蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)課件

蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)

分子酶學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鄭柏松講師

生物物理學(xué)－－生物大分子結(jié)構(gòu)解析蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)授課內(nèi)容歷史的回顧X光衍射原理蛋白質(zhì)表達(dá)、純化蛋白質(zhì)結(jié)晶X光衍射及數(shù)據(jù)收集結(jié)構(gòu)解析蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)授課目的了解生物物理學(xué)發(fā)展歷史與前沿；掌握蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)知識；開闊視野－－貼近國際一流結(jié)構(gòu)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室；培養(yǎng)興趣－－增強(qiáng)對科研工作的感性和理性認(rèn)識。蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)測定方法X-射線晶體學(xué)電子顯微學(xué)(低溫電子顯微技術(shù)與三維象重構(gòu)）核磁共振波譜學(xué)蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)1895年德國物理學(xué)家倫琴發(fā)現(xiàn)X射線并因此獲得1901年首屆諾貝爾物理學(xué)獎，X射線歷經(jīng)110年跨越3個世紀(jì)，由于眾多學(xué)者在探索X射線性質(zhì)、應(yīng)用、儀器等方面的創(chuàng)新性研究，先后有29位物理學(xué)家、晶體學(xué)家、化學(xué)家、分子生物學(xué)家等分別獲得了物理（7項(xiàng)）、化學(xué)（9項(xiàng)）、生理學(xué)或醫(yī)學(xué)（3項(xiàng)）總計(jì)19項(xiàng)諾貝爾獎。歷史的回顧蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)

1912年勞厄獲得了X射線通過晶體后產(chǎn)生的衍射斑點(diǎn)圖像（勞厄衍射圖），證明了X射線的波動性及其波長范圍。隨后提出了表示原子排列周期與X射線波長間關(guān)系的著名的衍射方程（勞厄方程），并成功地解釋了晶體衍射的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

英國物理學(xué)家布拉格父子、達(dá)爾文等人發(fā)展了X射線衍射理論，類比光學(xué)反射原理提出了表示晶體結(jié)構(gòu)（晶面間距d）、X射線波長（λ）與衍射方位（

）間的關(guān)系的布拉格方程，提出了嵌鑲晶體、完整晶體和包含有原子熱運(yùn)動諸因素的衍射強(qiáng)度公式，闡明了X射線通過晶體產(chǎn)生衍射的付里葉變換本質(zhì)，獲得了X射線的連續(xù)光譜與取決于陰極材料的特征光譜。歷史的回顧蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)最終X射線衍射成為有機(jī)分子（特別是生物活性分子）立體結(jié)構(gòu)測定的有力工具，為研究生理活性物質(zhì)（藥物分子）的立體結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)改造、結(jié)構(gòu)預(yù)測、結(jié)構(gòu)－功能關(guān)系為目標(biāo)的有機(jī)晶體學(xué)科奠定了基礎(chǔ)。

對于生物大分子的研究，始于30年代中期，貝納爾和藿奇金開始用X射線衍射方法研究胃蛋白酶的晶體結(jié)構(gòu)，但直到布拉格主持凱文迪實(shí)驗(yàn)室后，才使得這一工作取得突破，為創(chuàng)建分子生物學(xué)科奠定了基礎(chǔ)。

1953年沃森和克里克根據(jù)X衍射實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)建立了脫氧核糖核酸(DNA)的雙螺旋結(jié)構(gòu)，并因此獲得1962年的諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎。歷史的回顧蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)肯德魯和佩盧茨從30年代開始，應(yīng)用X衍射方法研究肌紅蛋白與血紅蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，歷經(jīng)20多年的艱苦努力，在眾多科學(xué)家的共同參與下，終于在1960年獲得了這兩個蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，并因此榮獲1962年的諾貝爾化學(xué)獎。

在1957至1967年的10年中，相繼用X衍射方法測定了溶菌酶、胰島素、胰凝乳蛋白酶A、核糖核酸酶、核糖核酸酶S和羧肽酶的高分辨晶體結(jié)構(gòu)。

戴森豪菲爾和胡貝爾、米海爾因測定紫色細(xì)菌光合作用中心的三維結(jié)構(gòu)而獲得1988年的諾貝爾化學(xué)獎，形成了新的蛋白質(zhì)晶體學(xué)科與結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)科。歷史的回顧蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)

