DB13-T 6010-2024 番茄抗病種質(zhì)資源一年多代快速培育技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.20CCSB0513DB13/T6010—2024I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)本文件由河北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本文件起草單位：河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所、河北省農(nóng)業(yè)項(xiàng)目規(guī)劃中心。本文件主要起草人：李亞棟、吳志明、楊靖、田哲娟、康忱、高亢、高慧敏。DB13/T6010—20241本文件規(guī)定了番茄抗病種質(zhì)資源一年多代快速培育的前期準(zhǔn)備、幼胚成苗、分子標(biāo)記輔助選擇、種植期溫光調(diào)控等技術(shù)要求。本文件適用于番茄抗病種質(zhì)資源一年多代的快速培育。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件：KASP：競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR（KompetitiveAlleleSpecificPCR）SDS：十二烷基硫酸鈉（Sodiumdodecylsulfate）TYLCVD：黃化曲葉病毒?。═omatoyellowleafcurlvirusdisease）ToMVD：番茄花葉病毒?。═omatomosaicvirusdisease）TSWVD：番茄斑萎病毒病（Tomatospottedwiltvirusdisease）FCRR：鐮刀菌頸腐根腐?。‵usariumcrownandrootrotdisease）RKN：根結(jié)線蟲（Root-knotnematode）5前期準(zhǔn)備5.1儀器、藥品超凈工作臺(tái)、熒光定量PCR儀、熒光定量PCR試劑盒等，其他常用實(shí)驗(yàn)儀器、藥品見附錄A。5.2番茄種植所需設(shè)施、生產(chǎn)資料5.2.1主要設(shè)施光照培養(yǎng)室、人工氣候室或日光溫室。5.2.2生產(chǎn)資料育苗基質(zhì)、穴盤、穴盤托等，有機(jī)肥、復(fù)合肥、磷酸二氫鉀等常用肥料，百菌清、吡蟲啉、菊酯類等常用抑菌防蟲藥物。6幼胚成苗6.1果實(shí)采集從番茄植株上采集授粉后25d的果實(shí)備用。6.2幼胚采集6.2.1果實(shí)表面消毒DB13/T6010—20242在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將采集的果實(shí)浸泡在75%的酒精中10min進(jìn)行表面消毒。6.2.2取幼胚用消毒后的手術(shù)刀切開果皮，從果肉中將未成熟種子自胎座上剝離。6.2.3清洗用滅菌的蒸餾水洗去未成熟種子表面的果肉殘?jiān)?.3幼胚培養(yǎng)將清洗過的未成熟種子平鋪在1/2MS培養(yǎng)基上，放置于溫度28℃、光照/黑暗=16h/8h的條件下培養(yǎng)約5d。6.4移栽煉苗將發(fā)芽種子移栽到穴盤內(nèi)，加透明罩子保濕。7d后打開罩子煉苗，幼苗生長(zhǎng)至三葉一心期，備7分子標(biāo)記輔助選擇7.1DNA提取采集番茄幼苗葉片，采用常規(guī)的SDS方法或商業(yè)試劑盒提取DNA。7.2分子標(biāo)記檢測(cè)7.2.1主要抗病基因的分子標(biāo)記引物針對(duì)番茄TYLCVD、ToMVD、TSWVD、FCRR和RKN等病害，應(yīng)用表1給出的KASP引物，對(duì)番茄種質(zhì)資源的抗病基因進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)。表1KASP引物及基因分型判斷標(biāo)準(zhǔn)抗病基因等位基因Ty-1Ty-1-Allele-F1GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAATATGGTAAAGGTGCATCC抗病Ty-1-Allele-F2GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAATATGGTAAAGGTGCATCC感病Ty-1-RCCGTTGATTGAAGAAATTGATGMi-1Mi-1-Allele-R1GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGATGTTTACAAGTATTTGTGGCG抗病Mi-1-Allele-R2GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGATGTTTACAAGTATTTGTGGCA感病Mi-1-FTTCAGACGAAGTTAGACATAATm-22Tm-2-Allele-F1GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAATATGCTACAAGCCAAATTACTC感病Tm-2-Allele-F2GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAATATGCTACAAGCCAAATTACTT抗病Tm-2-RGAAACAACTCCATAATGCAAATCFrlFrl-Allele-F1GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTAAAGGACCATTTTTCGTAGACCATT感病Frl-Allele-F2GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTAAAGGACCATTTTTCGTAGACCATA抗病ATTTCTTACCATATGTGAAGAGAASw-5GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATGGACACAACTGGAGTTATTA感病GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCATGGACACAACTGGAGTTATTG抗病CAGTCATTCTTCAAATTTTA注：下劃線部分為FAM熒光標(biāo)簽序列；雙下劃線部分為HEX熒光標(biāo)7.2.2KASP檢測(cè)技術(shù)7.2.2.1反應(yīng)體系DB13/T6010—20243總體積為5μL：PCRMix（2×)2.5μL，DNA溶液（40ng～50ng·μL-1）0.5μL，正向引物1（10μmol·L-1）0.075μL，正向引物2（10μmol·L-1）0.075μL，反向引物（10μmol·L-1）0.2μL，加ddH2O補(bǔ)至5μL。7.2.2.2反應(yīng)程序共24個(gè)循環(huán)；57℃1min。終點(diǎn)法采集熒光信號(hào)。7.2.2.3檢測(cè)結(jié)果依據(jù)表1的判斷標(biāo)準(zhǔn)，將基因型分為純合抗病、純合感病和雜合型，選擇符合育種目標(biāo)的番茄幼苗。以Ty-1為例，基因分型結(jié)果見圖1。圖1Ty-1抗病基因檢測(cè)結(jié)果分型8種植期溫光調(diào)控8.1定植后管理于三葉一心期進(jìn)行幼苗移栽，白天溫度22℃~24℃,夜間14℃~16℃;光照時(shí)間為12h～14h，配置LED植物生長(zhǎng)燈紅藍(lán)光(1R1B)：遠(yuǎn)紅光=3：1，光通量密度100±10μmol/m2·s。保持14d～18d，至第一穗花現(xiàn)蕾。8.2現(xiàn)蕾后管理白天溫度24℃~26℃,夜間18℃~20℃。光照時(shí)間為13h～15h，配置LED植物生長(zhǎng)燈白光：遠(yuǎn)紅光=3：1，光通量密度120±10μmol/m2·s。保持8d～10d，至第一穗花可人工授粉。8.3開花后管理人工授粉后，白天溫度28℃~30℃,夜間18℃~20℃。光照時(shí)間為14h～16h，配置LED植物生長(zhǎng)燈白光或繼續(xù)保持白光：遠(yuǎn)紅光=3：1，光通量密度100±10μmol/m2·s。25天后，取果實(shí)進(jìn)行下一世代幼胚培養(yǎng)。DB13/T6010—20244實(shí)驗(yàn)室常用儀器、器具及藥品A.1實(shí)驗(yàn)室常用儀器、器具及藥品高溫高壓滅菌鍋、移液器、稱