丙型肝炎病毒(HCV)核酸定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(PCR-熒光探針法)

丙型肝炎病毒（HCV）核酸定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（PCR-熒光探針法）1.目的：規(guī)范HCV-RNA（PCR）檢測(cè)操作流程，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。2.應(yīng)用范圍：HCV-RNA熒光定量檢測(cè)。3.職責(zé):3.1文件編寫：實(shí)驗(yàn)室技術(shù)員。3.2文件審核：實(shí)驗(yàn)室主管。3.3文件審批：實(shí)驗(yàn)室主任。3.4執(zhí)行：PCR實(shí)驗(yàn)室所有工作人員。4.參考文獻(xiàn)：4.1中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司丙型肝炎病毒核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）說明書。4.2中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)DA7600型使用說明書。5.內(nèi)容：5.1檢測(cè)方法：PCR-熒光探針法5.2實(shí)驗(yàn)原理：用一對(duì)丙型肝炎病毒特異性引物和一條丙型肝炎病毒特異性熒光探針，配以逆轉(zhuǎn)錄液、逆轉(zhuǎn)錄酶、PCR反應(yīng)液、耐熱DNA聚合酶（Taq酶）、四種核苷酸單體（dNTPs）等成分，先將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再通過PCR體外擴(kuò)增法，即高溫變性、低溫退火、適溫延伸進(jìn)行DNA擴(kuò)增，并對(duì)PCR全過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),從而檢測(cè)丙型肝炎病毒RNA。主要用于HCV病毒感染的輔助診斷及其療效監(jiān)測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)。5.3性能參數(shù)：5.3.1精密度：檢測(cè)下限為1.0x103copies/ml。5.3.2線性范圍：1.0x103～1.0x108copies/ml。5.4標(biāo)本采集：5.4.1使用標(biāo)本類型：血清。5.4.2標(biāo)本采集：由合作單位按照以下要求進(jìn)行采集，采集后及時(shí)分離出血清在2～8℃條件下保存。用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血2ml，注入無菌的干燥玻璃管，室溫（22～25℃）放置30～60min，全血標(biāo)本可自發(fā)完全凝集析出血清，或直接使用水平離心機(jī)，1500rpm離心5min；吸取上層血清，轉(zhuǎn)移至1.5ml滅菌離心管。5.4.3標(biāo)本保存和運(yùn)送：分離后的血清在2～8℃條件下保存應(yīng)不超過72小時(shí)，-20℃可保存1個(gè)月，要長(zhǎng)期保存的需分裝后儲(chǔ)存于-70℃。應(yīng)避免反復(fù)凍融。標(biāo)本運(yùn)送采用0℃冰壺。5.4.4標(biāo)本拒收標(biāo)準(zhǔn)：污染、嚴(yán)重溶血、脂血類或肝素抗凝劑標(biāo)本。5.5設(shè)備和試劑：5.5.1設(shè)備：DA7600熒光定量PCR儀、低速水平離心機(jī)、生物安全柜、臺(tái)式高速離心機(jī)、移液器、混勻器、干式恒溫器、冰箱（4℃、-20℃）、移動(dòng)/固定紫外燈、冷凍離心機(jī)。5.5.2試劑：5.5.2.1試劑品牌：中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司丙型肝炎病毒核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）5.5.2.2試劑批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字2014第3400033號(hào)。5.5.2.3試劑組成：組分名稱規(guī)格數(shù)量主要成分核酸提取試劑RNA提取液A200μL/管1二氧化硅、DEPC水RNA提取液B5mL/管2GuSCN、Tris-HCL、EDTA、Triton-100DEPCH2O3ml/瓶1DEPCPCR擴(kuò)增試劑HCV內(nèi)標(biāo)溶液100μL/管1含內(nèi)標(biāo)片段的病毒樣顆粒及穩(wěn)定劑HCV反應(yīng)液A270μL/管1引物、探針、Tris鹽酸BufferHCV反應(yīng)液B30μL/管1Taq酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNasin質(zhì)控品陰性質(zhì)控品200μL/管1陰性血漿HCV強(qiáng)陽性質(zhì)控品200μL/管1HCV陽性血漿HCV臨界陽性質(zhì)控品200μL/管1HCV陽性血漿5.5.2.4試劑保存和有效期：保存于-20±5℃；有效期9個(gè)月。5.5.2.6配套提取試劑盒組成：組分名稱規(guī)格數(shù)量離心柱20個(gè)/包1收集管80個(gè)/包1裂解液4.4ml/瓶1抑制物去除液（濃縮液）7ml/瓶1去離子液（濃縮液）4.4ml/瓶1洗脫液3ml/瓶1蛋白酶K（干粉）22mg/瓶1CarrierRNA（干粉）155ug/管15.5.2.7自備試劑：無水乙醇5.6操作過程：待測(cè)樣本、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品同步處理。5.6.1實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：5.6.1.1抑制物去除液（濃縮液）中加入4.3ml的無水乙醇，并在管蓋及管壁上打勾。