X-射線

X射線和可見光一樣屬于電磁輻射，但其波長比可見光短得多，介于紫外線與γ射線之間，約為10－2到102

埃的范圍。X光衍射原理蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)X-射線X光衍射原理X射線和其它電磁波一樣，能產(chǎn)生反射、折射、散射、干涉、衍射、偏振和吸收等現(xiàn)象。但是，在通常實(shí)驗(yàn)條件下，很難觀察到X射線的反射。不可能像可見光那樣用透鏡成像。對于所有的介質(zhì)，X射線的折射率n都很接近于1（但小于1），所以幾乎不能被偏折到任一有實(shí)際用途的程度。在物質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)中，原子和分子的距離（1～10埃左右）正好落在X射線的波長范圍內(nèi)，所以物質(zhì)（特別是晶體）對X射線的散射和衍射能夠傳遞極為豐富的微觀結(jié)構(gòu)信息。X射線衍射方法是當(dāng)今研究物質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)的主要方法。X射線穿透物質(zhì)時都會被部分吸收,其強(qiáng)度將被衰減變?nèi)?；吸收的程度與物質(zhì)的組成、密度和厚度有關(guān)。在此過程中X射線與物質(zhì)的相互作用是很復(fù)雜的，會引起多種效應(yīng)。例如，可以使氣體電離；使一些物質(zhì)發(fā)出可見的熒光；能破壞物質(zhì)的化學(xué)鍵，引起化學(xué)分解，也能促使新鍵的形成，促進(jìn)物質(zhì)的合成；作用于生物細(xì)胞組織，還會導(dǎo)致生理效應(yīng)，使新陳代謝發(fā)生變化甚至造成輻射損傷。X射線散射的過程又可分為兩種，一種是只引起X射線方向的改變，不引起能量變化的散射，稱為相干散射，這是X射線衍射的物理基礎(chǔ)；另一種是既引起X射線光子方向改變，也引起其能量的改變的散射，稱為不相干散射或康普頓散射（或康普頓效應(yīng)），此過程同時產(chǎn)生反沖電子（光電子）。蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)衍射的幾何方程布拉格方程勞埃（Laue）方程X射線照射到晶體上發(fā)生散射，其中衍射現(xiàn)象是X射線被晶體散射的一種特殊表現(xiàn)。晶體的基本特征是其微觀結(jié)構(gòu)（原子、分子或離子的排列）具有周期性，當(dāng)X射線被散射時，散射波中與入射波波長相同的相干散射波，會互相干涉，在一些特定的方向上互相加強(qiáng)，產(chǎn)生衍射線。晶體可能產(chǎn)生衍射的方向決定于晶體微觀結(jié)構(gòu)的類型（晶胞類型）及其基本尺寸（晶面間距，晶胞參數(shù)等）；而衍射強(qiáng)度決定于晶體中各組成原子的元素種類及其分布排列的坐標(biāo)。X光衍射原理蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)X光衍射原理勞埃（Laue）方程和布拉格（Bragg）方程確定了衍射方向與晶體結(jié)構(gòu)基本周期的關(guān)系，通過對衍射方向的測量，理論上我們可以確定晶體結(jié)構(gòu)的對稱類型和晶胞參數(shù)。而X射線對于晶體的衍射強(qiáng)度則決定于晶體中原子的元素種類及其排列分布的位置。X光衍射原理蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)Whatwecando？挑戰(zhàn)和機(jī)遇？？？蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)克隆、表達(dá)、純化結(jié)晶數(shù)據(jù)收集及處理相角的測定相角的改進(jìn)（優(yōu)化）電子密度圖的解釋修正結(jié)構(gòu)的描述和與功能關(guān)系的研究StructuralBiologyProcesses蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)Recombinantproteinover-expressionandpurificationExpressionsystems:BacteriasystemYeastInsectcellsMammaliancellsCell-freesystem蛋白質(zhì)表達(dá)、純化蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)SomeVectorsforE.coliExpressionSystem蛋白質(zhì)表達(dá)、純化蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)ProteinExpressioninYeastCloningoftargetgenetovectorTransformtoyeastPichiapastorisSelectionofrecombinantyeaststrainYeastcellcultureforproteinproduction蛋白質(zhì)表達(dá)、純化蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)ProteinExpressioninInsectCellsAfterrecombinationCloningoftargetgenetopFastBacTransformtobacteriawithBacmidBacmidtransfectedtoinsectcellsVirusassemblyininsectcellsVirusesinfectInsectCellsforproteinproductionStrainsforexpression:Sf9,Sf21,Hi5蛋白質(zhì)表達(dá)、純化蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)TransientExpressionInMammalianCells293EcellcanbeculturedinsuspensionmediumRecombinantplasmidwithtargetgeneTransfectto293EcellswithPEIHarvestcellsforproteinpurification蛋白質(zhì)表達(dá)、純化蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)293EBNA1CellsWithGFPExpressingVectorABWholecellsonplate;CellsinthesameplatetoAviewedbyGFPflorescence蛋白質(zhì)表達(dá)、純化蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)RecombinantProteinsExpressionIn293EBNA1CellsLanes:1.Proteinstandard;2.Controlwhole293Ecells;3.GFPexpressed293Ecells;4.HCF-1N380expressed293Ecells;5.HCF-1N16-363expressed293Ecells.

