免疫組化2-基本原理課件

免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫組化2-基本原理

抗原＋抗體（特異性）＋標(biāo)記物，原位顯示組織或細(xì)胞內(nèi)抗原的一門技術(shù)。免疫組化2-基本原理根據(jù)抗體標(biāo)記物不同：酶---免疫酶組織化學(xué)熒光素---免疫熒光組化膠體金---免疫膠體金組化高親和力物質(zhì)---親和免疫組化免疫組化2-基本原理其中，免疫酶組織化學(xué)應(yīng)用廣泛以其為例，掌握免疫組化基本原理免疫酶組化特點(diǎn)：信號(hào)定位準(zhǔn)確標(biāo)本可長期保存陽性標(biāo)記與病變關(guān)系方法簡便，易推廣免疫組化2-基本原理酶選擇標(biāo)準(zhǔn)：★該酶用細(xì)胞化學(xué)易于被檢出，能被光鏡或電鏡觀察?！锩阜磻?yīng)產(chǎn)物須穩(wěn)定，不擴(kuò)散，具有良好定位。

★酶易于純化，獲得純制品?！锩概c免疫球蛋白結(jié)合后，不喪失其活性?！锩冈赑H中性液內(nèi)較穩(wěn)定?！锝M織中不應(yīng)存在與底物作用的內(nèi)源性酶。免疫組化2-基本原理符合上述條件：

辣根過氧化物酶---HRP

鹼性磷酸酶---AKP

葡萄糖氧化酶---GOD免疫組化2-基本原理（一）辣根過氧化物酶（HRP）★分子量（40000），不會(huì)遮蓋抗原的結(jié)合部位★穩(wěn)定，易獲得較高純度酶★具有較高活性及特異性★可溶性佳，生成的產(chǎn)物不擴(kuò)散★組織中內(nèi)源性酶較少★可作用于多種底物，產(chǎn)生不同顏色★HRP穿透力強(qiáng)，易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)免疫組化2-基本原理HRP的底物：低濃度的H2O2，供氫體為胺類及酚類化合物。HRP顯色反應(yīng)：

HRP＋H2O2HRP＋H2O＋電子供體（氧化型）電子供體電子供體被氧化后，迅速改變顏色，通過聚合等反應(yīng)，生成不溶性有色顆粒，并就地原位沉淀。免疫組化2-基本原理HRP常用的電子供體：●3.3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)～棕色●氨乙基卡巴唑(AEC)～紅色，易溶于有機(jī)溶劑，易擴(kuò)散，用水溶性封固劑?！?-氯-1-茶酚（4CN）～藍(lán)色，易彌散，不能久保存●3.3，5.5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)～黃色免疫組化2-基本原理

（二）鹼性磷酸酶（AKP）

從小牛腸粘膜或大腸桿菌中提取●組織穿透能力較弱●內(nèi)源性AKP較高●左旋咪唑具有抑制作用免疫組化2-基本原理AKP底物：AKP常用的底物為α-萘酚AS-B1磷酸鹽

偶聯(lián)試劑：固蘭BB～藍(lán)色固紅TR～紅色免疫組化2-基本原理

（三）葡萄糖氧化酶（GOD）

底物為葡萄糖，終產(chǎn)物穩(wěn)定●體內(nèi)無內(nèi)源性GOD●分子量大，穿透力較弱免疫組化2-基本原理

第一節(jié)基本原理

免疫組化2-基本原理

酶標(biāo)記抗體法（EnzaymeLabelledantibody）是將酶通過共價(jià)鍵結(jié)合在抗體分子上，制備成酶標(biāo)記抗體，通過抗體去尋找相應(yīng)抗原。一、酶標(biāo)記抗體法免疫組化2-基本原理組織抗原第一抗體過氧化物酶直接法（一）直接法原理：HRP標(biāo)記在特異性抗體（第一抗體）上，抗原---抗體●HRP復(fù)合物免疫組化2-基本原理步驟：一步完成優(yōu)點(diǎn)：簡便、省時(shí)特異性強(qiáng)，非特異染色輕缺點(diǎn)：敏感性差一種標(biāo)記抗體只能檢測一種抗原免疫組化2-基本原理組織抗原第一抗原第二抗體過氧化物酶間接法（二）間接法原理：HRP標(biāo)記在第二抗體上，抗原---特異性抗體---第二抗體●HRP復(fù)合物免疫組化2-基本原理優(yōu)點(diǎn)：較直接法敏感性高

