乳制品中乳糖的測(cè)定-核磁共振波譜法

《乳制品中乳糖的測(cè)定——核磁共振波譜法》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)編制說(shuō)明一、工作簡(jiǎn)況1.任務(wù)來(lái)源根據(jù)《工業(yè)和信息化部辦公廳關(guān)于印發(fā)2020年第三批行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制修訂和外文版項(xiàng)目計(jì)劃的通知》（工信廳科〔2020〕263號(hào)），《乳制品中乳糖的測(cè)定——核磁共振波譜法》列入行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃項(xiàng)目，項(xiàng)目計(jì)劃號(hào)為2020-1733T-QB，由全國(guó)特殊膳食標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。2.主要工作過(guò)程起草階段標(biāo)準(zhǔn)任務(wù)下達(dá)后，研究院于2020年6月-2021年3月標(biāo)準(zhǔn)起草工作組查閱大量國(guó)內(nèi)外核磁共振定量檢測(cè)技術(shù)方法與標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)對(duì)各方法的原理及特點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比分析，選擇外標(biāo)法進(jìn)行乳制品中乳糖含量的測(cè)定，對(duì)樣品的處理方法、水峰壓制、檢測(cè)條件等進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，通過(guò)穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性等一系列了研究，建立了一維核磁共振氫譜法測(cè)定乳制品中乳糖含量分析方法。2021年4月，召開(kāi)了《乳制品中乳糖的測(cè)定--核磁共振波譜法》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)起草啟動(dòng)會(huì)議，對(duì)基于核磁共振波譜法測(cè)定乳制品中的乳糖的可行性、準(zhǔn)確性等方面進(jìn)行充分討論。2021年4月-2022年5月本方法經(jīng)過(guò)中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司、中國(guó)科學(xué)化學(xué)研究所、首都師范大學(xué)、北京大學(xué)、信陽(yáng)師范學(xué)院、武漢中科牛津波譜技術(shù)有限公司、中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)7家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了方法驗(yàn)證，結(jié)果符合要求。征求意見(jiàn)階段2022年6月，全國(guó)食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心對(duì)《乳制品中乳糖的測(cè)定--核磁共振波譜法》征求意見(jiàn)稿面向社會(huì)進(jìn)行公開(kāi)征求意見(jiàn)。3.主要參加單位及工作組成員所做工作本標(biāo)準(zhǔn)由中輕技術(shù)創(chuàng)新中心有限公司、中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司、中輕檢驗(yàn)認(rèn)證有限公司、中國(guó)科學(xué)化學(xué)研究所、北京大學(xué)、信陽(yáng)師范學(xué)院、武漢中科牛津波譜技術(shù)有限公司、中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)、首都師范大學(xué)等單位共同起草。起草成員：略工作內(nèi)容：組織標(biāo)準(zhǔn)起草及實(shí)驗(yàn)室方法可行性驗(yàn)證；制定研究方案、撰寫標(biāo)準(zhǔn)文本和編制說(shuō)明；負(fù)責(zé)分析方法優(yōu)化建立與驗(yàn)證、樣品檢驗(yàn)分析；收集、整理國(guó)內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)資料，組織、協(xié)調(diào)、審核等工作；協(xié)助提供技術(shù)資料，參與樣品檢測(cè)及數(shù)據(jù)整理；對(duì)本標(biāo)準(zhǔn)涵蓋的全部?jī)?nèi)容提出編寫和修改意見(jiàn)。二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和主要內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)編制原則本標(biāo)準(zhǔn)為首次制定，通過(guò)綜合分析各類乳制品樣品的特點(diǎn)和核磁共振波譜各種檢測(cè)方法的特點(diǎn)及市場(chǎng)發(fā)展需求，以實(shí)際乳制品樣品檢測(cè)數(shù)據(jù)為依據(jù)，經(jīng)過(guò)科學(xué)研究而制定。本標(biāo)準(zhǔn)的制定充分考慮乳制品行業(yè)發(fā)展需求，促進(jìn)乳制品行業(yè)提高產(chǎn)品質(zhì)量，增強(qiáng)企業(yè)的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，保護(hù)消費(fèi)者權(quán)益，確保標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性、先進(jìn)性、可操作性。所以本標(biāo)準(zhǔn)的制定符合產(chǎn)業(yè)發(fā)展的原則，本著先進(jìn)性、科學(xué)性、合理性和可操作性的原則，以標(biāo)準(zhǔn)的目標(biāo)性、統(tǒng)一性、協(xié)調(diào)性、適用性、一致性和規(guī)范性原則來(lái)進(jìn)行本標(biāo)準(zhǔn)的制定工作。本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009等給出的規(guī)則起草。