Recombinantprotein1(lane4)12345142031456794Recombinantprotein2(lane5)GFP(lane3)蛋白質(zhì)表達(dá)、純化蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)Cell-freeSystemforProteinProductionSometimesitcanproducesolubleproteinwhichcannotbeexpressedassolubleformwithcellularsystem.Roche:RapidTranslationSystem(RTS)RapidproteinexpressionToxicproteinexpression蛋白質(zhì)表達(dá)、純化蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)Protein－Protein

ComplexExpressionandPurification:a.Proteinsexpressseparately;b.Proteinsco-expressinonecell.2.Protein-NucleicAcid：

a.Protein-DNAComplex；

b.Protein-RNAComplex.ProducingProteinComplexes

forCrystallization蛋白質(zhì)表達(dá)、純化蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)Methodsforproductionofrecombinantproteincomplexesby

invivoreconstitutioninE.coli1.Usecompatiblevectors,suchaspMR101(p15Aori)andpET15B(pBR322ori);2.Useonevectorwithmorethanoneexpressioncassettes--polycistronic；Benefitsofinvivoreconstitution(coexpression)efficiencyoneroundofexpressiononeroundofpurificationqualitycoexpressionandcofoldingofpolypeptidesinthepresenceofcellularchaperonesmayincreaseyieldoffunctionalcomplexProtein－Protein

ComplexExpressionandPurification蛋白質(zhì)表達(dá)、純化蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)Protein－DNA

ComplexProteinsolubility:higherinhighsaltbufferusually;Protein-DNAcomplexstability:morestablethanproteinalone;DNAlengthandsequenceusedforcrystallization:a.additionalbasepairs;b.stickyends;4.PurificationofDNAoligos:HPLCwithhydrophobicinteraction,C4etc;5.Trappingreactionintermediate:disulfidebridge;proteinpointmutation,etc;6.Preparationofprotein-DNAcomplexes:mixwithextramolarDNA;Crystallization:PEGorMPDinlowslatbuffer;Example:over6000trialforprotein-DNAcomplex.蛋白質(zhì)表達(dá)、純化蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)Protein-RNAComplexDifficulties:avoidofRNase!

1.Phosphategroupsinterferecrystalpacking;2.ElongatedRNAspackloosely;RNAengineering:bluntorstickyends;deletion,replacement,etc;RNApreparation:1.Synthesis;2.Invitrotranscription;蛋白質(zhì)表達(dá)、純化蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)ProteinModificationforCrystallizationProteininhibitor,partnerandmonoclonalantibody;Proteinpost-translationalmodification;3.Proteinmutagenesis:truncation,mutation,deletion蛋白質(zhì)表達(dá)、純化蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)PurificationFundamentalPurificationTechniquesAffinity:bytagsorantibodies;Ionexchange;Sizeexclusion;Hydrophobicinteraction;Aim:Obtainhighpurityandhomogenousproteinsample蛋白質(zhì)表達(dá)、純化蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)蛋白質(zhì)表達(dá)、純化蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)Purity&HomogenityPurityCheck SDSHomogenityCheck NativePAGE,DynamicLightScattering(DLS)

TheDLSproaproteinishighlypredictiveofitscrystallizability.Proteinswithmonomodaldistributionshaveahighprobability(70-80%)ofproducingsomekindofcrystals.SDSNative蛋白質(zhì)表達(dá)、純化蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)AffinityChromatographyPrinciple BiospecificligandcovalentattachedtothematrixCharacteristics Specific；HighyieldFusionproteinFusionswitholigo-HistidineFusionwithGSTFusionwithProteinAScFvfusionswithE-tagFusionwithintein蛋白質(zhì)表達(dá)、純化蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)Ion-exchangePrinciple: BasedonchargedifferenceamongdifferentproteinsCharacteristics Nolimitationtosamplecolumn Expeditious蛋白質(zhì)表達(dá)、純化蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)GelFiltrationPrinciple: AccordingtodifferencesinsizesCharacteristics Muchlimitationonsamplevolume Lowvelocitycomparetoion-exchange蛋白質(zhì)表達(dá)、純化蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)Crystal

