生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)

碘價(jià)的測(cè)定(Hanus)法三、實(shí)驗(yàn)原理在適當(dāng)條件下，不飽和脂肪酸的不飽和鍵能與碘、溴或氯起加成反應(yīng)。脂肪分子中如含有不飽和脂?；?，即能吸收碘。100g脂肪所吸收碘的克數(shù)稱為碘價(jià)。碘價(jià)的高低表示脂肪不飽和度的大小。由于碘與脂肪的加成作用很慢，故于Hanus試劑中加入適量溴，使產(chǎn)生溴化碘，再與脂肪作用。將一定量(過(guò)量)的溴化碘(Hanus試劑)與脂肪作用后，測(cè)定溴化碘剩余量，即可求得脂肪之碘價(jià)，本法的反應(yīng)如下：I2+Br2-->2IBr(Hanus試劑)IBr+一CH=CH—-->—CHI—CHBr—KI+CH3COOH-->HI+CH3COOKHI+IBr-->HBr+I2I2+2Na2S2O3-->2Nal+Na2S4O6(滴定)四、實(shí)驗(yàn)試劑及材料儀器1、Hanus試劑：溶13.20升華碘于1000ml冰醋酸(99.5％)內(nèi)，溶時(shí)可將冰醋酸分次加入，并置水浴中加熱助溶，冷后，加適當(dāng)之溴(約3ml)使鹵素值增高一倍。此溶液儲(chǔ)于棕色瓶中。2、15％碘化鉀溶液稱取150g碘化鉀溶于水，稀釋至1000ml。3、標(biāo)準(zhǔn)硫代硫酸鈉溶液(約0.1N)25g純硫代硫酸鈉晶體Na2S2O3．5H20溶（C·P以上規(guī)格)于經(jīng)煮沸后冷卻的蒸餾水中，稀釋至1000ml，此溶液中可加入少量(約50mg)Na2CO3，數(shù)日后標(biāo)化。標(biāo)化方法：精密稱取在1200C干燥至恒重的基準(zhǔn)重鉻酸鉀0.15—0.20g2份，分別置于兩個(gè)500ml碘瓶中，各加水約30ml使溶解，加入固體碘化鉀2.0g及6NHCll0ml：混勻，塞好，置暗處3分鐘，然后加入水200ml稀釋，用Na2S203滴定，當(dāng)溶液由棕變黃后，加淀粉液3ml，繼續(xù)滴定至呈淡綠色為止，計(jì)算Na2S2O3溶液的準(zhǔn)確濃度。滴定的反應(yīng)：K2Cr2O7+6I-+14H+—>2K++2Cr3++3I2+7H2OI2+2S2O2-—>2I-+S4O2-4、1％淀粉液五、實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確稱取0.2g脂肪，置于碘瓶(圖5中)，加10ml氯仿作溶劑，待脂肪溶解后，加入Hanus試劑20ml，(注意勿使碘液沾在瓶頸部)，塞好碘瓶，輕輕搖動(dòng)，搖動(dòng)時(shí)亦應(yīng)避免溶液濺至瓶頸部及塞上，混勻后，置暗處(或用黑布包裹碘瓶)30分鐘，于另一碘瓶中置同量試劑，但不加脂肪，作空白試驗(yàn)。60分鐘后，先注少量15％碘化鉀溶液于碘瓶口邊上，將玻塞稍稍打開(kāi)，使碘化鉀溶液流入瓶?jī)?nèi)，并繼續(xù)由瓶口邊緣加入碘化鉀溶液，共加20ml，再加水100ml，混勻，兩個(gè)樣品一起加入，終止反應(yīng)。隨即用標(biāo)準(zhǔn)硫代硫酸鈉溶液滴定。初加硫代硫酸鈉溶液時(shí)可較快，俟瓶?jī)?nèi)液體呈淡黃色時(shí)。加淀粉液1ml，繼續(xù)滴定，滴定將近終點(diǎn)時(shí)(藍(lán)色已淡)，可加塞振蕩，使與溶于氯仿中之碘完全作用，繼續(xù)滴定至藍(lán)色恰恰消失為止，記錄所用硫代硫酸鈉溶液量，用同法滴定空白管。按下式計(jì)算碘價(jià)：碘價(jià)=式中B：滴定空白所耗Na2S2O3溶液毫升數(shù)；S：滴定樣品所耗Na2S2O3溶液毫升N：Na2S2O3溶液的當(dāng)量濃度。七、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1、油脂加入Hanus試劑后，要將碘瓶的塞子塞好，防止碘揮發(fā)，同時(shí)在塞子的周圍滴上幾滴KI，以便將塞子密封，碘瓶一定要放在暗處。2、在向碘瓶中加KI和水時(shí)，一定要先加在塞子的周圍，然后打開(kāi)塞子，使其進(jìn)入碘瓶中。3、在進(jìn)行Na2S2O3滴定時(shí)，開(kāi)始不要加淀粉指示劑，當(dāng)?shù)味ǖ筋伾優(yōu)闇\黃色是再加淀粉，當(dāng)?shù)味斓浇K點(diǎn)時(shí)，要用力搖碘瓶中的溶液，以便溶解在氯肪中的碘重新溶解在溶液中，否則滴定結(jié)果不夠準(zhǔn)確。