添加劑預(yù)混合飼料中氯化膽堿的測定 征求意見稿

1GB/T17481—202×添加劑預(yù)混合飼料中氯化膽堿的測定本文件描述了添加劑預(yù)混合飼料中氯化膽堿的離子色譜和雷氏鹽分光光度測定方法。本文件適用于維生素預(yù)混合飼料和復(fù)合預(yù)混合飼料中氯化膽堿的測定。本文件離子色譜法檢出限為20mg/kg、定量限為50mg/kg，雷氏鹽分光光度法檢出限為1000mg/kg、定量限為2500mg/kg。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T20195動物飼料試樣的制備3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4離子色譜法（仲裁法）4.1原理試樣中的氯化膽堿用水或三氯甲烷-甲醇溶液提取，陽離子交換色譜-電導(dǎo)檢測器檢測，外標(biāo)法定量。4.2試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。4.2.1水：GB/T6682，一級。4.2.2三氯甲烷-甲醇溶液：量取90mL三氯甲烷和900mL甲醇，混勻。4.2.3流動相：稱取0.336g甲磺酸于1000mL燒杯中，加水800mL，轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，用水定容，混勻。4.2.4標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（2mg/mL稱取200mg氯化膽堿標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：67-48-1，純度≥99.5精確至0.00001g）于100mL容量瓶中，用水溶解、定容，混勻。2℃~8℃保存，有效期3個月。4.2.5標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（100μg/mL）：準(zhǔn)確移取5mL標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（4.2.4）于100mL容量瓶中，用水稀釋、定容，混勻。臨用現(xiàn)配。2GB/T17481-202×4.2.6標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：分別準(zhǔn)確移取適量標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（4.2.5），用水稀釋、定容，混勻，制備成質(zhì)量濃度分別為1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。臨用現(xiàn)配。4.2.7IC-RP柱：1CC。根據(jù)使用說明書活化，需棄去前3mL濾液。4.2.8濾膜：0.45μm，水系。4.3儀器設(shè)備4.3.1離子色譜儀：配電導(dǎo)檢測器。4.3.2分析天平：精度0.0001g、0.00001g。4.3.3恒溫水浴鍋：控溫精度±1℃。4.3.4超聲清洗器。4.3.5渦旋混合器。4.4樣品按GB/T20195制備試樣，至少200g，粉碎使其全部通過0.425mm孔徑的分析篩，充分混勻，裝入密閉容器中，避光低溫保存?zhèn)溆谩?.5試驗步驟4.5.1試樣溶液制備4.5.1.1維生素預(yù)混合飼料平行做兩份試驗。稱取經(jīng)105℃干燥2h的試樣1g~2g（含氯化膽堿0.01g~0.2g，精確至0.0001g），置于100mL容量瓶中，加約60mL水，搖勻，在70℃水浴鍋中加熱15min，超聲10min，冷卻至室溫，用水定容（V搖勻，過濾。準(zhǔn)確移取5.0mL濾液（V1）于100mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，混勻，過經(jīng)活化的IC-RP柱（4.2.7）和微孔濾膜（4.2.8），備用。4.5.1.2維生素預(yù)混合飼料和復(fù)合預(yù)混合飼料平行做兩份試驗。稱取經(jīng)105℃干燥2h的試樣1g~2g（含氯化膽堿0.01g~0.2g，精確至0.0001g加入適量EDTA二鈉（推薦1~2g）置于100mL容量瓶中，加約60mL三氯甲烷-甲醇溶液，搖勻，超聲提取30min，每10min搖勻1次，冷卻至室溫，用三氯甲烷-甲醇溶液定容至刻度（V），搖勻，過濾。準(zhǔn)確移取5.0mL溶液（V1）于40℃氮氣吹干，準(zhǔn)確加入5mL水，渦旋混勻，過經(jīng)活化的IC-RP柱（4.2.7）和微孔濾膜（4.2.8），備用。4.5.2離子色譜參考條件離子色譜參考條件如下：a）色譜柱：弱酸型陽離子交換柱，柱長250mm，內(nèi)徑4.0mm，粒徑8.5μm?；蛐阅芟喈?dāng)者；b）柱溫：30℃;c）進(jìn)樣量：10μL；d）流動相：甲磺酸溶液（4.2.3），3.5mmol/L。4.5.3測定3GB/T17481—202×4.5.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液測定在儀器的最佳條件下，分別取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（4.2.6）和試樣溶液（4.5.1）上機測定。氯化膽堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子色譜圖參見附錄A。4.5.3.2定性以保留時間定性，試樣溶液中氯化膽堿保留時間應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（質(zhì)量濃度相當(dāng)）中氯化膽堿的保留時間一致，其相對偏差在±2.5％之內(nèi)。4.5.3.3定量以氯化膽堿的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（響應(yīng)值）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.99。試樣溶液中氯化膽堿的質(zhì)量濃度應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。