標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容的說(shuō)明范圍本文件規(guī)定了乳制品中乳糖的測(cè)定方法。本文件適用于牛奶、發(fā)酵乳、奶片、奶酪、奶粉中乳糖的測(cè)定。方法檢出限及定量限：固體樣品，奶片、奶酪及奶粉中的乳糖檢出限為0.3g/kg，定量限為1.1g/kg；液體樣品，牛奶、發(fā)酵乳中乳糖檢出限為0.03mg/kg，定量限為0.1mg/kg。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682—2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法JY/T0578—2020超導(dǎo)脈沖傅里葉變換核磁共振波譜測(cè)試方法通則JJF1448—2014超導(dǎo)脈沖傅里葉變換核磁共振譜儀校準(zhǔn)規(guī)范原理脈沖寬度定量（PulseLengthBasedConcentrationDetermination，PULCON）外標(biāo)法是基于信號(hào)強(qiáng)度互易原理，即給定線圈中樣品化合物的NMR信號(hào)強(qiáng)度與90°脈沖寬度成反比。通過(guò)介電特性（離子強(qiáng)度）在樣品間的變化來(lái)補(bǔ)償因線圈靈敏度損失的信號(hào)強(qiáng)度，將外部參考樣品的校準(zhǔn)轉(zhuǎn)移到實(shí)際樣品中。每次定量前，需測(cè)定具有已知濃度的用于校準(zhǔn)的外部參考樣品（如2g/L檸檬酸樣品），計(jì)算定量因子。樣品定量公式如下：（1）式中：C——分析物濃度(g/L)；A——信號(hào)積分面積；MW——分析物的相對(duì)分子質(zhì)量；NH——質(zhì)子數(shù)；NS——掃描次數(shù)；P1——1H90°脈沖寬度；T——檢測(cè)溫度（K）；CF——校正因子；Quantref——外部參考樣品；Sample——待測(cè)分析物。結(jié)果計(jì)算方法校正因子是在NMR波譜儀和測(cè)量條件等因素相互影響情況下對(duì)樣品定量結(jié)果的校正，如校正水信號(hào)的壓制對(duì)測(cè)量過(guò)程的影響等。校正因子的計(jì)算：乳糖標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量與溶液體積之比為縱坐標(biāo)，外標(biāo)法所得的質(zhì)量與溶液體積之比為橫坐標(biāo)，建立線性回歸方程y=ɑx+β，ɑ即校正因子（CF）。乳糖系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液上機(jī)樣品質(zhì)量濃度按照公式（1）計(jì)算:………………（1）式中：CQ——外標(biāo)檸檬酸溶液上機(jī)樣品質(zhì)量濃度，單位為毫克每升（mg/L）；MWQ——檸檬酸摩爾質(zhì)量，單位為克每摩爾（g/mol）；AS——上機(jī)樣品中乳糖定量峰積分面積；AQ——外標(biāo)檸檬酸溶液上機(jī)樣品中檸檬酸定量峰積分面積；nHQ——外標(biāo)檸檬酸溶液上機(jī)樣品中檸檬酸積分區(qū)域?qū)?yīng)的氫原子數(shù)量；nHS——上機(jī)樣品中乳糖積分區(qū)域?qū)?yīng)的氫原子數(shù)量；NSQ——外標(biāo)檸檬酸溶液上機(jī)樣品掃描次數(shù)；NSS——上機(jī)樣品掃描次數(shù)；PS——上機(jī)樣品1H90°脈沖寬度；PQ——外標(biāo)檸檬酸溶液上機(jī)樣品1H90°脈沖寬度；TS——上機(jī)樣品檢測(cè)溫度，單位為開(kāi)爾文（K）；TQ——外標(biāo)檸檬酸溶液上機(jī)樣品檢測(cè)溫度，單位為開(kāi)爾文（K）；MWS——乳糖摩爾質(zhì)量，單位為克每摩爾（g/mol）。回歸方程繪制：由公式（1）計(jì)算得到的乳糖系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液上機(jī)樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，乳糖系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液上機(jī)樣品質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，建立線性回歸方程y=ɑx+β，校正因子（CF）為線性回歸方程的斜率ɑ。固體樣品結(jié)果計(jì)算固體樣品中乳糖的含量按照公式（2）計(jì)算:………（2）式中：CS-S——固體樣品中乳糖的含量，單位為克每千克（g/kg）；CS——由公式（1）計(jì)算所得固體樣品母液中乳糖的含量，單位為毫克每升（mg/L）；V——固體樣品用水定容后的體積，單位為毫升（mL）；ms——稱取的固體樣品質(zhì)量，單位為克（g）；CF——校正因子，線性回歸方程的斜率ɑ。計(jì)算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，小數(shù)點(diǎn)后保留一位數(shù)字。液體樣品結(jié)果計(jì)算：液體樣品中乳糖的含量按照公式（3）計(jì)算:………………（3）式中：CS-L——液體樣品中乳糖的含量，單位為毫克每升（mg/L）；CS——由公式（1）計(jì)算所得液體樣品母液中乳糖的含量，單位為毫克每升（mg/L）；CF——校正因子，線性回歸方程的斜率ɑ；計(jì)算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，小數(shù)點(diǎn)后保留一位數(shù)字。(5)精密度分析選取一份牛奶樣品，采用1HNMR方法，同一天內(nèi)重復(fù)測(cè)定5次，分析該方法的日內(nèi)精密度；重復(fù)測(cè)定5天，測(cè)定結(jié)果取每日測(cè)定量的平均值，進(jìn)行日間精密度分析，結(jié)果如表1所示。由表1可知，以檸檬酸作為PULCON的外標(biāo)參考物，方法的日內(nèi)和日間精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.58%和0.56%。外標(biāo)方法的日內(nèi)和日間RSD均小于1%；由表2可知，方法的日內(nèi)和日間精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.42%和0.94%。