OPA-FMOC聯(lián)用柱前衍生化法氨基酸類成分測定原理及其在藥物分析中的應用

OPA-FMOC聯(lián)用柱前衍生化法氨基酸類成分測定原理及其在藥物分析中的應用氨基酸類成分分析方法——柱前衍生化法介紹Contents衍生化反應概述及原理1流動相及衍生試劑的配制2自動化衍生過程3應用實例4試驗注意事項5衍生化反應概述及原理由于大多數(shù)氨基酸缺乏天然的紫外或熒光吸收，因此通常的做法是進行衍生化處理。柱后衍生化該方法多用于離子交換色譜，先通過陽離子交換樹脂分離，然后再用茚三酮衍生化，在可見光區(qū)檢測。衍生化法柱前衍生化該方法多用于液相色譜，先用衍生試劑與氨基酸進行衍生化反應，然后再用紫外或熒光檢測器檢測。柱后衍生化法1951年Moore和Stein研制出了第一臺氨基酸分析儀，將未衍生的氨基酸用離子交換色譜分離后，用茚三酮進行柱后衍生，在可見光區(qū)檢測。1958年由Beckman開發(fā)并推出了全自動分析儀。新一代的氨基酸分析儀已將分析時間縮短到大約110分鐘。但是，因為需要專門的儀器，且儀器價格昂貴，這大大限制了該方法的推廣應用。德國曼默博爾公司A300全自動氨基酸分析儀參考價：約100萬RMB柱前衍生化法2,4-二硝基氟苯(FDNB)法6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯(AQC)法鄰苯二甲醛(OPA)法異硫氰酸苯酯(PITC)衍生法丹酰氯(Dan-Cl)法氯甲酸芴甲酯(FMOC)法柱前衍生試劑種類較多，且各方法均有其優(yōu)缺點，還沒有一種很完善的柱前衍生試劑?，F(xiàn)在大多以OPA法、FMOC法和AQC法為主。柱前衍生化法OPA柱前衍生化法原理：OPA在3-巰基丙酸的存在下與氨基酸反應優(yōu)點：過量衍生試劑不干擾檢測

缺點：1、不能與二級氨基酸（如脯氨酸）反應2、衍生試劑本身不穩(wěn)定，易氧化變質338nm處無吸收在338nm處有吸收1971年由Roth首次提出用OPA對氨基酸進行柱前衍生FMOC柱前衍生化法原理：優(yōu)點：可同時與一級和二級氨基酸反應

缺點：衍生試劑本身（FMOC-Cl）及其水解產物（FMOC-OH）對檢測有干擾

266nm處有吸收262nm處有吸收OPA-FMOC聯(lián)用柱前衍生化法讓樣品先與OPA試劑充分反應，將一級氨基酸全部反應完全，接著樣品中剩余的二級氨基酸再與FMOC反應。由于FMOC、FMOC衍生物和反應副產物比任何OPA衍生物的疏水性都強，所以它們不會干擾任何一級氨基酸的檢測。因為只有幾種FMOC衍生物，所以可以使用簡單的梯度將這些氨基酸與反應副產物和FMOC分離。1986年惠普/安捷倫將OPA和FMOC衍生反應依次結合，實現(xiàn)了氨基酸的全自動衍生、色譜分離和檢測。OPA-FMOC聯(lián)用柱前衍生化法流動相及衍生試劑的配制流動相的配制

衍生試劑的配置

衍生試劑可以從安捷倫公司直接購買，1mL安瓿瓶包裝，即開即用，不需要做其他處理，但價格較為昂貴；自行配制時，因衍生反應純度要求較高，需購買Sigma原裝試劑，包括OPA(鄰苯二甲醛)、FMOC-Cl(芴甲氧酰氯)和MPA(3-巰基丙酸)。流動相的配制流動相用HAc調節(jié)PH值至7.20±0.05

