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第十一章動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識優(yōu)選第十一章動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識一、實(shí)驗(yàn)室設(shè)置基本實(shí)驗(yàn)室:準(zhǔn)備室+接種室+培養(yǎng)室輔助實(shí)驗(yàn)室:細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室+生化分析室二、常用器具的清洗消毒方法1、清洗(1)玻璃器材:初次使用的玻璃器皿:洗滌劑/肥皂水洗滌1~5%HCl浸泡過夜蒸餾水洗2~3次使用過的玻璃器皿立即浸入水中待洗
一般玻璃儀器:肥皂水/洗滌劑洗滌蒸餾水洗滌2~3次量器:鉻酸洗液浸泡4~6小時(shí)蒸餾水洗滌2~3次二、常用器具的清洗消毒方法1、清洗(2)橡膠器材初次使用:0.5mol/LNaOH15min0.5mol/LHCl15min自來水煮沸蒸餾水煮沸20min用過的橡膠制品:同玻璃器材的清洗二、常用器具的清洗消毒方法1、清洗(3)塑料器皿2%NaOH浸泡過夜2~5%HCl浸泡30min蒸餾水洗(4)金屬器皿洗衣粉洗滌蒸餾水洗酒精棉球擦拭晾干二、常用器具的清洗消毒方法2、消毒物理:熱力滅菌、電離輻射、紫外滅菌化學(xué):重金屬鹽、氧化劑、表面活性劑生物:抗生素三、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用液培養(yǎng)基平衡鹽其他(雜用液)(一)、培養(yǎng)基1、組成成分糖:葡萄糖無機(jī)離子與微量元素:如鐵、鋅、硒、銅、錳、鉬、釩氨基酸:12種必需氨基酸,精氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、酪氨酸和纈氨酸。L型。(一)、培養(yǎng)基1、組成成分:維生素:至少8種,生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素、維生素B12。促生長因子及激素:如胰島素(insulin),它能促進(jìn)細(xì)胞利用葡萄糖和氨基酸。(一)、培養(yǎng)基2、pH:大多數(shù)細(xì)胞的適宜pH為7.2~7.4,一般不能超過6.8~7.6。造成培養(yǎng)基pH波動(dòng)的主要物質(zhì)是細(xì)胞代謝產(chǎn)生的CO2,在封閉式培養(yǎng)過程中CO2與水結(jié)合產(chǎn)生碳酸,培養(yǎng)基pH很快下降。(一)、培養(yǎng)基2、pH:調(diào)節(jié):使用NaHCO3-CO2緩沖系統(tǒng)(合成培養(yǎng)基中,或Hepes),再通過穩(wěn)定調(diào)節(jié)培養(yǎng)箱中CO2氣體的濃度(5%),使之與培養(yǎng)基中的NaHCO3處于平衡狀態(tài)。NaHCO3
+H2O←→Na++HO-+H2O+CO2↑當(dāng)[CO2]能夠保持相對穩(wěn)定時(shí),上述反應(yīng)就可達(dá)到平衡,[OH-]也相對恒定,即pH相對恒定。(一)、培養(yǎng)基3、分類天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基(一)、培養(yǎng)基(1)、天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基:主要指來自動(dòng)物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基,如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。組織培養(yǎng)技術(shù)建立的早期,體外培養(yǎng)細(xì)胞都是利用天然培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì),滲透壓、pH等也與體內(nèi)環(huán)境相似,但制作過程復(fù)雜、批間差異大,因此逐漸為合成培養(yǎng)基所替代。目前仍然廣泛使用的天然培養(yǎng)基是血清(serum),另外組織提取液、促進(jìn)細(xì)胞貼壁的膠原類物質(zhì)在培養(yǎng)某些特殊細(xì)胞時(shí)也不可缺少。