如超出范圍，應(yīng)將試樣溶液用水稀釋后重新測定。單點校準(zhǔn)定量時，試樣溶液中待測物的質(zhì)量濃度與標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度相差不超過30%。目標(biāo)峰與相鄰峰之間的分離度應(yīng)大于1.5。4.6試驗數(shù)據(jù)處理試樣中氯化膽堿的含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)w計，數(shù)值以毫克每千克（mg/kg）表示。多點校準(zhǔn)按公式（1）計算；單點校準(zhǔn)按公式（2）計算：…………………式中：ρ——從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的試樣溶液中氯化膽堿的濃度，單位為微克每毫升(μg/mLV——試樣溶液體積，單位為毫升（mL）；f——試樣溶液稀釋倍數(shù)；1000——換算系數(shù)；m——試樣質(zhì)量，單位為克（g）?！街校篈——試樣溶液中氯化膽堿色譜峰面積；ρS——標(biāo)準(zhǔn)溶液氯化膽堿濃度，單位為微克每毫升(μg/mLV——試樣溶液體積，單位為毫升（mL）；f——試樣溶液稀釋倍數(shù)；1000——換算系數(shù)；AS——標(biāo)準(zhǔn)溶液中氯化膽堿的峰面積；m——試樣質(zhì)量，單位為克（g）。測定結(jié)果以平行測定的算術(shù)平均值表示，保留3位有效數(shù)字。4.7精密度在重復(fù)性條件下，兩次獨立測定結(jié)果與其算術(shù)平均值的絕對差值不大于該算術(shù)平均值的10%。4GB/T17481-202×5雷氏鹽分光光度法5.1原理用甲醇-三氯甲烷混合溶劑提取試樣中的氯化膽堿，將溶劑蒸干后用水溶解殘渣，再在低溫下加入雷氏鹽生成氯化膽堿雷氏鹽的結(jié)晶，過濾出結(jié)晶，用丙酮溶解，定容。將其丙酮溶液在波長525nm下進(jìn)行分光光度測定。5.2試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。5.2.1水：GB/T6682，二級。5.2.3丙酮。5.2.4三氯甲烷-甲醇溶液（10+1）：量取90mL三氯甲烷和900mL甲醇，混勻。5.2.5雷氏鹽（二氨基四硫代氰酸鉻銨，[NH4Cr(NH3)2(SCN)4]）甲醇溶液（40g/L）：稱取4g雷氏鹽，用甲醇溶解、定容至100mL，混勻，2℃~8℃保存。5.2.6標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（1000μg／mL）：稱取100mg氯化膽堿標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：67-48-1，純度≥99.5%)（精確至0.00001g置于100mL容量瓶中，用水溶解、定容，混勻。2℃~8℃保存，有效期1個月。5.2.7定性濾紙：慢速。5.3儀器設(shè)備5.3.1分光光度計：配1.0cm比色皿，可在525nm下測定吸光度。5.3.2分析天平：精度0.00001g、0.0001g。5.3.3往復(fù)式振蕩器：不低于120次/min。5.3.4恒溫水浴鍋：控溫精度±1℃。5.3.5離心機。5.3.6坩堝式過濾器：孔徑4μm～7μm。5.4樣品5.5試驗步驟5.5.1提取平行做兩份試驗。稱取試樣5g（含氯化膽堿約0.04g～0.4g）于具塞錐形瓶中（精確至0.0001g準(zhǔn)確加入三氯甲烷-甲醇溶液（4.2.4）100mL，加塞，置于振蕩器上，120次/min振蕩30min，用定性濾紙（5.2.7）過濾，得試樣提取溶液。5.5.2氯化膽堿雷氏鹽生成和溶出準(zhǔn)確移取5.00mL試樣提取溶液（5.5.1）于100mL高形燒杯中，在50℃水浴上蒸發(fā)至干，加水5GB/T17481—202×40mL使殘渣溶解，再在冰浴中冷卻至5℃以下，加3mL雷氏鹽溶液（5.2.5間斷攪拌反應(yīng)30min，得到氯化膽堿雷氏鹽結(jié)晶。將生成的結(jié)晶轉(zhuǎn)入坩堝式過濾器中真空抽濾，燒杯用水洗凈，洗液一并抽濾。濾畢，結(jié)晶用3×5mL水洗，再用5×1mL甲醇洗，抽干，向過濾器中加入丙酮，使結(jié)晶溶解，轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中，用丙酮洗凈過濾器，洗液一并轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中，加丙酮至刻度，混勻，備用。5.5.4標(biāo)準(zhǔn)系列溶液制備準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（5.2.6）5.00mL、10.00mL、15.00mL、20.00mL，分別置于100mL高形燒杯中，加水40mL，以下按5.5.2中“再在冰浴中冷卻到5℃以下”及之后的操作，制備成標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。5.5.3標(biāo)準(zhǔn)系列溶液工作曲線繪制和試樣測定準(zhǔn)確移取5.0mL標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（5.5.4）、5.0mL試樣溶液（5.5.2），分別置于10mL離心管中，3000r/min離心5min，取上層清液，以丙酮作參比，用1.0cm比色皿在525nm波長下測定標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和試樣溶液的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液工作曲線，在工作曲線上查得試樣中氯化膽堿的質(zhì)量。5.6試驗數(shù)據(jù)處理試樣中氯化膽堿的含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)w計，數(shù)值以毫克每千克（mg/kg）表示。按式（3）計算：w=………………（3）式中