DB31∕T 1287-2021 實(shí)驗(yàn)東方田鼠病原學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)

實(shí)驗(yàn)東方田鼠病原學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)上海市市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布I 1 1 14縮略語 2 2 36.1外觀要求 36.2病原學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目 37檢測(cè)程序 3 49監(jiān)測(cè)規(guī)則 49.1檢測(cè)頻率 49.2采樣要求 49.3樣本采集 5 5 5附錄A(規(guī)范性)實(shí)驗(yàn)東方田鼠病原體PCR檢測(cè)方法 6Ⅱ本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)提出并組織實(shí)施。本文件由上海市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本文件起草單位：上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心、上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心。本文件主要起草人：謝建蕓、魏曉鋒、馮潔、熊煒、林金杏、薛俊欣、王勝昌、高誠。本文件為首次發(fā)布。1實(shí)驗(yàn)東方田鼠病原學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)本文件規(guī)定了實(shí)驗(yàn)東方田鼠病原學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)，包括實(shí)驗(yàn)東方田鼠病原2規(guī)范性引用文件僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本GB14922.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物寄生蟲學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)GB14922.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)GB/T14926.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物沙門菌檢測(cè)方法GB/T14926.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚病原真菌檢測(cè)方法GB/T14926.6實(shí)驗(yàn)動(dòng)物支氣管鮑特桿菌檢測(cè)方法GB/T14926.12實(shí)驗(yàn)動(dòng)物嗜肺巴斯德桿菌檢測(cè)方法GB/T14926.14實(shí)驗(yàn)動(dòng)物金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法GB/T14926.41實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無菌動(dòng)物生活環(huán)境及糞便標(biāo)本的檢測(cè)方法GB/T14926.42實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌學(xué)檢測(cè)標(biāo)本采集GB/T14926.43實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌學(xué)檢測(cè)染色法、培養(yǎng)基和試劑GB/T14926.52實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫熒光試驗(yàn)GB/T14926.53實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血凝實(shí)驗(yàn)GB/T18448.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體外寄生蟲檢測(cè)方法GB/T18448.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物弓形蟲檢測(cè)方法GB/T18448.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物兔腦原蟲檢測(cè)方法GB/T18448.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物卡氏肺孢子蟲檢測(cè)方法GB/T18448.6實(shí)驗(yàn)動(dòng)物蠕蟲檢測(cè)方法GB/T18448.10實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腸道鞭毛蟲和纖毛蟲檢測(cè)方法3術(shù)語和定義實(shí)驗(yàn)東方田鼠laboratoryreed普通級(jí)東方田鼠conventional(CV)reed2除普通級(jí)東方田鼠應(yīng)排除的病原外，不攜帶對(duì)實(shí)驗(yàn)東方田鼠健康有較大危害、主要潛在感染或條PCR:聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction)東方田鼠等級(jí)無菌級(jí)普通級(jí)沙門菌Salmonellaspp.●皮膚病原真菌PathogenicdermalfungiO●漢坦病毒Hantavirus(HV)●體外寄生蟲(節(jié)肢動(dòng)物)Ectoparasites●弓形蟲Toxoplasmagondii●無特定病原體級(jí)支氣管鮑特桿菌BordetellabroncO●●●金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus●仙臺(tái)病毒SendaiVirus(SV)●小鼠肺炎病毒PneumoniaVirusofMice(PVM)●呼腸孤病毒Ⅲ型ReovirustypeIⅢ(Reo-3)●全部蠕蟲AllHelminths●卡氏肺孢子蟲PneumocystiscariniiO兔腦原蟲EncephalitozooncuniculiO鞭毛蟲Flagellates●纖毛蟲Cilliates●●36.1外觀要求外觀健康、行為體征正常。6.2病原學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目東方田鼠病原學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目見表1。7檢測(cè)程序?qū)κ軝z實(shí)驗(yàn)東方田鼠應(yīng)在當(dāng)日按細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲要求聯(lián)合取樣檢測(cè)，檢測(cè)程序見圖1。