgL-亮氨酸-7-酰胺基-4-甲基香豆素溶于溶于0.5mL丙酮，再將其轉(zhuǎn)移至100mL棕色容量瓶中，用無菌去離子水定容至100mL，濃度為200μmol·L-1，棕色玻璃瓶保存?！狿HOS酶底物：稱取5.12mg4-甲基傘形酮磷酸酯溶于80mL無菌去離子水中，再將其轉(zhuǎn)移至100mL棕色容量瓶中，用無菌去離子水定容至100mL，濃度為200μmol·L-1，棕色玻璃瓶保存。5.3淬火標(biāo)準(zhǔn)曲線配制稀釋1mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)物溶液（MUB或AMC）配制淬火標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度為0、2.5、5、10、25、50、100μmol/L（具體配制見附錄A）。6實(shí)驗(yàn)儀器電子天平，恒溫培養(yǎng)箱，加液器，磁力攪拌器，多功能酶標(biāo)儀。7具體操作7.1懸濁液制備堿性土壤緩沖液適用Tris緩沖液，酸性或中性土壤適用乙酸鈉緩沖液。稱取1.00g新鮮土壤，放在150mL容器中，加入125mL滅菌冷卻后的Tris緩沖液或乙酸鈉緩沖液，即為土壤懸濁液，封口加蓋，搖床180r/min震蕩2h。另根據(jù)HJ613和GB7172標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定土壤含水率。7.2樣品添加7.2.1測(cè)定樣品、空白樣品、淬火樣品震蕩結(jié)束后將裝有懸濁液的容器放置在磁力攪拌器上，加入磁珠，一邊攪拌一邊加入200μL土壤懸濁液至96微孔板中，每一個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，吸取5份，隨后依次加入50μL5種不同的酶底物溶液，即為測(cè)定樣品；吸取200μL土壤懸濁液至96微孔板中，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，加入50μL緩沖液，即為空白樣品；再吸取200μL土壤懸濁液至96微孔板中，分別加入50μL不同濃度的MUB或AMC標(biāo)曲溶液，每一個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，即為淬火樣品。7.2.2標(biāo)準(zhǔn)樣品、陰性樣品最后另取一個(gè)96微孔板加入200μL緩沖液，再加入50μL不同濃度的MUB或AMC標(biāo)曲溶液，標(biāo)準(zhǔn)曲線每個(gè)點(diǎn)8個(gè)重復(fù)，即為標(biāo)準(zhǔn)樣品；再吸取200μL緩沖液，再加入50μL不同的酶底物溶液，即為陰性樣品。7.3樣品培養(yǎng)懸濁液和酶底物全部加入完成后，將96微孔板置于25℃黑暗條件下培養(yǎng)4h，培養(yǎng)結(jié)束后在每個(gè)孔中加入10μL1M的NaOH溶液終止反應(yīng)。注：NaOH溶液不可提前注入等待上機(jī)，需注入一板立即測(cè)定一板4T/JAASS144—20247.4樣品測(cè)定用無菌紙擦凈酶標(biāo)板底部，去除凝結(jié)物防止影響讀數(shù)。在多功能酶標(biāo)儀上，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)365nm和檢測(cè)波長(zhǎng)450nm，測(cè)定每孔的熒光值。8結(jié)果計(jì)算8.1土壤淬火曲線校正系數(shù)土壤中的某些成分如有機(jī)質(zhì)中的胡敏酸導(dǎo)致熒光類物質(zhì)的淬滅，在計(jì)算的過程中，通過引入校正系數(shù)，將被土壤淬滅的產(chǎn)生的熒光類物質(zhì)重新考慮進(jìn)來，MUB或AMC淬火標(biāo)準(zhǔn)曲線按公式（1）計(jì)算：式中：q——土壤淬火曲線校正系數(shù)；kh——土壤淬火樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；k——土壤標(biāo)準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。8.2熒光釋放系數(shù)將讀取的熒光值換算為濃度(μmol）的換算系數(shù)，按公式（2）計(jì)算：式中：e——熒光釋放系數(shù)；kh——土壤淬火樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；Vh——土壤淬火樣品中每個(gè)孔加入MUB或AMC的體積（mL）。8.3校正后樣品熒光值經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)曲線校正后的測(cè)定樣品孔熒光值，按公式（3）計(jì)算：F=(f-fb)/q-cs····················································(3)式中：F——校正后的樣品熒光值；f——酶標(biāo)儀讀取的測(cè)定樣品微孔熒光值；fb——酶標(biāo)儀讀取的空白樣品微孔熒光值；q——土壤淬火曲線校正系數(shù)；cs——酶標(biāo)儀讀取的陰性樣品微孔熒光值。8.4土壤酶活性最終所得的土壤樣品酶活性，按公式（4）計(jì)算：Ab=FV/(eV1tm)··················································(4)式中：Ab——土壤樣品酶活性(μmolg-