(一)、培養(yǎng)基(1)、天然培養(yǎng)基血清的種類:主要是牛血清,在培養(yǎng)某些特殊細(xì)胞時(shí)也用人血清、馬血清等。牛血清還分為小牛血清、新生牛血清和胎牛血清。一般使用的為小牛血清,小牛血清取自出生10~30天的小牛。造成培養(yǎng)基pH波動(dòng)的主要物質(zhì)是細(xì)胞代謝產(chǎn)生的CO2,在封閉式培養(yǎng)過程中CO2與水結(jié)合產(chǎn)生碳酸,培養(yǎng)基pH很快下降。用過的橡膠制品:同玻璃器材的清洗促生長效果檢測:克隆形成率測定法和連續(xù)傳代培養(yǎng)測定法。因此,培養(yǎng)設(shè)施不能設(shè)在通風(fēng)場所。5mol/LHCl15min自來水煮沸蒸餾水煮沸20min可滅活后分裝,使用時(shí)4℃融化。IMDM(Iscove’smodifiedDulbecco’smedium):適合于細(xì)胞密度較低、生長較困難的情況(3)、無蛋白培養(yǎng)基(proteinfreemedium,PFM)幾種常用的平衡鹽溶液:真菌污染對細(xì)胞的影響及污染物的檢測(4)、限定化學(xué)成分培養(yǎng)基(CDM):是指培養(yǎng)基中的所有成分都是明確的,它不含有動(dòng)物蛋白,也不添加植物水解物,而是使用一些已知結(jié)構(gòu)與功能的小分子化合物,如短肽、植物激素等。5mol/LHCl15min自來水煮沸蒸餾水煮沸20min不含動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基。培養(yǎng)細(xì)胞一旦發(fā)生污染多數(shù)將無法挽回。DMEM(Dulbecco’smodifiedEaglemedium)(一)、培養(yǎng)基(1)、天然培養(yǎng)基血清的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn):血清質(zhì)量的鑒定一般包括理化性質(zhì):如滲透壓、pH,球蛋白、血紅蛋白含量越低血清質(zhì)量越高。微生物檢測:包括細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等促生長效果檢測:克隆形成率測定法和連續(xù)傳代培養(yǎng)測定法。(一)、培養(yǎng)基(1)、天然培養(yǎng)基血清的使用與儲存:大部分血清在使用之前必須經(jīng)過滅活處理,即56℃放置30分鐘。(滅活的目的是去除血清中的補(bǔ)體成分,避免補(bǔ)體對細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用。滅活也會(huì)損失一些對細(xì)胞有利的成分如生長因子,因此也有人提出血清不經(jīng)滅活直接用于培養(yǎng))儲存條件:血清一般儲存于-20℃,同時(shí)應(yīng)避免反復(fù)凍融??蓽缁詈蠓盅b,使用時(shí)4℃融化。(一)、培養(yǎng)基(1)、天然培養(yǎng)基血清使用的缺點(diǎn):批次差異。鼠尾膠原:它的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞的貼壁,特別是對上皮類細(xì)胞。組織浸出液:Hank’s浸30min
(一)、培養(yǎng)基(2)、合成培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基無蛋白培養(yǎng)基(一)、培養(yǎng)基(2)、合成培養(yǎng)基①基本培養(yǎng)基:最初研制合成培養(yǎng)基,就希望使其完全替代天然培養(yǎng)基,但結(jié)果卻沒有象人們所預(yù)期的那樣,許多合成培養(yǎng)基都只能使體外培養(yǎng)細(xì)胞短暫生存,只有在添加了少量天然培養(yǎng)基(血清)之后,細(xì)胞才能在其中長期生長繁殖。