室溫保存。5.6.1.2去離子液（濃縮液）中加入17.6ml的無水乙醇，并在管蓋及管壁上打勾。室溫保存。5.6.1.3蛋白酶K（干粉）中加入1.1ml的洗脫液，充分混勻，溶解。-20℃保存。5.6.1.4CarrierRNA（干粉）中加入110ul的洗脫液或內(nèi)標(biāo)溶液（PCR試劑盒中成分），充分混勻，溶解。-20℃保存。5.6.1.5配制CarrierRNA-裂解工作液（現(xiàn)配現(xiàn)用）1人份20人份裂解液200ul4mlCarrierRNA4ul80ul5.6.2RNA提?。?.6.2.1在1.5ml的無菌離心管中加入50ul的蛋白酶K；5.6.2.2取200ul樣本加入離心管中；5.6.2.3再加入200ul的裂解工作液（即已含CarrierRNA的裂解液），蓋緊管蓋，漩渦震蕩15秒以充分混勻，高速離心10秒（防止溫育是產(chǎn)生氣泡），72℃10分鐘；同時(shí)將洗脫液置于72℃預(yù)熱。5.6.2.4加入250ul無水乙醇，蓋緊管蓋。漩渦震蕩15秒。5.6.2.5將混合液全部吸至離心柱，室溫下12000g離心1分鐘，將離心柱轉(zhuǎn)至新的收集管；5.6.2.6將500ul的抑制物去除液加入離心柱，室溫下12000g離心1分鐘，將離心柱轉(zhuǎn)至新的收集管；5.6.2.7將500ul的去離子液加入離心柱，室溫下12000g離心1分鐘，將離心柱轉(zhuǎn)至新的收集管；5.6.2.8重復(fù)上一步操作一次；5.6.2.9將離心柱-收集管于室溫下14000g離心3分鐘以除去殘留的乙醇；5.6.2.10將離心柱取出，放入新的1.5ml離心管。打開離心柱蓋子，72℃放置2分鐘(使用干式恒溫器，不能使用水浴鍋)；5.6.2.11在離心柱的膜上方小心加入72℃預(yù)熱的洗脫液50ul，蓋緊管蓋，室溫靜置1分鐘后，14000g離心1分鐘。離心管內(nèi)即為核酸溶液，立即使用或放于-20℃?zhèn)溆谩?.6.3排版：根據(jù)樣本數(shù)量編寫《PCR實(shí)驗(yàn)室DA－7600取試劑、加樣、擴(kuò)增對(duì)照?qǐng)D面版表》，注意添加陰性質(zhì)控，陽性質(zhì)控。5.6.4加樣：5.6.4.1配制HCV單人份擴(kuò)增體系：取N個(gè)（N=待檢樣本個(gè)數(shù)+陰性質(zhì)控平+陽性質(zhì)控品）PCR反應(yīng)管，按下表進(jìn)行配制：組分HCV反應(yīng)液AHCV反應(yīng)液B總體積用量27ul3ul30ul將各組分充分混勻，混合好后進(jìn)行短時(shí)離心將管壁上的液體全部離心至管底，之后將30ul擴(kuò)增體系分裝到PCR反應(yīng)管管中。5.6.4.2根據(jù)排版，往上述PCR反應(yīng)管中加入對(duì)應(yīng)的樣本核酸各20ul。蓋緊管蓋，瞬時(shí)離心后上機(jī)進(jìn)行擴(kuò)增。5.6.5DA7600的設(shè)置及結(jié)果分析：參見《達(dá)安7600熒光定量PCR儀操作、校準(zhǔn)及保養(yǎng)規(guī)程》及《基因擴(kuò)增檢測(cè)及結(jié)果分析規(guī)程》。5.6.6記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。5.6.7取出結(jié)束后擴(kuò)增儀內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物需用一次性手套包好、封口后，丟入醫(yī)療廢物垃圾桶內(nèi)，以防止擴(kuò)增管破裂而導(dǎo)致污染。5.6.8關(guān)閉擴(kuò)增儀電源和計(jì)算機(jī)電源。5.7注意事項(xiàng)：5.7.1PCR熒光檢測(cè)法比較容易受污染，所以實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)避免反復(fù)開蓋，所用耗材均需高壓滅菌。5.7.2RNA提取步驟建議冰上操作。吸取血清時(shí)注意勿帶入紅細(xì)胞。5.7.3試劑使用前要完全解凍，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。5.7.4RNA提取液A必須充分混勻后吸取，RNA提取液B需溶解混勻后使用。5.7.5逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，需馬上進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，否則須轉(zhuǎn)移上清至滅菌離心管，保存于-20℃待用。5.8安全防護(hù)措施：5.8.1試劑處理：5.8.1.1使用或更換試劑時(shí)，務(wù)必戴手套；不要用身體直接接觸試劑，以免損傷皮膚。5.8.1.2如果皮膚接觸了試劑，立即用大量清水沖洗并消毒。5.8.1.3如果眼睛接觸了試劑，立即用噴淋器沖洗，并緊急就醫(yī)。5.8.2儀器使用：5.8.2.1儀器運(yùn)轉(zhuǎn)中不要觸摸加樣機(jī)構(gòu)、試劑分注機(jī)構(gòu)、攪拌機(jī)構(gòu)、反應(yīng)容器清洗機(jī)構(gòu)等可動(dòng)部分。5.8.2.2儀器通電時(shí)不能打開儀器上面、背面、側(cè)面的蓋板，不能觸摸光源燈的玻璃面。5.8.3生物安全防護(hù)：參見《生物安全防護(hù)手冊(cè)》6.相關(guān)記錄表格:6.1LAB-SOP-PCR-005-T01-001《PCR實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)、交接班記錄表》6.2LAB-SOP-PCR-015-T01-001《PCR實(shí)驗(yàn)室遲發(fā)報(bào)告登記表》6.3LAB-SOP-PCR-014-T01-001《PCR實(shí)驗(yàn)室不合格標(biāo)本登記表》6.4LAB-SOP-PCR-025-T01-001《PCR實(shí)驗(yàn)室DA－7600取試劑、加樣、擴(kuò)增對(duì)照?qǐng)D面版表》本SOP文件頒發(fā)部門:質(zhì)管部本SO