蛋白質(zhì)的結(jié)晶蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)什么是晶體？晶體：由原子（或離子、分子）在空間周期排列構(gòu)成的固體物質(zhì)。如果原子（或離子、分子）是按照一種確定的方式在三維空間作嚴(yán)格的周期性的規(guī)律排列，即相隔一定的距離，周期重復(fù)出現(xiàn)，這樣的物質(zhì)稱為晶體或單晶體。晶體一定是固體物質(zhì)，但是固體物質(zhì)不一定是晶體。

晶體的分布非常廣泛，自然界的固體物質(zhì)中，絕大多數(shù)是晶體。氣體、液體和非晶態(tài)物質(zhì)在一定條件下也可以轉(zhuǎn)變成晶體。日常生活中的食鹽、糖、水晶、寶石等均為晶態(tài)物質(zhì)－晶體。非晶體：物質(zhì)內(nèi)部原子雜亂無章地分布，沒有周期性排列的規(guī)律，此類固體物質(zhì)稱為非晶體或者稱為非晶態(tài)物質(zhì)。

玻璃、塑料、松香、陶瓷、生物制品、纖維、淀粉、多糖、無定形藥物等，是固體中常見的非晶態(tài)物質(zhì)。蛋白質(zhì)的結(jié)晶蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)如何形成晶體？蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)蛋白質(zhì)結(jié)晶原理蛋白質(zhì)在其溶液中的結(jié)晶其實(shí)是一種緩慢沉淀的過程。溶液中存在的作用力有疏水相互作用、靜電力、氫鍵作用力等，當(dāng)吸引力與排斥力達(dá)到平衡時溶液處于穩(wěn)定狀態(tài)。當(dāng)吸引作用增大，或分散的或排斥的相互作用減小時，分子開始趨向與聚集狀態(tài)。例如在液態(tài)環(huán)境中，如果生物大分子溶液很濃，沒有足夠的水維持其溶劑化作用，則分子可能聚集成非晶態(tài)沉淀，也可能結(jié)晶出來。常用的使蛋白質(zhì)沉淀的方法是加入沉淀劑，這種方法是通過降低水的流動性來增加蛋白質(zhì)的有效濃度。常用沉淀劑：聚乙二醇（PEG），鹽（如硫酸銨）。另外一種方法：減小蛋白質(zhì)分子間的排斥力或是增大他們之間的吸引力。如加入有機(jī)溶劑，改變?nèi)芤旱腜H，溫度等。蛋白質(zhì)的結(jié)晶蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)蛋白質(zhì)結(jié)晶方法蛋白質(zhì)的結(jié)晶蛋白質(zhì)結(jié)晶方法整批結(jié)晶法透析法液液擴(kuò)散法氣相擴(kuò)散法蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)整批結(jié)晶法(batchcrystallization)

這是最古老也是最簡單的蛋白質(zhì)結(jié)晶的方法。該方法的原理是瞬間將沉淀劑加入蛋白質(zhì)溶液中，使溶液突然達(dá)到高度飽和狀態(tài)。如果運(yùn)氣好的話，晶體會逐漸從過飽和溶液中析出并且不需要其他步驟。蛋白質(zhì)的結(jié)晶蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)透析法（dialysis）

適用于對于大量蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行結(jié)晶。

微量透析法（liquid-liquiddiffusion）圖a和圖b中，蛋白質(zhì)溶液保留在毛細(xì)管中。圖c中，蛋白質(zhì)溶液被甩到管底并與膜接觸。圖d和圖e中，毛細(xì)管置于盛有滲析液的Eppendorf管中。蛋白質(zhì)的結(jié)晶蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)液液擴(kuò)散法

熔點(diǎn)毛細(xì)管中的液液擴(kuò)散圖示為沉淀劑密度較大時——這種方法是在小孔毛細(xì)管中將蛋白質(zhì)溶液與含有沉淀劑的溶液相互覆蓋，讓其自己緩慢擴(kuò)散的過程?！鞍踪|(zhì)溶液與沉淀劑以1:1混合。因此沉淀劑濃度應(yīng)為最終所需濃度的2倍。蛋白質(zhì)的結(jié)晶蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)氣相擴(kuò)散法懸滴法使用帶有空穴的盤子，蛋白質(zhì)溶液的液滴懸掛在蓋玻片的下方，蓋玻片覆蓋在密封有沉淀劑溶液的空穴上方。蓋玻片的表面經(jīng)過硅化處理以阻止液滴在玻璃表面的鋪展。這種方法是利用氣相平衡的原理，使任何揮發(fā)性的組分在小液滴和大樣品池間達(dá)到平衡，使蛋白質(zhì)液滴中沉淀劑及蛋白質(zhì)的濃度逐漸增加，達(dá)到過飽和狀態(tài)，最終析出晶體