外標(biāo)方法的日內(nèi)和日間RSD均小于1%。采用T檢驗(yàn)法分析日內(nèi)與日間同一牛奶樣品中乳糖測(cè)定結(jié)果的差異性，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明日內(nèi)與日間檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性差異（p>0.05），以上表明1HNMR牛奶乳糖檢測(cè)方法滿足精密度的要求。表1檸檬酸作為外標(biāo)方法日間與日內(nèi)精密度（n=5）類型乳糖測(cè)定值（g/L）均值（g/L）RSD（%）12345日內(nèi)33.733.533.833.333.533.60.58%日間33.633.333.30.56%在重復(fù)條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不超過(guò)算術(shù)平均值的10%。(6)檢出限及定量限固體樣品，奶片、奶酪及奶粉中的乳糖檢出限為0.3g/kg，定量限為1.1g/kg；液體樣品，純奶、發(fā)酵乳中乳糖檢出限為0.03mg/kg，定量限為0.1mg/kg。3、解決的主要問(wèn)題本標(biāo)準(zhǔn)的制定解決了國(guó)內(nèi)現(xiàn)行GB5413.5-2016，即萊因—埃農(nóng)氏法（滴定法）和高效液相色譜法，另外還有分光光度法、酶電極法、酶-比色法以及近紅外光譜法等。萊茵-埃農(nóng)氏法（滴定法）所使用的試劑具有一定腐蝕性且對(duì)操作人員的操作技能要求較高，耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣，滴定終點(diǎn)肉眼不易判斷，易產(chǎn)生誤差，結(jié)果不太準(zhǔn)確。直接滴定法應(yīng)用于復(fù)雜乳制品基質(zhì)中存在多種還原糖的情況下，測(cè)定結(jié)果在一定程度上會(huì)受到干擾，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性不足。高效液相色譜法雖然可以避免還原糖對(duì)于檢測(cè)的干擾，但其顯著缺點(diǎn)是耗時(shí)長(zhǎng)、分析成本較高、示差折光檢測(cè)器的選擇性、重復(fù)性和穩(wěn)定性不足，尤其對(duì)于乳制品復(fù)雜基質(zhì)中乳糖的分析較為困難。分光光度法雖然靈敏度較高，但對(duì)檢測(cè)條件的要求比較嚴(yán)格，樣品需在堿性條件下起顯色反應(yīng)，操作繁瑣。酶電極法分析比較容易受葡萄糖、蔗糖等其它還原糖糖類的干擾。酶-比色法靈敏度較高，但顯著缺點(diǎn)是測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)，時(shí)效性難以保證，不易推廣。近紅外光譜法需要大量樣本建立預(yù)測(cè)模型，建立模型過(guò)程比較復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且操作人員需要具備較強(qiáng)的數(shù)據(jù)分析建模能力；此外，由于水分子對(duì)紅外具有較強(qiáng)的吸收，會(huì)在一定程度上干擾液體樣品的檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性不足。本標(biāo)準(zhǔn)的制定充分考慮乳制品行業(yè)發(fā)展需求，促進(jìn)乳制品行業(yè)提高產(chǎn)品質(zhì)量，增強(qiáng)企業(yè)的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，保護(hù)消費(fèi)者權(quán)益，確保標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性、先進(jìn)性、可操作性。三、主要試驗(yàn)（或驗(yàn)證）情況分析針對(duì)核磁共振波譜技術(shù)測(cè)定乳制品中乳糖的含量方法進(jìn)行了系統(tǒng)研究，詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)見(jiàn)附件一。（1）方法線性關(guān)系：以檸檬酸為定量外標(biāo)，在0.05~51.2g/L濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R2大于0.997，線性關(guān)系良好。（2）方法穩(wěn)定性：日內(nèi)與日間RSD分別為0.42%和0.94%；檸檬酸外標(biāo)法日內(nèi)與日間RSD分別為0.58%和0.56%；（3）方法加標(biāo)回收率：檸檬酸外標(biāo)法的回收率在74%~90.3%之間；RSD在0.03%~0.61%范圍之間，說(shuō)明該該方法做了回收率實(shí)驗(yàn)及和國(guó)標(biāo)方法的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，準(zhǔn)確性良好。四、標(biāo)準(zhǔn)中涉及的專利本標(biāo)準(zhǔn)不涉及專利問(wèn)題。五、產(chǎn)業(yè)化情況、推廣應(yīng)用論證和預(yù)期達(dá)到的經(jīng)濟(jì)效果等情況1）乳糖的功效乳糖是由一分子半乳糖和一分子葡萄糖縮合而成的一種雙糖，其甜度約為蔗糖的17%。乳糖可以促進(jìn)新陳代謝，有助于腸道內(nèi)的乳酸菌繁殖增長(zhǎng)以及腸道內(nèi)礦物質(zhì)的吸收，抑制腸內(nèi)有害細(xì)菌的繁殖增長(zhǎng)，防止齲齒。2）產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀近些年來(lái)，隨著我國(guó)乳業(yè)的快速發(fā)展，乳制品質(zhì)量也暴露出各種隱患，其中牛乳中摻假尤為嚴(yán)重，快速、準(zhǔn)確的測(cè)定乳制品所包含的成分對(duì)保證乳制品品質(zhì)、防止摻假以及保障人民身體健康具有重要的意義。由于乳糖在牛乳中含量比較穩(wěn)定，通常為4.5%～5.0%，摻假物的添加容易使乳糖的含量發(fā)生較為明顯的變化，因此，原料乳中是否存在摻假行為可以通過(guò)測(cè)定牛乳中乳糖含量進(jìn)行初步判斷。