《分子生物學實驗》基礎(chǔ)實驗技能培訓實驗操作手冊

基礎(chǔ)實松技能培洌

實膾操作手冊

實驗安排表

時間實驗名稱主要內(nèi)容

微量移液器的校準與使用

pH計的校準與使月

上午實驗一、基本實驗技能

電子天平的校準與使用

第一天常用儀器介紹

8.18液體培養(yǎng)基的配制

固體培養(yǎng)基的配制

下午實驗二、基本實驗準備

細菌的液體培養(yǎng)接種

實驗常用試劑配制等

第二天上午實驗三、植物基因組DNA提取植物基因組提取

8.19下午實驗四、感受態(tài)制備感受態(tài)制備

第三天I.T-實驗五、PCR擴增、瓊脂糖凝膠回收PCR反應(yīng)、產(chǎn)物回收純化

8.20下午實驗六、TA克隆-連接轉(zhuǎn)化連接轉(zhuǎn)化涂板

第四天上午實驗六、TA克隆?鑒定?菌落PCR簽定菌落PCR鑒定

8.21下午實驗七、植物RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄RNA提取逆轉(zhuǎn)錄

上午實驗六、TA克隆-鑒定-質(zhì)粒提取質(zhì)粒提取鑒定

第五天

下午實驗八、熒光定量PCR熒光定量

8.22

分子實驗總結(jié)

第六天上午實驗九、蛋白提取、蛋白定量蛋白提取、蛋白定量

8.24下午實驗十、蛋白電泳制膠、電冰、染色

第七天

全天實驗H--、WesternBlot實驗（DAB顯色）轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗、二抗、顯色

8.25

包被、封閉、一抗、二抗、顯色、

上午實驗十二、ELISA檢測

終止

第八天

下午實驗十三、細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)基本方法

8.26

蛋白實驗總結(jié)

三個實驗，DNA、RNA提取、熒光

定量PCR操作。每組派出一個學員

上午綜合測試（現(xiàn)場考核操作）

第九天進行抽簽，抽到一種實驗方案及一

8.27個學員，現(xiàn)場進行操作，結(jié)果評比。

下午總結(jié)報告評選優(yōu)秀學員和優(yōu)秀小組

植物基因組DNA提取

實驗材料:

植物樣本，植物基因組DNA提取試劑盒，B-疏基乙醇，氯仿，無水乙醇

實驗儀器、耗材：移液器、電泳儀、離心機、研缽、研缽棒、剪刀、天平、液氮

實驗前準備：

1.BufferGP1在使用前請加入代疏基乙醇,5mlBu^erGP1加5pl即疏基乙醇。加入p-

筑基乙醇的BufferGP1室溫可保存1個月。

2.預(yù)熱水浴鍋65度，珞加入配制好的疏基乙醇預(yù)熱。

3.第一次使用前應(yīng)按照試劑瓶標簽的說明在BufferGW1和BufferGW2中加入無水乙醇。

4.稱取植物樣本約100mg。

5.在研磨植物材料前，向研缽中倒入酒精，放入剪刀、鑰匙高溫消毒。

6.研缽、剪刀、鑰匙冷卻后，將液氮加入在研缽口以預(yù)冷研缽。

實驗步驟：

1.取植物新鮮組織約100mg,用剪刀將樣本剪碎，放入研缽，加入液氮充分研磨至粉末狀。

將粉末轉(zhuǎn)移到離心管中。

注意：凍存材料直接研磨，絕對不能化凍。而且粉末應(yīng)在化凍前轉(zhuǎn)移，否則內(nèi)源性DNase

有可能降解基因組DNAo

2.加入700H65℃預(yù)熱的BufferGP1(BufferGP1在使用前請加入B-筑基乙醇，5mlBuffer

GP1加53小毓基乙醵)，迅速顛倒混勻后，將離心管置于65℃水浴20分鐘，水浴過

程中顛倒離心管混勻樣品數(shù)次。

3.加入7007氯仿.充分混勻，12,000rpm(?13,400xg)離心5分鐘。小心將上層水相

轉(zhuǎn)入一新的離心管中，加入700ulBufferGP2,充分混勻。

4.將上步所得溶液全部加入到已裝入收集管(CollectionTube)的吸附柱(SpinColumnDM)

中。若一次不能加完溶液，可分多次轉(zhuǎn)入。10,000rpm(?11,500xg)離心1分鐘，倒

掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

5.向吸附柱中加入500ulBufferGW1(使用前檢杳是否"加入無水乙醇)，10,000rpm離

心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

6.向吸附柱中加入500ulBufferGW2(使用前檢查是否已加入無水乙醇)，10,000rpm離

心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

7.12,000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘，以徹底晾干。

(乙醇一定要吹干，否則電泳點樣時，樣品上漂)