非常適用于只有少量樣品，卻要篩選大量條件的情況。蛋白質(zhì)的結(jié)晶蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)坐滴法如果蛋白質(zhì)溶液表面張力低，在懸滴法中蛋白質(zhì)溶液在蓋玻片上鋪展而不能形成液滴，此時可用坐滴法。

蛋白質(zhì)的結(jié)晶蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)蛋白質(zhì)結(jié)晶條件雜質(zhì)、晶核及其他因素如溫度、溶液PH值及振動等都會影響結(jié)晶過程。為使蛋白質(zhì)結(jié)晶，要求：蛋白質(zhì)純度足夠高，不含其他化合物。蛋白質(zhì)分子表面性質(zhì)相同，聚集形式均一。蛋白質(zhì)溶解在合適的溶劑中。溶液達(dá)到過飽和，使蛋白質(zhì)形成小的聚集體，作為晶體生長的晶核。晶核形成，晶體才開始生長。溶液的過飽和度要降至最低水平，避免太多的晶核產(chǎn)生。晶體生長盡量緩慢以便在結(jié)構(gòu)中達(dá)到最大的有序度，方法：改變溫度，蛋白質(zhì)濃度等。蛋白質(zhì)的結(jié)晶蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)ProteinSampleProteinConcentration:5-20mg/mlSaltconcentration:aslowaspossible.Iftheproteinisnotsoluble,changethepHofthebufferoraddsmallamountsofdifferentsalts.Bufferconcentration:5-10mM,10-20timeslowerthanthebufferconcentrationusedinthewell.(100mMinthefirstscreen).Stabilizer:DTT,EDTAandproteaseinhibitors. Atypicalproteinbufferis10mMTEA/HCl,pH7.5,25mMNaCl,1mMDTT,1mMEDTAand1mMNaN3.

蛋白質(zhì)的結(jié)晶蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)Precipitantsusedinmacromolecularcrystallization1.Salts:

(NH4)2SO4

2.Volatileorganicsolvents:

Ethanol3.Longchainpolymers:

PEG40004.Lowmolecularweightpolymersandnon-volatileorganiccompounds:

MPD蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)Table3.Precipitantsusedinmacromolecularcrystallization蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)FactorsaffectingcrystallizationFormacromolecule:purity,stability,modification,etc;Somechemicalfactors:pH,precipitant,ionstrength,specificions,etc;Somephysicalfactors:temperature,crystallizationmethod,time,etc.蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)Homogeity:purityisveryimportant;Solubility:dissolve

proteintohighconcentration;Stability:maintainproteinasstableaspossible;Supersaturation:alterthepropertiesofsolutionforsupersaturation;Association:trytopromoteorderedassociation;Nucleation:trytopromotetheformationofnuclei;Variety:tryasmanymethodsaspossible;

Liquidimpurities:avoidimpuritiesinthemotherliquid;Preservation:protectplateandcrystalfromshockanddisruption;Conclusions:someimportantprinciples蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)ScreeningRoboticManualCheapReadilyavailableAllowsforcreativityMultitudeofconditionsHighlyreproducibleEasytodocumentandtrackdataLowerconsumptionofprotein結(jié)晶蛋白質(zhì)的結(jié)晶蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)CrystalMation蛋白質(zhì)的結(jié)晶蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)X光光源及探測器收集X光衍射數(shù)據(jù)的主要硬件設(shè)備：X光光源單色器X光探測器

蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)X光光源密封X-射線管（sealedx-raytubes）旋轉(zhuǎn)陽極管（rotatinganodetubes）同步輻射(SynchrotronRadiation)蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)X光光源——密封X-射線管

在密封X-射線管中，陰極發(fā)射電子，因?yàn)楣茏犹幱谡婵諣顟B(tài)，相對于金屬陽極，陰極有很高的負(fù)電勢，電子被加速并以很高的速度到達(dá)陽極。陽極通常是銅板。電子能量的大部份轉(zhuǎn)變成熱量。一小部分能量以兩種不同的X射線的形式發(fā)出來。蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)密封X-射線管——X射線產(chǎn)生原理銅陽極靶的X-射線管的光譜。平滑的連續(xù)區(qū)域是減速（或加速）的帶電粒子發(fā)出的電磁輻射造成的。銳鋒則是由于電子在陽極物質(zhì)的原子的內(nèi)部軌道中發(fā)生躍遷時產(chǎn)生的高能電子轟擊陽極原子，原子的低能級電子被轟擊出來，而高能級電子占據(jù)空軌道，在這一過程中便釋放出特定波長的X射線。

