大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的置備與質(zhì)粒轉(zhuǎn)化課件

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化

二.實(shí)驗(yàn)原理感受態(tài)細(xì)胞(Competentcells):受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能使許多有外源DNA的載體分子通過的感受態(tài)細(xì)胞(competentcell)。

大腸桿菌轉(zhuǎn)化的方法：化學(xué)法：使用化學(xué)試劑（如CaCl2）制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過熱擊處理將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞；電轉(zhuǎn)化法：通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。轉(zhuǎn)化子的篩選：利用導(dǎo)入的DNA上的選擇性標(biāo)記，區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子。選擇性標(biāo)記主要有兩類： 營養(yǎng)篩選標(biāo)記 抗性篩選標(biāo)記三．實(shí)驗(yàn)方法

1．挑取大腸桿菌DH5α單菌落，接于5mLLB液體培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)過夜2．以1:50比例將1ml菌液轉(zhuǎn)移到新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)1.5－2hr左右，使A600在0.4－0.5左右3．將培養(yǎng)液4ml轉(zhuǎn)移到5ml離心管中，4℃，2000g離心3min4．棄上清，加0.5mL用冰預(yù)冷的0.1MCaCl2溶液，輕輕吹打或搖動(dòng)混勻細(xì)胞注意：加入CaCl2動(dòng)作需輕柔，勿劇烈震蕩，并且盡量使細(xì)胞處于低溫中5．冰上放置20min，2000g離心2min

6．棄上清，加0.1ml預(yù)冷的0.1MCaCl2溶液，輕輕吹打或搖動(dòng)混勻細(xì)胞，即得感受態(tài)細(xì)胞注意：離心后觀察沉淀，如果出現(xiàn)中間空心的沉淀說明操作正常7．將取0.1ml感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，加2μl質(zhì)粒，混勻，冰上放置30min8．42℃水浴90秒,在冰上放置2min9．加入0.5ml新鮮LB培養(yǎng)基，37℃，200rpm振蕩約30min－45min（注：轉(zhuǎn)純質(zhì)?？墒÷?，轉(zhuǎn)連接產(chǎn)物需進(jìn)行）10.取100μl涂布到含有氨芐青霉素的平板上,加X-gal/IPTG各3μL

11．倒置平皿，37℃培養(yǎng)12~16h每個(gè)平板大約20ml的培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基用CaCl2法制備的感受態(tài)細(xì)胞，可使每微克超螺旋質(zhì)粒DNA產(chǎn)生5106-2