0.02MNaAc2LTHF7mLTEA400uL0.02MNaAc200mLACN400mLMeOH400mLA相B相PH值是試驗最關鍵的影響因素試劑配制試劑配制OPA：20mg硼酸緩沖液：1.75mLACN：0.25mLMPA：32uLText0.4M硼酸緩沖鹽取一定量硼酸，用水溶解，再用40%NaOH溶液調PH值至10.2OPA試劑FMOC試劑FMOC：20mgACN：4mL柱前自動衍生過程從1號瓶中吸取0uL水純水純水硼酸鹽OPAFMOC樣品柱前自動衍生過程從3號瓶中吸取5uL硼酸鈉-氫氧化鈉緩沖液衍生反應所需的環(huán)境，PH值在10.5左右純水純水硼酸鹽OPAFMOC樣品柱前自動衍生過程從1號瓶中吸取0uL水純水純水硼酸鹽OPAFMOC樣品柱前自動衍生過程從4號瓶吸取1uLOPA試劑純水純水硼酸鹽OPAFMOC樣品柱前自動衍生過程從1號瓶中吸取0uL水純水純水硼酸鹽OPAFMOC樣品柱前自動衍生過程從6號瓶吸取樣品1uL，充分混合約2min純水純水硼酸鹽OPAFMOC樣品柱前自動衍生過程從1號瓶中吸取0uL水純水純水硼酸鹽OPAFMOC樣品柱前自動衍生過程從5號瓶抽取FMOC試劑1uL，充分混合約2min純水純水硼酸鹽OPAFMOC樣品柱前自動衍生過程從1號瓶中吸取0uL水純水純水硼酸鹽OPAFMOC樣品柱前自動衍生過程從2號瓶吸取水32uL，以最大速度充分混合3次，然后進樣純水純水硼酸鹽OPAFMOC樣品應用實例注射液中氨基酸含量的測定清開靈參麥得力生丹紅色譜柱及流動相梯度色譜柱：AgilentSB-C18柱（4.6mm×250mm,5um）時間(min)流動相B（%）流速（ml·min-1）0.001.012.0221.015.0221.030.0701.035.0701.038.01001.549.01001.552.001.0流動相梯度：每次實驗前要根據實際情況，對梯度進行微調樣品配制氨基酸混合標準品溶液的配制

精密稱取各氨基酸標準品5-10mg，一起置入容量瓶中，用1%鹽酸溶液溶解，并定容至100mL。用0.45um針頭濾器濾過，即得。游離氨基酸供試液的配制

取各注射劑原液，直接用0.45um針頭濾器濾過，即得。水解氨基酸供試液的配制

取各注射液1mL于帶蓋試管中，加入6mol/L鹽酸溶液9mL，充氮氣封口，蓋緊瓶蓋，置于110℃恒溫干燥箱中水解24h，取出后將樣品倒入蒸發(fā)皿中，70℃水浴中蒸干，然后加入1%鹽酸溶液2mL，超聲10min，用0.45um針頭濾器濾過，即得。標準品色譜圖注：1ASP天冬氨酸；2GLU谷氨酸；3ASN天冬酰胺；4SER絲氨酸；5GLY甘氨酸；6THR蘇氨酸；7CYS胱氨酸；8ALA丙氨酸；9ARG精氨酸；10TYR酪氨酸；11MET蛋氨酸；12VAL纈氨酸；13TRY色氨酸；14PHE苯丙氨酸；15ILE異亮氨酸；16LEU亮氨酸；17LYS賴氨酸；18PRO脯氨酸精密度考察結果顯示混合標準品精密度良好穩(wěn)定性考察分別測定了放置0h、2h、4h、8h、12h、24h后混合標準品樣品，結果顯示混合標準品穩(wěn)定性良好線性關系考察圖：ASP標準曲線（濃度范圍：0.0036～0.1078mg/ml）考察了從混合標準品母液一直到稀釋30倍的一系列樣品，結果顯示，各氨基酸在各自濃度范圍內線性關系良好。廠家一清開靈樣品色譜圖游離氨基酸水解氨基酸廠家清開靈樣品色譜圖游離氨基酸水解氨基酸得力生樣品色譜圖游離氨基酸水解氨基酸丹紅樣品色譜圖游離氨基酸水解氨基酸參麥樣品色譜圖游離氨基酸水解氨基酸各注射液氨基酸樣品測定結果比較單位：mg/mL試驗注意事項