DB45T 1669-2018 陸川豬肉及其制品的DNA分子鑒定方法

2018-03-25發(fā)布2018-04-25實(shí)施I前言 II 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 1 25儀器與試劑 26鑒定步驟 27結(jié)果判定與表述 38實(shí)驗(yàn)室防污染措施 4附錄A(資料性附錄)陸川豬肉特異性條帶的核苷酸序列信息 5附錄B(規(guī)范性附錄)PCR所用引物序列 6附錄C(資料性附錄)樣品DNA提取方法 7附錄D(資料性附錄)1.8%瓊脂糖凝膠的制備 8本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由廣西大學(xué)提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：廣西大學(xué)、廣西分析測(cè)試研究中心、廣西經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院、廣西陸川縣質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：黃麗、滕建文、楊磊、黃島平、龐理松、夏寧、林葵、韋保耀、龐麗、李中宇。1本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了陸川豬肉及其制品的DNA分子鑒定的術(shù)語和定義、原理、儀器與試劑、鑒定步驟、結(jié)件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)NY/T2993陸川豬來源于NY/T2993中純種陸川豬生豬，以及以純種陸川豬為母系進(jìn)行雜交后的雜元陸川豬生豬的酮注：雜元陸川豬包括二元雜陸川豬和三元雜陸川豬。4原理25.1.5小型離心機(jī)(7000rpm)。5.1.8微量移液器(10HL、100HL、1000HL)。5.1.10一次性PE手套。5.2.52×EsPCRMasterMix(含溴酚藍(lán)染料)。3行，同時(shí)PCR擴(kuò)增陰性對(duì)照和空白對(duì)照。配置體系時(shí)依照表1,最后加入模板DNA。引物(上游)引物(下游)補(bǔ)ddH?O至6.3PCR反應(yīng)程序95℃/5min預(yù)變性；95℃/30s變性，40℃/30s退火，72℃/2min延伸，35～40個(gè)循環(huán)；72℃/5min總延伸；4℃/5min結(jié)束擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析或置于4℃保存?zhèn)溆谩?.4.1陰性對(duì)照：將不含陸川豬血緣的豬肉或肉制品按6.1提取DNA,按6.2配置PCR反應(yīng)體系，按6.3程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。6.4.2空白對(duì)照：以滅菌水代替DNA模板，按6.2配置PCR反應(yīng)體系，按6.3程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。的瓊脂糖凝膠(1.8%瓊脂糖凝膠制備參見附錄D)的上樣孔中，同時(shí)加入3.5μL的Marker,用1×TAE作及時(shí)進(jìn)行紫外拍照觀察，應(yīng)將凝膠放入1×TAE緩沖液中暫時(shí)保存，但不宜超過4h,超4將電泳后的瓊脂糖凝膠置于凝膠成像儀內(nèi)觀察，觀察測(cè)試樣品瓊脂糖電泳檢測(cè)圖，按照以下方法進(jìn)——如測(cè)試樣品WW12目標(biāo)基因瓊脂糖電泳檢測(cè)有1500bp對(duì)應(yīng)條帶，則被檢樣品為陸川豬肉及其——如測(cè)試樣品WM12目標(biāo)基因瓊脂糖電泳檢測(cè)無1500bp對(duì)應(yīng)條帶，則被檢樣品為非陸川豬肉及其制品；——如測(cè)試樣品WM12目標(biāo)基因瓊脂糖電泳檢測(cè)有1500bp對(duì)應(yīng)條帶，WM14目標(biāo)基因瓊脂糖電泳檢測(cè)沒有800bp~900bp對(duì)應(yīng)條帶，則被檢樣品為純種陸川豬肉及其制品；——如測(cè)試樣品WM12目標(biāo)基因瓊脂糖電泳檢測(cè)有1500bp對(duì)應(yīng)條帶，WM14目標(biāo)基因瓊脂糖電泳檢測(cè)有800bp~900bp對(duì)應(yīng)條帶，則被檢樣品為雜元陸川豬肉及其制品。8實(shí)驗(yàn)室防污染措施按照GB/T27403的規(guī)定執(zhí)行。5(資料性附錄)ACAAAGGGCTACAAACCAAAGCCTCATCCTGCACCCTTGCCTCAAGCAGGATGAAAGCTCAGAAACTCCTCTCTCTTTCTTGCCTCTGCTGTTTATTCAGCAGGCCTGGGCTCAGTTCCCCAGAGAGTGTACCACCATTGAGGCTTTGAGGCCCAGATCTGTCCCCACTGTCTGGGCCCGGGACTGACCGCTGTGGCTTCTCCTCAGGGAGGGGCAGGTGTGAGG6(規(guī)范性附錄)引物名稱引物序列上游5'-CACCACCACGC-3'下游5'-CACCACCACGC-3'上游5'-CTCCTCCTCGC-3'下游5'-CTCCTCCTCGC-3'7(資料性附錄)C.2.2向離心管中加入400μ或水浴中25min~30min,其間每間隔10min渦旋混勻一次。C.2.3加入400μLBufferL2,顛倒混勻至分層消失，置于65℃金屬浴或水浴中10min,然后12000C.2.4將上清液用移液器轉(zhuǎn)移到離心柱中，再將離心柱放入收集管中，12000rpm室溫離心1min,棄C.2.5向離心柱中加入500μLBufferPW,12000rpm室溫離心1min,棄掉收集管中的廢液。C.2.6再向離心柱中加入700μLBufferWB,12000rpm離心1min,棄掉收集管中的廢液；將離心柱放回收集管中，12000rpm空管離心2min,棄掉離心柱中殘余的BufferWB。C.2.7將離心柱移至新的1.5mL離心管中，向膜中央懸空滴加100μL已于65℃預(yù)熱的BufferEB,室溫放置5min,12000rpm離心1min,收8(資料性附錄)D.1將凝膠托架兩端用膠帶封閉并水平放置在工作臺(tái)上，放上梳子