此外，根據(jù)低乳糖牛奶工藝研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)成人腸道缺乏乳糖酶人群占比大于90%，他們無(wú)法將乳制品中的乳糖轉(zhuǎn)化為半乳糖和葡萄糖，飲用正常乳糖含量乳制品后，會(huì)引起一系列胃脹氣、痙攣、消化不良和腹痛腹瀉等一系列不適癥狀（即乳糖不耐癥）。為滿足眾多乳糖不耐癥消費(fèi)者的需求，低乳糖乳制品開(kāi)始深受廣大消費(fèi)者和食品市場(chǎng)歡迎，低乳糖產(chǎn)品未來(lái)具有十足的市場(chǎng)發(fā)展空間。3）檢測(cè)方法比對(duì)目前乳品中乳糖含量的檢測(cè)主要采用國(guó)標(biāo)GB5413.5-2010，即萊因—埃農(nóng)氏法（滴定法）和高效液相色譜法，另外還有分光光度法、酶電極法、酶-比色法以及近紅外光譜法等。萊茵-埃農(nóng)氏法（滴定法）所使用的試劑具有一定腐蝕性且對(duì)操作人員的操作技能要求較高，耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣，滴定終點(diǎn)肉眼不易判斷，易產(chǎn)生誤差，結(jié)果不太準(zhǔn)確。直接滴定法應(yīng)用于復(fù)雜乳制品基質(zhì)中存在多種還原糖的情況下，測(cè)定結(jié)果在一定程度上會(huì)受到干擾，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性不足。高效液相色譜法雖然可以避免還原糖對(duì)于檢測(cè)的干擾，但其顯著缺點(diǎn)是耗時(shí)長(zhǎng)、分析成本較高、示差折光檢測(cè)器的選擇性、重復(fù)性和穩(wěn)定性不足，尤其對(duì)于乳制品復(fù)雜基質(zhì)中乳糖的分析較為困難。分光光度法雖然靈敏度較高，但對(duì)檢測(cè)條件的要求比較嚴(yán)格，樣品需在堿性條件下起顯色反應(yīng)，操作繁瑣。酶電極法分析比較容易受葡萄糖、蔗糖等其它還原糖糖類的干擾。酶-比色法靈敏度較高，但顯著缺點(diǎn)是測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)，時(shí)效性難以保證，不易推廣。近紅外光譜法需要大量樣本建立預(yù)測(cè)模型，建立模型過(guò)程比較復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且操作人員需要具備較強(qiáng)的數(shù)據(jù)分析建模能力；此外，由于水分子對(duì)紅外具有較強(qiáng)的吸收，會(huì)在一定程度上干擾液體樣品的檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性不足。綜上所述：亟需開(kāi)發(fā)一種能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)乳制品中乳糖含量進(jìn)行快速、準(zhǔn)確且高效的定量方法。4）預(yù)期達(dá)到的社會(huì)效益本標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施，將解決目前乳制品中乳糖含量測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)不足的問(wèn)題，規(guī)范了乳制品行業(yè)生產(chǎn)，為國(guó)內(nèi)外銷售及開(kāi)展對(duì)外技術(shù)、經(jīng)濟(jì)交流提供檢測(cè)依據(jù)。同時(shí)，有利于消費(fèi)者選擇適合的產(chǎn)品，保障我國(guó)乳制品保持健康有序的發(fā)展。在推動(dòng)和指導(dǎo)乳制品開(kāi)發(fā)、產(chǎn)業(yè)升級(jí)發(fā)展方面具有重要社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。六、與國(guó)際、國(guó)外對(duì)比情況本標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)制定過(guò)程中未查到同類國(guó)際、國(guó)外標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)制定過(guò)程中未測(cè)試國(guó)外的樣品、樣機(jī)。本標(biāo)準(zhǔn)從乳糖行業(yè)的實(shí)際情況出發(fā)，參考了國(guó)內(nèi)外相關(guān)資料，體現(xiàn)了科學(xué)性、先進(jìn)性和可操作性原則，在制定過(guò)程中充分考慮國(guó)內(nèi)相關(guān)的法規(guī)要求，結(jié)合乳糖行業(yè)的特點(diǎn)；與相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)調(diào)一致。因此，綜合評(píng)價(jià)本標(biāo)準(zhǔn)水平達(dá)到國(guó)內(nèi)領(lǐng)先水平。在標(biāo)準(zhǔn)體系中的位置，與現(xiàn)行相關(guān)法律、法規(guī)、規(guī)章及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，特別是強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)的協(xié)調(diào)性本專業(yè)領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)體系框架如圖。本標(biāo)準(zhǔn)在工業(yè)發(fā)酵技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)體系中屬于“14食品”-“11-特殊膳食食品”-“99其他”。本標(biāo)準(zhǔn)與現(xiàn)行相關(guān)法律、法規(guī)、規(guī)章及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)調(diào)一致。八、重大分歧意見(jiàn)的處理經(jīng)過(guò)和依據(jù)無(wú)重大分歧意見(jiàn)。九、標(biāo)準(zhǔn)性質(zhì)的建議說(shuō)明建議本標(biāo)準(zhǔn)的性質(zhì)為推薦性行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。