48檢測(cè)方法病原檢測(cè)項(xiàng)目沙門菌皮膚病原真菌按照GB/T14926.6實(shí)驗(yàn)動(dòng)物支嗜肺巴斯德桿菌按照GB/T14926.12實(shí)驗(yàn)動(dòng)物嗜肺巴斯德桿菌金黃色葡萄球菌按照GB/T14926.14實(shí)驗(yàn)動(dòng)物金黃色葡萄球菌弓形蟲按照GB/T18448.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物弓形蟲檢測(cè)方法兔腦原蟲按照GB/T18448.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物兔腦原蟲檢測(cè)方法卡氏肺孢子蟲按照GB/T18448.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物卡氏肺孢子蟲按照GB/T18448.6實(shí)驗(yàn)動(dòng)物蠕蟲檢測(cè)方法按照GB/T18448.10實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腸道鞭毛纖毛蟲按照GB/T18448.10實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腸道鞭毛小鼠肺炎病毒呼腸孤病毒Ⅲ型按照GB/T14926.41實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無菌動(dòng)物生9監(jiān)測(cè)規(guī)則每3個(gè)月至少檢測(cè)一次。9.2采樣要求選擇8周齡以上實(shí)驗(yàn)東方田鼠用于檢測(cè)。5同一實(shí)驗(yàn)東方田鼠生產(chǎn)繁殖單元或種群，根據(jù)種群規(guī)模確定取樣數(shù)量，具體見表表3實(shí)驗(yàn)東方田鼠不同繁殖單元或種群取樣數(shù)量群體數(shù)量(只)取樣數(shù)量(只，雌雄各半)小于100不少于6不少于10大于500不少于20a)對(duì)于寄居于呼吸道的病原體，應(yīng)采集氣管分泌物或氣b)定位于腸道的病原體，應(yīng)采集回盲部?jī)?nèi)容物或糞便；c)定植于皮膚的病原體，應(yīng)采集皮9.3.2采樣方法a)血液、皮膚、氣管分泌物、回盲部?jī)?nèi)容物、糞便：按GB/T14926.42進(jìn)行；部鼠毛，用酒精消毒皮膚后解剖，暴露胸腔和腹腔，剪取相應(yīng)器樣品應(yīng)保持新鮮，采樣后原則上應(yīng)立即進(jìn)行細(xì)菌接種或提取核酸用于病原體的PCR擴(kuò)增。不能立即接種的組織、拭子樣品等須置于無菌試管2-8℃保存或存于運(yùn)輸培養(yǎng)基中，24h內(nèi)完成接種；不能立即提取核酸的標(biāo)本，在2～8℃條件下保存不應(yīng)超過24h,超過24h保存的用于提取DNA的樣品應(yīng)置于-20℃以下冰箱，用于提取RNA的樣品應(yīng)置于-80℃以下冰箱，于2周內(nèi)完成核酸提取。在被檢樣品中，如有1個(gè)樣品1項(xiàng)指標(biāo)不符合該等級(jí)要求，則判定該批次實(shí)驗(yàn)東方田鼠不合格；根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，出具檢測(cè)報(bào)告。報(bào)告應(yīng)包括但不限于：被檢動(dòng)物批次、檢6附錄A(規(guī)范性)實(shí)驗(yàn)東方田鼠病原體PCR檢測(cè)方法A.1材料擴(kuò)增引物序列見表A.1,引物加滅菌去離子水配制成10μmol/L,-20℃以下保存。表A.1PCR引物序列、產(chǎn)物長(zhǎng)度、擴(kuò)增部位及擴(kuò)增條件引物序列P1:5'-AACAGGATTAGATAP2:5'-TGACGGGCGGTGTGTA容物95℃變性30s,55℃30s,20個(gè)循環(huán)P3:5'-GTGCTAGGTGTTGGGP4:5'-TACTTTACGTAGCCTGT95℃變性30s,55℃30s,20個(gè)循環(huán)P1:5'-AGCGTTTGCTTCACTTTP2:5'-GGGCATTTCCTCCCTAA95℃變性30s,55℃30s,35個(gè)循環(huán)絡(luò)叢腦膜炎P1:5'-AGTGATGAGTCCTTCACATCP2:5'-GGATCCTAGGCATTTGATTG30s,35個(gè)循環(huán)P1:5'-ACGAGGGGCAGCTTGTGATAGP2:5'-GACATCCTCATATGAGCTGTCP1:5'-CCACATTGGTCTCGTGTCAGATTC5'-CATCATTCACGAAATC呼腸孤病毒Ⅲ型P1:5'-CAGTCGACACATTTGTGP2:5'-GCGTACTGACGTGGAT小鼠肺炎病毒P1:5'-GGATCTTTCTAGTCCTTCTGP2:5'-CATCTCTAATCAATGCAATCTPCR儀、高速離心機(jī)、電泳儀、紫外分光光度A.2方法A.2.1采樣及標(biāo)本處理7心管中，加入1mLPBS(pH7.4)充分勻漿，備用。A.2.2樣品保存不能立即提取核酸的標(biāo)本，在2~8℃條件下保存不應(yīng)超過24h,超過24h保存的用于提取DNA的樣品應(yīng)置于-20℃以下冰箱，用于提取RNA的樣品應(yīng)置于-80℃以下冰箱，于2周內(nèi)完成核酸提取。A.2.2核酸提取核酸提取按說明書進(jìn)行。核酸樣品經(jīng)紫外分光光度OD260/280比值在1.6～1.8之間為合格。制備好的核酸應(yīng)盡快進(jìn)行下一步PCR反應(yīng)，若暫時(shí)不能進(jìn)行PCR反應(yīng)，DNA樣品應(yīng)置于-20℃以下冰箱保存，RNA樣品應(yīng)置于-80℃以下冰箱保存，2周內(nèi)完成PCR擴(kuò)增。A.2.3逆轉(zhuǎn)錄(僅限RNA病毒適用)RNA逆轉(zhuǎn)錄體系見表A.2。反應(yīng)體系的配制應(yīng)在冰浴上進(jìn)行，反應(yīng)條件為：37℃反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)15min,85℃反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)5s。反應(yīng)產(chǎn)物即為cDNA,應(yīng)立即進(jìn)行下一步PCR反應(yīng)，若不能立即進(jìn)行PCR,cDNA樣品應(yīng)置于-20℃以下冰箱保存。表A.2RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系用量(μL)2PrimeScriptRTEnzymeMixIRandomPrimer6mers(100μmol4總體積A.2.4PCR體系PCR反應(yīng)體系見表A.3。反應(yīng)體系的配制應(yīng)在冰浴上進(jìn)行，每次反應(yīng)同時(shí)應(yīng)設(shè)陽性對(duì)照、陰性對(duì)表A.3PCR反應(yīng)體系用量(μL)2×TaqPlusMasterMix(Dye118總體積A.2.5反應(yīng)程序895℃預(yù)變性5min;PCR反應(yīng)條件及循環(huán)