由于L－層的精細(xì)結(jié)構(gòu)，Kα分裂為Kα1和Kα2兩條譜線。M層的能級很靠近，因此Kβ只是一個單峰。為了得到光譜中特定波長的譜線，需要一個最小激發(fā)電壓。加大電壓或者增大管電流可以增加衍射的強(qiáng)度。局限性：在聚焦點(diǎn)處電子束對陽極所產(chǎn)生的致熱作用限制了X射線管的最大功率。功率太大將毀壞射線管。

蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)X光光源——旋轉(zhuǎn)陽極管與密封X-射線管類似，只是用可旋轉(zhuǎn)的柱體代替固定的金屬片。比密封管的優(yōu)點(diǎn)是它較高的輻射強(qiáng)度，伴隨的缺點(diǎn)是必須連續(xù)的抽氣以保持其所需的真空度。蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)X光光源——同步輻射

藝術(shù)家畫的座落于格勒諾布爾[法國東南部城市]Grenoble的歐洲同步輻射裝置。周長是844.39米。同步輻射器是一個龐大而且昂貴的裝置。環(huán)的直徑有10到幾百米的大小。蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)X光光源——同步輻射（原理）同步輻射儀是以同步加速器為基礎(chǔ)構(gòu)建而成。同步加速器是使帶電粒子（負(fù)電子或正電子）以近光速回轉(zhuǎn)的裝置。粒子從線性加速器或輔助同步輻射裝置直接注入儲存環(huán)。粒子在電場和磁場共同作用下運(yùn)動。其的軌跡由它們的能量及使帶電粒子改變方向的磁場決定。當(dāng)粒子束改變方向時，負(fù)電子或正電子便向環(huán)中心方向加速，釋放出電磁輻射，進(jìn)而釋放能量。能量的損失由每次循環(huán)的射頻輸入來補(bǔ)償。由于自由運(yùn)動的電子(和正電子)是無法量子化的，依賴帶電粒子的能量和磁場強(qiáng)度的不同，所產(chǎn)生的輻射的范圍很廣。蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)同步輻射的特性高強(qiáng)度(intensity)僅用彎曲磁場它就能產(chǎn)生比普通X射線發(fā)生器高兩個數(shù)量級的輻射，而用多極搖擺磁場或波紋磁場能產(chǎn)生更高數(shù)量級的輻射。非常適用于衍射能力弱的樣品的數(shù)據(jù)收集。另一個優(yōu)點(diǎn)是射線的低發(fā)散度，這導(dǎo)致清晰的衍射點(diǎn)?？烧{(diào)性(tunability)同步輻射在可調(diào)性上也與X光發(fā)生管不同用單色器可以選取光譜范圍內(nèi)任何合適的波長。

偏振（polarization）來源于X光管的X射線是非偏振的，同步輻射則是高度偏振的。射線的偏振對原子的反常X射線散射有影響。蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)X光探測器-獲得最終數(shù)據(jù)四圓衍射儀DIPX射線面探測儀CCDX射線檢測儀蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)ACTOR?:AutomatedCrystalTransfer,OrientationandRetrieval蛋白質(zhì)的結(jié)晶蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)UltimateHomeLab?

蛋白質(zhì)的結(jié)晶蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)HighFluxHomeLab?蛋白質(zhì)的結(jié)晶蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)CompactHomeLab?蛋白質(zhì)的結(jié)晶蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)衍射圖片電子密度三維結(jié)構(gòu)HKLFPhi?

phi相角求解實(shí)空間倒易空間

X射線衍射實(shí)驗(yàn)和結(jié)構(gòu)計(jì)算過程Fourier變換與Fourier反變換蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)