十、貫徹標(biāo)準(zhǔn)的要求和措施建議在本標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)審核、批準(zhǔn)發(fā)布之后，由相關(guān)部門組織力量對(duì)本標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行宣貫，在行業(yè)內(nèi)進(jìn)行推廣。建議本標(biāo)準(zhǔn)自發(fā)布6個(gè)月之后開(kāi)始實(shí)施。十一、廢止現(xiàn)行相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的建議無(wú)。十二、其它應(yīng)予說(shuō)明的事項(xiàng)無(wú)。附件一乳制品中乳糖的測(cè)定—核磁共振波譜法方法學(xué)驗(yàn)證研究背景核磁共振（NuclearMagneticResonance，NMR）波譜技術(shù)不僅是一種有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)解析的代表性分析方法，還在1963年首次應(yīng)用于定量分析，確定了26種純有機(jī)物質(zhì)中的分子內(nèi)質(zhì)子比率。近年來(lái)，NMR波譜定量技術(shù)已經(jīng)在藥物分析、代謝組學(xué)、食品分析鑒別等領(lǐng)域得到了較為廣泛的運(yùn)用。與氣相色譜法、高效液相色譜法等傳統(tǒng)分析方法相比，NMR法僅需要很少的樣品量，便可直接地測(cè)定啤酒，果汁，葡萄酒，嬰兒配方奶粉等不同食品基質(zhì)中的多種化合物，而無(wú)需預(yù)先將復(fù)雜混合物中的待測(cè)物質(zhì)分離，具有同時(shí)測(cè)定被測(cè)樣品中多種成分含量等優(yōu)點(diǎn)。乳糖是由一分子半乳糖和一分子葡萄糖縮合而成的一種雙糖，其甜度約為蔗糖的17%。乳糖可以促進(jìn)新陳代謝，有助于腸道內(nèi)的乳酸菌繁殖增長(zhǎng)以及腸道內(nèi)礦物質(zhì)的吸收，抑制腸內(nèi)有害細(xì)菌的繁殖增長(zhǎng)，防止齲齒。近些年來(lái)，隨著我國(guó)乳業(yè)的快速發(fā)展，乳制品質(zhì)量也暴露出各種隱患，其中牛乳中摻假尤為嚴(yán)重，快速、準(zhǔn)確的測(cè)定乳制品所包含的成分對(duì)保證乳制品品質(zhì)、防止摻假以及保障人民身體健康具有重要的意義。由于乳糖在牛乳中含量比較穩(wěn)定，通常為4.5%～5.0%，摻假物的添加容易使乳糖的含量發(fā)生較為明顯的變化，因此，原料乳中是否存在摻假行為可以通過(guò)測(cè)定牛乳中乳糖含量進(jìn)行初步判斷。此外，根據(jù)低乳糖牛奶工藝研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)成人腸道缺乏乳糖酶人群占比大于90%，他們無(wú)法將乳制品中的乳糖轉(zhuǎn)化為半乳糖和葡萄糖，飲用正常乳糖含量乳制品后，會(huì)引起一系列胃脹氣、痙攣、消化不良和腹痛腹瀉等一系列不適癥狀（即乳糖不耐癥）。為滿足眾多乳糖不耐癥消費(fèi)者的需求，低乳糖乳制品開(kāi)始深受廣大消費(fèi)者和食品市場(chǎng)歡迎，低乳糖產(chǎn)品未來(lái)具有十足的市場(chǎng)發(fā)展空間。國(guó)標(biāo)GB28050-2011《預(yù)包裝食品營(yíng)養(yǎng)標(biāo)簽通則》明確規(guī)定：低乳糖，乳糖含量≤2g/100g(mL)；無(wú)乳糖，乳糖含量≤0.5g/100g(mL)，但是目前市場(chǎng)上存在虛假聲稱的低乳糖和無(wú)乳糖奶制品，損害了消費(fèi)者的合法權(quán)益，嚴(yán)重阻礙了中國(guó)乳業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展。目前乳品中乳糖含量的檢測(cè)主要采用國(guó)標(biāo)GB5413.5-2010，即萊因—埃農(nóng)氏法（滴定法）和高效液相色譜法，另外還有分光光度法、酶電極法、酶-比色法以及近紅外光譜法]等。萊茵-埃農(nóng)氏法（滴定法）所使用的試劑具有一定腐蝕性且對(duì)操作人員的操作技能要求較高，耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣，滴定終點(diǎn)肉眼不易判斷，易產(chǎn)生誤差，結(jié)果不太準(zhǔn)確。直接滴定法應(yīng)用于復(fù)雜乳制品基質(zhì)中存在多種還原糖的情況下，測(cè)定結(jié)果在一定程度上會(huì)受到干擾，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性不足。高效液相色譜法雖然可以避免還原糖對(duì)于檢測(cè)的干擾，但其顯著缺點(diǎn)是耗時(shí)長(zhǎng)、分析成本較高、示差折光檢測(cè)器的選擇性、重復(fù)性和穩(wěn)定性不足，尤其對(duì)于乳制品復(fù)雜基質(zhì)中乳糖的分析較為困難。分光光度法雖然靈敏度較高，但對(duì)檢測(cè)條件的要求比較嚴(yán)格，樣品需在堿性條件下起顯色反應(yīng)，操作繁瑣。酶電極法分析比較容易受葡萄糖、蔗糖等其它還原糖糖類的干擾。酶-比色法靈敏度較高，但顯著缺點(diǎn)是測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)，時(shí)效性難以保證，不易推廣。近紅外光譜法需要大量樣本建立預(yù)測(cè)模型，建立模型過(guò)程比較復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且操作人員需要具備較強(qiáng)的數(shù)據(jù)分析建模能力；此外，由于水分子對(duì)紅外具有較強(qiáng)的吸收，會(huì)在一定程度上干擾液體樣品的檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性不足。綜上所述：亟需開(kāi)發(fā)一種能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)乳制品中乳糖含量進(jìn)行快速、準(zhǔn)確且高效的定量方法。