4、本實(shí)驗(yàn)需要做樣品的兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，一個(gè)空白實(shí)驗(yàn)。五、思考題1.測(cè)定碘值有何意義？在一定條件下，每100g脂肪所吸收的碘的克數(shù)稱為該脂肪的“碘值”。碘值越高，表明不飽和脂肪酸的含量越高，它是鑒定和鑒別油脂的一個(gè)重要常數(shù)。2.加入IBr后，為何要在暗處放置？在進(jìn)行碘值測(cè)定過(guò)程中需要將其放在暗處，目的是為了防止IBr見(jiàn)光分解。3.滴定過(guò)程中，為何淀粉溶液不能過(guò)早加入？淀粉的螺旋腔可以結(jié)合碘，從而使滴定結(jié)果變的不準(zhǔn)確。酪蛋白的制備二、原理牛乳中的主要的蛋白質(zhì)是酪蛋白，含量約為35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白質(zhì)的混合物，等電點(diǎn)為4.7。利用等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低的原理，將牛乳的pH調(diào)至4.7時(shí)，酪蛋白就沉淀出來(lái)。用乙醇洗滌沉淀物，除去脂類雜質(zhì)后便可得到純酪蛋白。三、材料、試劑與器具（一）材料：新鮮牛奶（一）試劑1、95%乙醇1200mL2、無(wú)水乙醚1200mL3、0.2mol/LpH4.7醋酸——醋酸鈉緩沖液100ml先配A液與B液A液：0.2mol/L醋酸鈉溶液稱NaAC·3H2O54.44g，定容至2000ml。B液：0.2mol/L醋酸溶液，稱優(yōu)純醋酸（含量大于99.8%）12.0g定容至1000ml。取A液1770ml，B液1230ml混合即得Ph4.7的醋酸——醋酸鈉緩沖液3000ml。4、乙醇——乙醚混合液乙醇：乙醚=1：1（V/V）（二）器具1、離心機(jī)2、抽濾裝置3、精密pH試紙或酸度計(jì)4、電爐5、燒杯6、溫度計(jì)四、操作步驟（一）酪蛋白的粗提100mL牛奶加熱至40℃。在攪拌下慢慢加入預(yù)熱至40℃、pH4.7的醋酸緩沖液100mL.用精密pH試紙或酸度計(jì)調(diào)pH至4.7。將上述懸浮液冷卻至室溫。離心15分鐘（3000r/min）。棄去清液，得酪蛋白粗制品。（二）酪蛋白的純化1、用水洗滌沉淀3次，離心10分鐘（3000r/min），棄去上清液。2、在沉淀中加入30mL乙醇，攪拌片刻，將全部懸濁液轉(zhuǎn)移至布氏漏斗中抽濾。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。3、將沉淀攤開(kāi)在表面上，風(fēng)干；得酪蛋白純品。（三）準(zhǔn)確稱重，計(jì)算含量和得率。含量：酪蛋白g/100mL牛乳（g%）獲得率=制備含量/理論含量

式中理論含量為3.5g/100mL牛乳。五、注意事項(xiàng)1、由于本法是應(yīng)用等電點(diǎn)沉淀法來(lái)制備蛋白質(zhì)，故調(diào)節(jié)牛奶液的等電點(diǎn)一定要準(zhǔn)確。最好用酸度計(jì)測(cè)定。2、精制過(guò)程用乙醚是揮發(fā)性、有毒的有機(jī)溶劑，最好在通風(fēng)櫥內(nèi)操作。3、目前市面上出售的牛奶是經(jīng)加工的奶制品，不是純凈牛奶，所以計(jì)算時(shí)應(yīng)按產(chǎn)品的相應(yīng)指標(biāo)計(jì)算。七、思考題1、操作方法中的第二步能否用大量水洗滌？為什么？2、用乙醇、乙醇——乙醚混合液及乙醚洗滌的目的是什么？能否顛倒？答：不能，經(jīng)過(guò)這個(gè)次序以后，結(jié)晶吸附的溶劑改為乙醚，乙醚沸點(diǎn)低，容易揮散干凈，得到純的潔凈，乙醇和乙醚的溶解性能差很遠(yuǎn)，乙醇實(shí)際上介于水和有機(jī)溶劑之間，而乙醚是完全的有機(jī)溶劑，他們各自去洗滌各自能溶解的物質(zhì)，從無(wú)機(jī)（水）到有機(jī)（乙醚），最后用乙醚是因?yàn)樗鼤?huì)很快揮發(fā)掉，不留痕跡，可得到純粹的蛋白質(zhì)。用正交法測(cè)定幾種因素對(duì)酶活力的影響一．實(shí)驗(yàn)原理酶反應(yīng)受到多種因素的影響，如底物濃度、酶濃度、溫度pH值、激活劑和抑制劑等都能影響酶反應(yīng)速度。