公式二根據(jù)電子密度計(jì)算結(jié)構(gòu)因子公式一根據(jù)結(jié)構(gòu)因子計(jì)算電子密度公式三根據(jù)原子坐標(biāo)計(jì)算結(jié)構(gòu)因子結(jié)構(gòu)解析的數(shù)學(xué)原理蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)常用的蛋白質(zhì)晶體學(xué)軟件分類介紹相位確定中的軟件應(yīng)用結(jié)構(gòu)可視化的軟件應(yīng)用結(jié)構(gòu)描述中的軟件應(yīng)用Agenda數(shù)據(jù)處理中的軟件應(yīng)用總結(jié)蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)常用的蛋白質(zhì)晶體學(xué)軟件分類介紹蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)PhasingandrefinementVisualizationStructureDescriptionDataProcessingAutomar,DPS,HKL,Mosflm,novel_R,Strategy,XDS,d*TREKAMoRe,ARP/wARP,CCP4,cctbx,CNS,CONVROT,EPMR,FFFEAR,MADSYS,MAID,MAPUTILS,MOLREP,OASIS2004,SHELX,SnB,SOLVE/RESOLVE,USF,X-plorO,COOT,QUANTA,XtalViewConscript,DINO,GRASP,LIGPLOT,MOLMOL,Molscript/Bobscript,MSMS,PROMOTIF,PyMOL,Provay,RASMOL,Raster3d,Ribbons,Setor,SPOCK,TkRaster3d,TOPS,VMD蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)數(shù)據(jù)處理中的軟件應(yīng)用－－晶體學(xué)計(jì)算中的“第一步”蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)數(shù)據(jù)處理的基本步驟RmergeCompletenessRedundancyI/sigma(I)Systemabsence???PeakSearchIndexParameterRefinementIntegrationMergeCheckoutputdataLaueGroupCellparam.Crystalorientation???蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)數(shù)據(jù)處理的常用軟件目前實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)在比較常用的處理軟件：HKL2000/HKLHKL2000/HKL：是目前使用最為廣泛的一種數(shù)據(jù)處理軟件包；在PDB庫中有超過80％的結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)是用HKL2000/HKL處理的；操作界面清晰，使用方便；

在處理大部分?jǐn)?shù)據(jù)的時，Index和Integration較其他軟件更有優(yōu)勢。蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)HKL2000使用范例蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)數(shù)據(jù)處理小結(jié)對數(shù)據(jù)的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：1.Rmerge:越低數(shù)據(jù)質(zhì)量越好，最高殼層的Rmerge最好在50%以下；2.完整度(Completeness):越大表明數(shù)據(jù)的完整性越好，最好各殼層的完整度都控制在90%以上（有冰環(huán)的情況除外）；3.冗余度(Redundancy):越大則對密度圖的細(xì)節(jié)貢獻(xiàn)越明顯，因此數(shù)據(jù)收集衍射圖的張數(shù)越多越好；4.信躁比(I/sigma(I)):表明了衍射點(diǎn)的信號強(qiáng)度，越大數(shù)據(jù)質(zhì)量越好，最高殼層不應(yīng)低于2~3；5.對于MAD數(shù)據(jù)，還要觀察ScaleFactor隨時間得變化，以確認(rèn)波長是否發(fā)生變化；對空間群的判斷：由于某些空間群的系統(tǒng)消光完全相同，或者兩個不同空間群處理出晶胞參數(shù)的某個值相差很小，都會造成判斷上的失誤，因此應(yīng)注意及時調(diào)整空間群。蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)相位確定中的軟件應(yīng)用蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)

確定相位的常用基本方法PhasingMAD/SADMIR/SIRMR1.分子置換法2.重原子法3.直接法多(單)對同晶置換法（MIR/SIR)多(單)波長反常散射法

(MAD/SAD)蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)MAD/SAD方法中的軟件應(yīng)用MAD/SAD方法的軟件包HeavyatomsearchHeavyatompositionrefinementPhasingPhaseimprovement:DensitymodificationNCSaveragingPhaseextendSHELXSOLVE/RESOLVECNS/X-plorSnBOASIS2004CCP4(Mlphare…)????????MAD/SAD主要流程蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)MAD/SAD常用的方法及軟件SHELX