2材料與方法2.1材料與試劑乳糖標(biāo)準(zhǔn)品（D-Lactose，≥99.5%，Sigma，USA；疊氮化鈉（高純，NaN3，Biotopped），CIL；3-（三甲基硅烷基）氘代丙酸鈉（Sodium-3-(trimethylsilyl)propionate-2,2,3,3-d4，TSP，98%），CIL；重水（D2O，99.9%），青島騰龍微波科技有限公司；檸檬酸（99%），Vetec；市售乳制品（樣品編號(hào)為1-5號(hào)，其中1-2號(hào)為不同品牌的液體乳制品，3-5號(hào)為不同品牌的固體乳制品，均購(gòu)于某電商平臺(tái)）。2.2儀器與設(shè)備BrukerAvanceIIIHD400MHz波譜儀，德國(guó)BrukerBiospin公司；Bruker自動(dòng)進(jìn)樣器(SampleJet)，德國(guó)BrukerBiospin公司；BrukerSampleJet5mm高通量核磁管，德國(guó)BrukerBiospin公司；渦旋混合器(MX-S)，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司。中佳高速離心機(jī)離心機(jī)，安徽中佳科學(xué)儀器有限公司,KQ2200DE型數(shù)控超聲清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司。2.3方法2.3.1乳糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液乳糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：用天平精確稱取0.512g乳糖標(biāo)準(zhǔn)品于10mL容量瓶，用蒸餾水定容，搖勻后得到51.2g/L乳糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。2.3.2外標(biāo)溶液的配制外標(biāo)溶液：用天平精確稱取0.2g檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品于100mL容量瓶，用蒸餾水定容，搖勻后得到2.0g/L檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。2.3.3緩沖溶液的配制TSP溶液（10.0g/L）：用天平精確稱取0.5gTSP標(biāo)準(zhǔn)品于50mL容量瓶，再加入5mg疊氮化鈉，用重水定容，搖勻后得到10.0g/LTSP標(biāo)準(zhǔn)溶液。2.3.4上機(jī)樣品制備牛奶準(zhǔn)確稱取10g（精確至1mg)牛奶樣品于50ml的燒杯中，再加入35ml水超聲30min溶解，再搖勻之后，用稀鹽酸調(diào)pH值為4.4至4.5后，再加入容量瓶中，潤(rùn)洗燒杯并加水至刻度。搖勻后取5ml，轉(zhuǎn)速為8000r/min（4℃）離心10min.，棄去上層脂肪和蛋白相，取出中間澄清的部分，用濾膜過(guò)濾，準(zhǔn)確量取900μL濾液，100μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的TSP重水溶液，混勻后取600μL于核磁管中待測(cè)。發(fā)酵乳準(zhǔn)確稱取10g（精確至1mg)發(fā)酵乳樣品于50ml的燒杯中，再加入35ml水超聲30min溶解，再搖勻之后，用稀鹽酸調(diào)pH值為4.4至4.5后，再加入容量瓶中，潤(rùn)洗燒杯并加水至刻度。搖勻后取5ml，轉(zhuǎn)速為8000r/min（4℃）離心10min.，棄去上層脂肪和蛋白相，取出中間澄清的部分，用濾膜過(guò)濾，準(zhǔn)確量取900μL濾液，100μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的TSP重水溶液，混勻后取600μL于核磁管中待測(cè)。奶粉準(zhǔn)確稱取1g奶粉樣品（精確至1mg）于50mL燒杯中，再加入35ml水超聲30min溶解，搖勻之后，用稀鹽酸調(diào)pH值為4.4至4.5后，再加入容量瓶中，潤(rùn)洗燒杯并加水至刻度。搖勻后取5ml，轉(zhuǎn)速為8000r/min（4℃）離心10min.，棄去上層脂肪和蛋白相，取出中間澄清的部分，用濾膜過(guò)濾，準(zhǔn)確量取900μL濾液，100μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的TSP重水溶液，混勻后取600μL于核磁管中待測(cè)。奶片將奶片研磨成粉末，再準(zhǔn)確稱取1g樣品（精確至1mg）于50mL燒杯中，再加入35ml水超聲30min溶解，搖勻之后，用稀鹽酸調(diào)pH值為4.4至4.5后，再加入容量瓶中，潤(rùn)洗燒杯并加水至刻度。搖勻后取5ml，轉(zhuǎn)速為8000r/min（4℃）離心10min.，棄去上層脂肪和蛋白相，取出中間澄清的部分，用濾膜過(guò)濾，準(zhǔn)確量取900μL濾液，100μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的TSP重水溶液，混勻后取600μL于核磁管中待測(cè)。奶酪將奶酪研磨，再準(zhǔn)確稱取1g樣品（精確至1mg）于50mL燒杯中，再加入35ml水超聲30min溶解，搖勻之后，用稀鹽酸調(diào)pH值為4.4至4.5后，再加入容量瓶中，潤(rùn)洗燒杯并加水至刻度。搖勻后取5ml，轉(zhuǎn)速為8000r/min（4℃）離心10min.，棄去上層脂肪和蛋白相，取出中間澄清的部分，用濾膜過(guò)濾，準(zhǔn)確量取900μL濾液，100μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的TSP重水溶液，混勻后取600μL于核磁管中待測(cè)。2.3.51HNMR采樣參數(shù)實(shí)驗(yàn)所采用的1HNMR的共振頻率為400.13MHz；檢測(cè)溫度300K（±0.1）；空掃次數(shù)（DS）為4次；掃描次數(shù)（NS）為64次；譜寬（SW）為20.5524；采樣點(diǎn)數(shù)（TD）為65536；接收增益（RG）為16；弛豫延遲（D1）為4s。以3-（三甲基硅基）氘代丙酸鈉（TSP，δ=0）作為化學(xué)位移的零點(diǎn)。標(biāo)準(zhǔn)的脈沖序列（NOESYGPPR）用于水（δ=4.8）的信號(hào)抑制，有效的減弱了水峰對(duì)檢測(cè)的干擾。2.3.