一種標(biāo)記抗體能用于相應(yīng)動(dòng)物制備的多種特異性抗體，檢測多種抗原缺點(diǎn)：

較直接法費(fèi)時(shí)非特異性染色稍重

步驟：二步法免疫組化2-基本原理●制備抗酶抗體●制備PAP復(fù)合物免疫組化2-基本原理酶橋法組織抗原第一抗體第二抗體第三抗體（抗酶抗體）HRP二、酶橋法原理：HRP標(biāo)記在抗酶抗體（三抗）上，抗原---特異性抗體---第二抗體---第三抗體●HRP復(fù)合物一抗、三抗有何關(guān)系？免疫組化2-基本原理優(yōu)點(diǎn)：與酶標(biāo)記抗體法相比，敏感性高（酶與三抗通過抗原-抗體反應(yīng)結(jié)合，避免直接標(biāo)記引起兩者活性降低）缺點(diǎn)：

較費(fèi)時(shí)

步驟：四步法免疫組化2-基本原理一、PAP法原理：抗原---特異性抗體---第二抗體（橋抗體）---PAP復(fù)合物免疫組化2-基本原理組織抗原第一抗原第二抗體PAP復(fù)合物HRP三、PAP法（過氧化物酶抗過氧化物酶復(fù)合物法）原理：與酶橋法相似，不同之處是將酶與三抗制備成PAP復(fù)合物?？乖?--特異性抗體---第二抗體（橋抗）---PAP復(fù)合物免疫組化2-基本原理優(yōu)點(diǎn)：敏感性較高背景染色較輕局限：特異性抗體與PAP必須為同一種屬動(dòng)物

步驟：三步法免疫組化2-基本原理APAAP法（堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶復(fù)合物法）原理：抗原---特異抗體---二抗---APAAP復(fù)合物免疫組化2-基本原理優(yōu)點(diǎn)：非特異背景較輕，不受內(nèi)源性酶的干擾

缺點(diǎn)：產(chǎn)物易溶于有機(jī)溶劑步驟：三步法免疫組化2-基本原理組織抗原第一抗原第二抗體PAP復(fù)合物HRP四、雙PAP法原理：在PAP的基礎(chǔ)上再重復(fù)第二抗體和PAP復(fù)合物抗原---特異性抗體---二抗（橋抗）---PAP---二抗---PAP復(fù)合物免疫組化2-基本原理步驟：五步法

優(yōu)點(diǎn)：敏感性較高缺點(diǎn)：步驟多，費(fèi)時(shí)

非特異性背景重免疫組化2-基本原理Avidin---一種鹼性糖蛋白，由四個(gè)相同亞基組成Biotin---小分子維生素Avidin和Biotin具有較高親和力，比普通抗原抗體親和力高百萬倍以上五、親和免疫組化免疫組化2-基本原理組織抗原第一抗體第二抗體HRP生物素親和素原理：酶標(biāo)記Biotin形成酶素化

Biotin（一）ABC法

(Avidin-Biotin–peroxidase-Complexmethod)

酶素化Biotin＋Avidin---ABC復(fù)合物抗原---特異抗體---Biotin標(biāo)記二抗---Avidin●Biotin●HRP免疫組化2-基本原理步驟：三步法優(yōu)點(diǎn)：敏感性較高特異性強(qiáng)應(yīng)用范圍廣缺點(diǎn)：某些臟器存在內(nèi)源性生物素干擾

Avidin與糖基、纖維組織、核酸及細(xì)胞膜中磷脂有非特異反應(yīng)

免疫組化2-基本原理（二）SABC法（StreptavidinbiotinPeroxidaseComplex）

比較親和素，鏈霉親和素造成的背景著色淺

SABC法已代替ABC法免疫組化2-基本原理

（三）LSAB法（

LabelledStreptavidinBiotinMethod）---又稱鏈霉親和素-過氧化物酶法（SP法）原理：

●Biotin標(biāo)記第二抗體●HRP標(biāo)記Avidin抗原---特異性抗體---Biotin標(biāo)記第二抗體---Avidin●HRP復(fù)合物免疫組化2-基本原理步驟：三步法優(yōu)點(diǎn)：敏感性高特異性強(qiáng)，背景淺淡方法簡便

免疫組化2-基本原理六、多聚合物酶法免疫組化2-基本原理組織抗原一抗HRP多聚骨架（一）Epos法（Enhancedpolymerone-stepstaining）原理：采用一種具有惰性的多聚化合物作為骨架，將特異性抗體和HRP，同時(shí)標(biāo)記在多聚合物分子上，形成HRP---多聚合物---特異性抗體。免疫組化2-基本原理步驟：一步法優(yōu)點(diǎn)：快速，簡便，特異性強(qiáng)，敏感性高缺點(diǎn)：商品化種類不全，

價(jià)格昂貴免疫組化2-基本原理組織抗原一抗二抗酶多聚骨架第一步第二步（二）EnVision法（Enhan