(Heavyatomsearch)SOLVE

(Heavyatompositionrefinement)SOLVE

(Phasing)RESOLVE

(DM,NCSaveraging,Highresolutionnative)CNS(DM,NCSaveraging,Highresolutionnative)HKL2MAP,SHELXC/D,SOLVE/RESOVE,CNSElectronDensityMap/Modelbuilding蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)示例蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)MAD/SAD小結(jié)幾乎每種軟件都包含了從Heavyatomsearch到Phaseimprovement的所有程序；但是各有側(cè)重。對MIR/SIR的數(shù)據(jù)處理方法與MAD/SAD方法類似。對于一般的數(shù)據(jù)，可以首先選用SOLVE/RESOLVE進(jìn)行初步計(jì)算。經(jīng)驗(yàn)總結(jié)：1.SHELX長于Heavyatomsearch；2.SOLVE/RESOLVE簡單、集成功能較多，方便使用，但DM的效果不是很好；3.CNS長于Phaseimprovement，其densitymodification,averaging的效果明顯優(yōu)于其他軟件；綜合使用，取得最佳結(jié)果。蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)MR方法中的軟件應(yīng)用MR方法的軟件包Cross_rotationsearchTranslationsearchCNS/X-plorMolrepAmoreEpmrPhaser????????MR主要流程蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)MR常用的方法及軟件常用的軟件包：CNS和AmoreAmore的特點(diǎn)是界面操作，可建立模型庫，計(jì)算速度較快，使用方便；

CNS的特點(diǎn)是結(jié)果較為準(zhǔn)確，可調(diào)整的參數(shù)多，但是速度較慢。蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)CNS示例數(shù)據(jù)準(zhǔn)備需要準(zhǔn)備的文件包括：數(shù)據(jù)文件：data.sca

模型的坐標(biāo)文件：model.pdb數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成為CNS可用的格式：

a.%>to_cnsdata.scadata.hkl

將數(shù)據(jù)文件轉(zhuǎn)化成為cns可用的hkl數(shù)據(jù)文件；

b.%>cns_solve<generate_easy.inp

將模型坐標(biāo)文件轉(zhuǎn)換為cns可用的mtf和pdb文件。蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)CNS示例3.計(jì)算交叉旋轉(zhuǎn)函數(shù)修改輸入文件cross_rotation.inp:{=======================molecularstructure=========================}{*structurefile*}{===>}structure_infile="model_cns.mtf";{*coordinatefile*}{===>}coordinate_infile="model_cns.pdb";{======================crystallographicdata========================}{*spacegroup*}{*useInternationalTableconventionswithsubscriptssubstitutedbyparenthesis*}{===>}sg="I422";{*unitcellparametersinAngstromsanddegrees*}{+table:rows=1"cell"cols=6"a""b""c""alpha""beta""gamma"+}{===>}a=182.151;{===>}b=182.151;{===>}c=156.690;{===>}alpha=90;{===>}beta=90;{===>}gamma=90;{*reflectionfile*}{===>}reflection_infile=“data.hkl";{===========================outputfiles============================}{===>}rf_list_outfile="cross_rotation.list";%>cns_solve<cross_rotation.inp蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)CNS示例4.檢查交叉旋轉(zhuǎn)函數(shù)的結(jié)果

!index,theta1,theta2,theta3,RF-function(EPSIlon=.25)1346.44776.154326.139.06843346.13776.154280.830.06287285.79071.862253.498.03838282.10069.231273.189.03699343.56974.838345.761.036110344.66173.523298.346.035912343.12491.316279.068.034713167.31995.26294.874.033814285.69671.862207.237.033515281.55069.231228.806.033118160.30074.83881.550.032619108.55474.838101.689.032120300.00376.154261.868.0319選取與其他解差距最大的解蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)CNS示例5.計(jì)算平移函數(shù)修改輸入文件translation.inp:{=======================molecularstructure=========================}{*structurefile*}{===>}structure_infile="model_cns.mtf";{*coordinatefile*}{===>}coordinate_infile="model_cns.pdb";{======================crystallographicdata========================}{*spacegroup*}{*useInternationalTableconventionswithsubscriptssubstitutedbyparenthesis*}{===>}sg="I422";{*unitcellparametersinAngstromsanddegrees*}{+table:rows=1"cell"cols=6"a""b""c""alpha""beta""gamma"+}{===>}a=182.151;{===>}b=182.151;{===>}c=156.690;{===>}alpha=90;{===>}beta=90;{===>}gamma=90;{*reflectionfile*}{===>}reflection_infile=“data.hkl";{*rotationfunctionlistfile*}{===>}rf_list_infile="cross_rotation.list";{===========================outputfiles============================}{===>}output_root="translation";%>cns_solve<translation.inp蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)和X光衍射基礎(chǔ)CNS示例6.檢查平移函數(shù)的結(jié)果theta1theta2theta3transXtransYtransZmonitorpackingR#1287.27.0172.73.00.00-.01.619.3942R#2141.32.15353.6853.81.06-.06.610.3945R#3262.181.94341.7674.6181.5410.62.136.2881R#429.24.6880.23-17.1263.2514.13.147.2670R#589.99.01.00.01-.01.00.619.3942R#6113.871.37102.09-29.3151.121.86.137.3336R#7323.92