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確吸取一定體積的乳糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用蒸餾水逐級(jí)稀釋，配制成濃度分別為51.2g/L、25.6g/L、12.8g/L、6.4g/L、3.2g/L、1.6g/L、0.8g/L、0.4g/L、0.2g/L、0.1g/L、0.05g/L乳糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，并取少量蒸餾水作為空白對(duì)照。分別加入100μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的TSP重水溶液。2.3.7精密度分析本文選取其中一個(gè)樣品溶液，同一天內(nèi)連續(xù)測(cè)定5次，取平均值，分析方法的日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定5天，每天測(cè)定5次并取平均值，分析方法的日間精密度。2.3.8回收率實(shí)驗(yàn)平行稱取25份1號(hào)樣品，用蒸餾水溶解并轉(zhuǎn)移至容量瓶定容。其中5份作為對(duì)照組，其余20份由低至高，分別加入四個(gè)不同濃度水平的乳糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個(gè)水平重復(fù)5次，測(cè)定其1HNMR譜圖，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。2.3.9方法對(duì)比將核磁共振定量法、高效液相色譜行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法GB5413.5—2010和樣品標(biāo)簽標(biāo)注的乳糖的含量進(jìn)行對(duì)比分析，驗(yàn)證分析方法的準(zhǔn)確性。3結(jié)果與分析3.1外標(biāo)法定量脈沖寬度定量（PulseLengthBasedConcentrationDetermination，PULCON）外標(biāo)法是基于信號(hào)強(qiáng)度互易原理，即給定線圈中樣品化合物的NMR信號(hào)強(qiáng)度與90°脈沖寬度成反比。通過(guò)介電特性（離子強(qiáng)度）在樣品間的變化來(lái)補(bǔ)償因線圈靈敏度損失的信號(hào)強(qiáng)度，將外部參考樣品的校準(zhǔn)轉(zhuǎn)移到實(shí)際樣品中。每次定量前，需測(cè)定具有已知濃度的用于校準(zhǔn)的外部參考樣品（如2g/L檸檬酸樣品），計(jì)算定量因子。樣品定量公式如下： （1）式中：C為分析物濃度(mg/L)；A為信號(hào)積分面積；MW為分析物的相對(duì)分子質(zhì)量；NH為質(zhì)子數(shù)；NS為掃描次數(shù)；P1為1H90°脈沖寬度；T為檢測(cè)溫度（K）；CF為校正因子；Quantref為外部參考樣品；Sample為待測(cè)分析物。3.2校正因子（CF）校正因子是在NMR波譜儀和測(cè)量條件等因素相互影響情況下對(duì)樣品定量結(jié)果的校正，如校正水信號(hào)的壓制對(duì)測(cè)量過(guò)程的影響等。3.3校正因子的計(jì)算乳糖標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量與溶液體積之比為縱坐標(biāo)，外標(biāo)法所得的質(zhì)量與溶液體積之比為橫坐標(biāo)，建立線性回歸方程y=ɑx+β，ɑ即校正因子（CF）。3.4乳糖1HNMR譜中乳糖特征峰確認(rèn)、定量峰以及外標(biāo)物的選擇乳糖（D-Lactose）是一種雙糖，由一分子β-D-半乳糖和一分子α-D-葡萄糖在β-1,4-位形成糖苷鍵相連，乳糖在D2O中存在α和β兩種構(gòu)型，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示，其中A代表β-乳糖，B代表α-乳糖。根據(jù)乳糖結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖1），乳糖中葡萄糖基的端基質(zhì)子存在α和β兩種構(gòu)型，且在D2O中可相互轉(zhuǎn)化，不宜用于定量；α-D-半乳糖基的端基質(zhì)子特征信號(hào)峰（δH4.45ppm）與樣品中其它成分信號(hào)峰無(wú)重疊，僅裂分為雙重峰，峰形尖銳，適合定量。但由于α-D-半乳糖基的端基質(zhì)子特征信號(hào)峰（δH4.45ppm）與基質(zhì)水特征信號(hào)峰（δH4.70ppm）距離比較近，考慮到水峰壓制可能對(duì)準(zhǔn)確定量結(jié)果產(chǎn)生的影響，本研究采用校正因子（CF）來(lái)校正水峰信號(hào)的壓制對(duì)定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道一致；此外，YuliaB.Monakhova等人也是選取α-D-半乳糖基的端基質(zhì)子特征信號(hào)峰（δH4.45ppm）作為乳糖定量特征峰，基于核磁共振技術(shù)實(shí)現(xiàn)了普通牛奶和脫乳制品中乳糖含量的準(zhǔn)確定量，因此，綜合考慮后選取α-D-半乳糖基的端基質(zhì)子特征信號(hào)峰（δH4.45ppm）作為乳制品中乳糖含量定量特征峰。圖1乳糖1HNMR譜圖圖2乳糖在水中構(gòu)型PULCON外標(biāo)法定量使用外部參考樣品，將外部參考樣品的校準(zhǔn)轉(zhuǎn)移到實(shí)際樣品中，因此無(wú)需考慮分析物和參考樣品之間的相互作用和信號(hào)重疊，具有較高的精確度和準(zhǔn)確度[27]。此外，采用PULCON外標(biāo)法成本相對(duì)較低，可重復(fù)多次利用，進(jìn)一步降低了核磁共振的檢測(cè)成本，簡(jiǎn)化了前處理操作。檸檬酸結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，根據(jù)1HNMR譜顯示，其僅在δH2.65和δH2.52處存在兩組雙峰，且兩組雙峰對(duì)稱，易于辨認(rèn)，用于定量分析結(jié)果準(zhǔn)確，因此選擇檸檬酸作為外部參考物。3.5實(shí)際乳糖樣品1HNMR譜圖按照2.3.4的條件下測(cè)定得到乳糖食品的1HNMR譜圖（見(jiàn)圖3），上、中、下分別代表的是發(fā)酵乳樣品（a）、奶粉樣品（b）和奶酪樣品（c）的1HNMR檢測(cè)圖，由圖3可知，δ4.44特征信號(hào)峰與周圍質(zhì)子信號(hào)峰未發(fā)生重疊現(xiàn)象。