這類合成培養(yǎng)基稱為“基本培養(yǎng)基”或“通用培養(yǎng)基”,在添加了一定比例的血清之后,稱之為“完全培養(yǎng)基”。(一)、培養(yǎng)基(2)、合成培養(yǎng)基①基本培養(yǎng)基:常用基本培養(yǎng)基199培養(yǎng)基低限量基礎(chǔ)培養(yǎng)基(minimumessentialmedia,MEM)DMEM(Dulbecco’smodifiedEaglemedium)IMDM(Iscove’smodifiedDulbecco’smedium):適合于細(xì)胞密度較低、生長較困難的情況RPMI1640(一)、培養(yǎng)基(2)、合成培養(yǎng)基②無血清培養(yǎng)基雖然基礎(chǔ)培養(yǎng)基加少量血清所配制的完全培養(yǎng)基可以滿足大部分細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的要求,但對有些實(shí)驗(yàn)卻不適合,如觀察一種生長因子對某種細(xì)胞的作用,又如測定某種細(xì)胞在培養(yǎng)過程中分泌某種物質(zhì)(抗體、生長因子)的能力。無血清培養(yǎng)基:基礎(chǔ)培養(yǎng)液+添加組分。青霉素主要對革蘭陽性菌有效,鏈霉素主要對革蘭陰性菌有效。一般使用的為小牛血清,小牛血清取自出生10~30天的小牛。血清的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn):血清質(zhì)量的鑒定一般包括三、培養(yǎng)物的污染及防止5mol/LHCl15min自來水煮沸蒸餾水煮沸20min不含動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基。三、培養(yǎng)物的污染及防止不含動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基?;瘜W(xué)物質(zhì)(影響細(xì)胞生存、非細(xì)胞所需的化學(xué)成分)三、培養(yǎng)物的污染及防止二、常用器具的清洗消毒方法一般使用的為小牛血清,小牛血清取自出生10~30天的小牛。污染較嚴(yán)重,細(xì)胞增值停止,分裂象消失,細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量堆積物,細(xì)胞變圓、脫壁。生物(真菌、細(xì)菌、病毒和支原體)常用的是青鏈霉素,俗稱“雙抗溶液”。(一)、培養(yǎng)基(2)、合成培養(yǎng)基②無血清培養(yǎng)基添加組分包括以下幾大類物質(zhì):促貼壁物質(zhì):一般是細(xì)胞外基質(zhì),如纖連蛋白(FN)、層粘連蛋白(LN)等。促生長因子及激素酶抑制劑:最常用的是大豆胰酶抑制劑。結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白:常見的有轉(zhuǎn)鐵蛋白和牛血清白蛋白。微量元素:硒是最常見的(一)、培養(yǎng)基(3)、無蛋白培養(yǎng)基(proteinfreemedium,PFM)不含動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基。添加了植物水解物以替代動(dòng)物激素、生長因子的作用。(4)、限定化學(xué)成分培養(yǎng)基(CDM):是指培養(yǎng)基中的所有成分都是明確的,它不含有動(dòng)物蛋白,也不添加植物水解物,而是使用一些已知結(jié)構(gòu)與功能的小分子化合物,如短肽、植物激素等。(二)、平衡鹽溶液平衡鹽溶液:(balancedsaltsolution,BSS)主要由無機(jī)鹽、葡萄糖組成。作用:具有維持滲透壓,調(diào)控酸、堿平衡的作用提供細(xì)胞生存所需的能量和無機(jī)離子成分用于洗滌組織、細(xì)胞配制各種培養(yǎng)用液(二)、平衡鹽溶液幾種常用的平衡鹽溶液:RingerPBSTyrodeEarleHank’sD-Hank’sDulbecco(三)、其他培養(yǎng)用液1、消化液胰酶溶液(0.1%~0.5,pH8.0)膠原酶溶液(0.1~0.3mg/L或200U/mL,pH6.5)EDTA溶液(0.02%)上述溶液可混合使用(三)、其他培養(yǎng)用液2、pH調(diào)整液NaHCO3溶液(常用5.6%或7.4%的NaHCO3溶液)HEPES液(HEPES是一種弱酸,中文名稱是羥乙基哌嗪乙硫磺酸,使用的終濃度為0.01~0.05mol/L;可維持pH在7.0左右)。(三)、其他培養(yǎng)用液3、谷氨酰胺補(bǔ)充液谷氨酰胺在細(xì)胞代謝過程中起重要作用,是合成培養(yǎng)基的重要成分。由于谷氨酰胺容易降解,所以都是在使用前添加。