這種多因素的試驗(yàn)可通過(guò)正交法即用一特制的表格——正交表來(lái)安排試驗(yàn)，計(jì)算和分析試驗(yàn)結(jié)果。這樣就能通過(guò)少量試驗(yàn)取得較好的效果。實(shí)踐證明正交法是一個(gè)多、快、好、省的方法，目前已廣泛用于工、農(nóng)、醫(yī)藥業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)實(shí)驗(yàn)中。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用正交法測(cè)定底物濃度、酶濃度、溫度pH值達(dá)四個(gè)因素對(duì)酶活性的影響，并求得在什么樣的底物濃度、酶濃度、溫度和PH值時(shí)酶的活性最大。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)初步掌握正交法的使用。二．試劑1．2％血紅蛋白液：于20ml蒸餾水中加入血紅蛋白2.2g；尿素36g，lmol/LNaOH溶液8ml，室溫放1小時(shí)，使蛋白變性。如有不溶物，可過(guò)濾除去。再加0.2mol/LNaH2PO4溶液至110ml及尿素4g，調(diào)節(jié)溶液PH達(dá)7.6左右。2．15％三氯醋酸溶液：15g三氯醋酸溶于蒸餾水，并稀釋至100ml。3．牛胰蛋白水解酶液：3mg牛胰蛋白水解酶冷凍干粉，溶于10ml蒸餾水。4．0.lmol/LpH7、8、9巴比妥緩沖液5．Folin-酚試劑：基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中Folin-酚試劑法測(cè)定蛋白濃度實(shí)驗(yàn)三．操作步驟1．實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：本實(shí)驗(yàn)取四個(gè)因素，即底物濃度[S]、酶濃度[E]、溫度、pH值。每個(gè)因素選三個(gè)水平（水平即在因素的允許變化范圍內(nèi)，要進(jìn)行試驗(yàn)的“點(diǎn)”）。因素水平（S）（E）溫度pH10.2ml0.2ml37720.5ml0.5ml50830.8ml0.8ml609按一般方法，如對(duì)四個(gè)因素三個(gè)水平的各種搭配都要考慮；共需做34=81次試驗(yàn)，而用正交表只需做9次試驗(yàn)。選用L9表（L是正交表的代號(hào)，L右下角的數(shù)字表示試驗(yàn)次數(shù)）。L9表有兩個(gè)特性（1）每一列中“1”“2”“3”這三個(gè)數(shù)字都出現(xiàn)三次，即它門(mén)出現(xiàn)的次數(shù)是相同的。（2）每?jī)闪械臋M行組成的“數(shù)對(duì)”共有九個(gè)，九種不同的數(shù)對(duì)（1，1），（1，2），（1，3），（2，1），（2，2），（2，3），（3，1），（3，2），（3，3）各出現(xiàn)一次。在每一列中各個(gè)不同的數(shù)字出現(xiàn)的次數(shù)相同；每?jī)闪械臋M行組成的各種不同的“數(shù)對(duì)”出現(xiàn)的次數(shù)也都相同，這兩點(diǎn)就是正交表的特點(diǎn)，它保證了用正交表安排的試驗(yàn)計(jì)劃是均衡搭配的，因此，分析數(shù)據(jù)比較方便，結(jié)果比較可靠。2、試驗(yàn)安排：列號(hào)試驗(yàn)號(hào)1234111112122231333421235223162312731328321393321表中試驗(yàn)號(hào)共九個(gè)，表示要做九次試驗(yàn)，每次試驗(yàn)的條件如每一橫行所示。如做第一試驗(yàn)時(shí)（S）是0.2ml,(E)是0.2ml，溫度37℃，pH為7。第二個(gè)試驗(yàn)（S）是0.2ml,(E)是0.5ml.溫度50具體試驗(yàn)條件如表3-2所示試管號(hào)試劑（ml）1582493572%血紅蛋白液緩沖液PH72.6PH81.7PH91.7PH82.3PH92.3PH71.4PH92.0PH72.0PH82.037℃50℃60℃酶度37℃50℃60℃各管均加入15%三氯醋酸溶液2ml終止反應(yīng)。另取試管一支作非酶對(duì)照，即加2％血紅蛋白液0.5ml，緩沖液2.0ml，先加15％TCA2ml搖勻放置10分鐘后再加入酶液0.5ml。