（a）（b）（c）圖3乳糖樣品1HNMR特征峰3.6方法學(xué)考察3.6.1線性關(guān)系以乳糖標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量與溶液體積之比為縱坐標(biāo)，外標(biāo)法所得的質(zhì)量與溶液體積之比為橫坐標(biāo)。檸檬酸作為定量外標(biāo)，乳糖標(biāo)準(zhǔn)品在0.05~51.20g/L濃度范圍內(nèi)，外標(biāo)法乳糖回歸方程為y=1.0441x+0.1365，R2=0.9997，說(shuō)明該方法線性關(guān)系良好。3.6.2精密度分析（日內(nèi)日間精密度）選取一份牛奶樣品，采用1HNMR方法，同一天內(nèi)重復(fù)測(cè)定5次，分析該方法的日內(nèi)精密度；重復(fù)測(cè)定5天，測(cè)定結(jié)果取每日測(cè)定量的平均值，進(jìn)行日間精密度分析，結(jié)果如表1所示。由表1可知，以檸檬酸作為PULCON的外標(biāo)參考物，方法的日內(nèi)和日間精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.58%和0.56%。外標(biāo)方法的日內(nèi)和日間RSD均小于1%；由表2可知，方法的日內(nèi)和日間精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.42%和0.94%。外標(biāo)方法的日內(nèi)和日間RSD均小于1%。采用T檢驗(yàn)法分析日內(nèi)與日間同一牛奶樣品中乳糖測(cè)定結(jié)果的差異性，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明日內(nèi)與日間檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性差異（p>0.05），以上表明1HNMR牛奶乳糖檢測(cè)方法滿足精密度的要求。表1檸檬酸作為外標(biāo)方法日間與日內(nèi)精密度（n=5）類型乳糖測(cè)定值（g/L）均值（g/L）RSD（%）12345日內(nèi)33.733.533.833.333.533.60.58%日間33.633.333.30.56%3.6.3回收率實(shí)驗(yàn)在同一份液體樣品中分別加入7.5g/L、25.0g/L、50.0g/L、100.0g/L四份不同濃度水平的乳糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，同一份奶片及奶酪品中分別加入40.0g/kg、130.0g/kg、250.0g/kg、500.0g/kg四份不同濃度水平的乳糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，同一份奶粉中分別加入50.0g/kg、170.0g/kg、340.0g/kg、680.0g/kg四份不同濃度水平的乳糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個(gè)濃度水平平行重復(fù)5次，采用PULCON檸檬酸外標(biāo)法進(jìn)行定量分析，定量結(jié)果取5次重復(fù)測(cè)定的平均值，如表2至表5所示。外標(biāo)法的回收率在74%~90.3%之間，結(jié)果表明以檸檬酸作為PULCON外標(biāo)參考物的外標(biāo)法，精確度良好，能夠滿足牛奶中乳糖含量的準(zhǔn)確定量測(cè)定要求。表2外標(biāo)法液體樣品方法回收率（n=5)基質(zhì)乳糖含量（g/L）加標(biāo)量（g/L）測(cè)定值（g/L）回收率（%）RSD（%）平均回收率（%）牛奶41.37.547.988.00.2081.825.161.078.50.1550.882.480.90.10100.0121.079.70.12發(fā)酵乳30.17.637.790.30.6181.925.650.882.70.5750.767.674.00.56100.9110.580.40.09表3外標(biāo)法固體樣品方法回收率（n=5)基質(zhì)乳糖含量（g/kg）加標(biāo)量（g/kg）測(cè)定值（g/kg）回收率（%）RSD（%）平均回收率（%）奶片273.537.2304.382.70.2478.9127.4372.677.80.21249.8468.878.20.12497.563奶粉479.449.9524.490.70.2182.6167.8606.777.40.28336.3753.981.60.16670.51020.680.70.06奶酪48.437.37982.10.2083.9127.29249.525883.90.23497.5466.284.00.043.6.4檢出限與定量限固體樣品，奶片、奶酪及奶粉中的乳糖檢出限為0.3g/kg，定量限為1.1g/kg；液體樣品，純奶、發(fā)酵乳中乳糖檢出限為0.03mg/kg，定量限為0.1mg/kg。3.6.5方法對(duì)比應(yīng)用上述已經(jīng)建立的1HNMR外標(biāo)定量方法和國(guó)標(biāo)GB5413.5—2010高效液相色譜法分別對(duì)市售5個(gè)不同種類乳制品樣品基質(zhì)中的乳糖含量進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品平行前處理兩次，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定2次，定量測(cè)定結(jié)果取平均值，結(jié)果如表5所示，進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析1HNMR法與國(guó)標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果的差異。以國(guó)標(biāo)高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果為橫坐標(biāo)，以1HNMR檸檬酸外標(biāo)的定量結(jié)果為縱坐標(biāo)做線性回歸，其線性回歸關(guān)系R2為0.98，結(jié)果表明1HNMR與國(guó)標(biāo)GB5413.5—2010高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果誤差在±5%以內(nèi)，滿足方法的可行性驗(yàn)證要求，研究結(jié)果表明1HNMR定量法可以廣泛用于市售不同種類牛奶中乳糖的含量的準(zhǔn)確測(cè)定。表3核