谷氨酰胺使用終濃度為0.002mol/L。一般配制為100倍濃縮液,配制時(shí)應(yīng)加溫至30℃,完全溶解后過濾除菌,分裝至小瓶,儲存于-20℃。(三)、其他培養(yǎng)用液4、抗生素液常用的是青鏈霉素,俗稱“雙抗溶液”。青霉素主要對革蘭陽性菌有效,鏈霉素主要對革蘭陰性菌有效。青霉素使用的終濃度為100000U/L,鏈霉素使用的終濃度為0.1g/L。一般配制成100倍濃縮液,可用PBS或培養(yǎng)基配制。三、培養(yǎng)物的污染及防止按現(xiàn)代的觀念,凡是混入培養(yǎng)環(huán)境中對細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物都應(yīng)該視為污染。根據(jù)這一概念,組織培養(yǎng)污染物應(yīng)包括生物(真菌、細(xì)菌、病毒和支原體)化學(xué)物質(zhì)(影響細(xì)胞生存、非細(xì)胞所需的化學(xué)成分)細(xì)胞(非同種的其他細(xì)胞)。其中以微生物最為多見。另外,隨著使用細(xì)胞種類增多,不同細(xì)胞交叉污染,尤其是Hela細(xì)胞的污染也時(shí)有發(fā)生,從而造成細(xì)胞不純。三、培養(yǎng)物的污染及防止一、污染途徑1空氣:空氣是微生物及塵埃顆粒傳播的主要途徑。因此,培養(yǎng)設(shè)施不能設(shè)在通風(fēng)場所。無菌操作應(yīng)在凈化臺內(nèi)進(jìn)行,工作時(shí)要帶口罩,以免因講話、咳嗽等使外界污染進(jìn)入操作面,造成污染。2器材:各種培養(yǎng)器皿、器械消毒不徹底和洗刷不干凈導(dǎo)致污染,另外需要對培養(yǎng)箱進(jìn)行定期消毒,防止形成污染3操作:實(shí)驗(yàn)操作無菌觀念不強(qiáng),培養(yǎng)兩種細(xì)胞以上時(shí),交叉使用吸管或培養(yǎng)液、瓶等有可能導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。
4血清:有些血清在生產(chǎn)時(shí)就已經(jīng)被支原體或病毒等污染,變成了污染。5組織樣本三、培養(yǎng)物的污染及防止污染對培養(yǎng)細(xì)胞的影響培養(yǎng)細(xì)胞一旦發(fā)生污染多數(shù)將無法挽回。細(xì)胞污染早期或污染程度較輕時(shí),如果能及時(shí)去除污染物,部分細(xì)胞有可能恢復(fù)。污染物持續(xù)存在培養(yǎng)環(huán)境中,輕者細(xì)胞生長緩慢,分類象減少,細(xì)胞變得粗糙,輪廓增強(qiáng)細(xì)胞漿出現(xiàn)顆粒;污染較嚴(yán)重,細(xì)胞增值停止,分裂象消失,細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量堆積物,細(xì)胞變圓、脫壁。一般配制為100倍濃縮液,配制時(shí)應(yīng)加溫至30℃,完全溶解后過濾除菌,分裝至小瓶,儲存于-20℃。真菌污染對細(xì)胞的影響及污染物的檢測用相差顯微鏡觀察,可見滿視野都是點(diǎn)狀的細(xì)菌顆粒,原來的清晰培養(yǎng)背景變得模糊,大量的細(xì)菌甚至可以覆蓋細(xì)胞,對細(xì)胞的生存構(gòu)成威脅。5mol/LHCl15min自來水煮沸蒸餾水煮沸20min添加了植物水解物以替代動(dòng)物激素、生長因子的作用。輔助實(shí)驗(yàn)室:細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室+生化分析室一般使用的為小牛血清,小牛血清取自出生10~30天的小牛。目前仍然廣泛使用的天然培養(yǎng)基是血清(serum),另外組織提取液、促進(jìn)細(xì)胞貼壁的膠原類物質(zhì)在培養(yǎng)某些特殊細(xì)胞時(shí)也不可缺少。無血清培養(yǎng)基:基礎(chǔ)培養(yǎng)液+添加組分。不含動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì),滲透壓、pH等也與體內(nèi)環(huán)境相似,但制作過程復(fù)雜、批間差異大,因此逐漸為合成培養(yǎng)基所替代。5mol/LHCl15min自來水
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