將上述酶促和非酶對(duì)照各管反應(yīng)液，室溫放置15分鐘，過(guò)濾，濾液留待Folin-酚法測(cè)定酶活力Folin-酚法測(cè)定酶活力：取濾液0.5ml，加入試劑A4ml，室溫放置10分鐘，再加試劑B0.5ml，30分鐘后于680nrn測(cè)光吸收。3、數(shù)據(jù)記錄及分析：實(shí)驗(yàn)做好后，把9個(gè)數(shù)據(jù)填入分析表的試驗(yàn)結(jié)果欄內(nèi)，按表中數(shù)據(jù)計(jì)算出各因素的一水平試驗(yàn)結(jié)果總和、二水平試驗(yàn)結(jié)果總和、三水下試驗(yàn)結(jié)果總和，再取平均值（各自被3除）。最后計(jì)算極差。極差是指這一列中最好與最壞的之差，從極差的大小就可以看出那個(gè)因素對(duì)酶活力影響最大，那個(gè)影響最小。找出在何種條件下酶活力最高。最后作一直觀分析的結(jié)論以A值（I/3，II/3，III/3）為縱坐標(biāo)，因素的水平數(shù)為橫坐標(biāo)作圖。列號(hào)試管號(hào)1（S）（ml）2（E）（ml）3溫度（℃）4PH值試驗(yàn)結(jié)果OD680110.210.213717210.220.525028310.230.836039420.510.225039520.520.536017620.530.813728730.810.236028830.820.513739930.830.825017Ⅰ（一水平試驗(yàn)結(jié)果總和）Ⅱ（二水平試驗(yàn)結(jié)果總和）Ⅲ（三水平試驗(yàn)結(jié)果總和）Ⅰ/3，Ⅱ/3，Ⅲ/3極差四．思考題1.正交試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)有哪些？①實(shí)用上按表格安排試驗(yàn)，使用方便；②布點(diǎn)均衡、試驗(yàn)次數(shù)較少；③特別在只有一兩個(gè)因素起主要作用時(shí)，正交試驗(yàn)法能保證主要因素的各種可能都不會(huì)漏掉。④正交試驗(yàn)法提供一種分析結(jié)果（包括交互作用）的方法，結(jié)果直觀易分析。且每個(gè)試驗(yàn)水平都重復(fù)相同次數(shù)，可以消除部分試驗(yàn)誤差的干擾；⑤因其具有正交性，易于分析出各因素的主效應(yīng)。2.配置試劑時(shí)為什么使蛋白質(zhì)變型？蛋白質(zhì)含量的定量測(cè)定——雙縮脲法具有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物皆有雙縮脲反應(yīng)。在堿性溶液中雙縮脲與銅離子結(jié)合形成復(fù)雜的紫好色復(fù)合物。而蛋白質(zhì)及多肽的肽鍵與雙縮脲的結(jié)構(gòu)類似，也能與Cu2+形成紫紅色絡(luò)合物，其最大光吸收在540nm處。其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量及氨基酸的組成無(wú)關(guān)，該法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度范圍適于1~10mg/mL。雙縮脲法常用于蛋白質(zhì)的快速測(cè)定。試劑1.雙縮脲試劑：取1.5g硫酸銅（CuSO4?5H2O）和6.0g的酒石酸鉀鈉（NaKC4H4O6·4H2O）溶于500mL蒸餾水中，在攪拌下加入300mL10%NaOH溶液，用水稀釋至1000mL。此試劑可長(zhǎng)期保存、備用。2.標(biāo)準(zhǔn)和待測(cè)蛋白質(zhì)溶液10mg/mL結(jié)晶牛血清白蛋白溶液或相同濃度的酪蛋白溶液（用0.05mol/L氫氧化鈉溶液配制）。作為標(biāo)準(zhǔn)用的蛋白質(zhì)要預(yù)先用微量克氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，根據(jù)其純度稱量，配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液。3.待測(cè)蛋白質(zhì)溶液人血清（稀釋10倍）。測(cè)試其他蛋白質(zhì)樣品應(yīng)稀釋適當(dāng)倍數(shù)，使其濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)試范圍內(nèi)。器材試管1.5×