8.將吸附柱置于一個新的離心管中，向吸附柱的中間部位懸空加入50ulBufferGE,室溫放

置2?5分鐘，10,000rpm離心1分鐘,收集DNA溶液，?20℃保存DNA。

9.電泳檢測。

感受態(tài)制備

實驗材料：

菌株：Top10(Str+)、LB固體培養(yǎng)基，LB液體培養(yǎng)基，洗脫液，保存液

實驗方法：Cacl2法制備TOP10感受態(tài)

實驗儀器、耗材：4度離心機，分光光度計、50ml離心管、-80度低溫冰箱

試劑配制方法：

1L液體LB培養(yǎng)基：10g蛋白陳+5g酵母粉+10g氯化鈉，加蒸鐳水至1000ml。

100ml固體LB培養(yǎng)基：1g蛋白陳+0.5g酵母粉+1g氯化鈉+1.5g瓊脂粉，加蒸儲水至

100mL

1L洗脫液：16.264gMgCI2?6H2。(80mM)+2.94gCaCI2-2H2O(20mM)

200ml保存液：2.205gCaCI2-2H2O(75mM)+30ml甘油(15%)

滅菌條件：122℃20min

實驗步驟：

1.菌種的劃線培養(yǎng)

第一天下午4:30分

從-80℃取甘油菌，在?次性LB平板上進行劃線接菌，在37。(:恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

2.接菌小搖與培養(yǎng)基的制備

第二天下午4:30分

取過夜培養(yǎng)平板,用槍頭挑菌于50ml液體LB培養(yǎng)管內(nèi)，37℃,250rpm搖菌過夜。

3.擴大培養(yǎng)

第三天早上8:30分

取過夜小搖菌液按1:100比例加入250ml三角瓶(含100ml液體LB培養(yǎng)基)進行

擴大培養(yǎng)，期間監(jiān)測OD值。

4.冰凍，離心，收菌

當OD600=0.4~0.5之間時，將搖菌三角瓶置于冰上，冰浴30min。

然后將菌液分別加入50ml離心管中4℃,3500rpm,離心10min收集菌體,

5.洗脫，冰凍，離心

將收集的菌體加入洗脫液12.5ml,混勻，冰浴20min。

(每菌液量加12.5ml洗脫液，也可根據(jù)總體積調(diào)整洗脫液的大小。)

4℃,3500rpm,離心10min,收集菌體。

6.分裝保存

加入保存液5ml(每100ml菌液量)，混勻，分裝細胞即可。

PCR擴增

實驗材料：

GFP模板（約750bp）,GFPForwardPrimer,GFPReversePrimer,TaqMasterMix

實驗儀器、耗材：PCR儀、移液器、PCR管、1.5ml離心管、電泳儀、照膠儀

實驗步驟：

1.配制PCR反應(yīng)體系：

每組做兩個重復(fù)。

試劑50pl反應(yīng)體系

2xTaqMasterMix（含染料）25pl

GFPForwardPrimer,10pM1pl

GFPReversePrimer,10pM1Ml

Grp模板1pl

RNase-FreeWater22pl

Total50pl

2.PCR反應(yīng)條件：

步驟溫度時間

預(yù)變性94℃2min

變性94MC30s、

退火55℃30sr30個循環(huán)

1minJ

延伸72℃

終延伸72℃2min

3.結(jié)果檢測：反應(yīng)結(jié)束后，取35Hl反應(yīng)產(chǎn)物電泳檢測，并準備進行瓊脂糖凝膠回收。

瓊脂糖凝膠回收純化

實驗材料：瓊脂糖凝膠膠塊、瓊脂糖凝膠回收純化試劑盒、無水乙醇

實驗儀器、耗材：切膠儀/照膠儀、小刀、移液器、分光光度計、水浴鍋、1.5ml離心管

實驗前準備：預(yù)熱水浴鍋至50度。

實驗步驟

1、取2個1.5ml干凈的離心管，稱取空管重量，將重星標記于管型上。

2、將單一目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下(盡量切除多余部分)，放入離心管中，稱重，

計算膠塊重量。

注意：若膠塊的體積過大，可將膠塊切成碎塊。

3、向膠塊中加入3倍體積BufferPG(如凝膠重為100mg,其體積可視為100pl,依此類推)。

4、50℃孵育10分鐘，其間每隔2-3分鐘溫和地上下顛倒離心管，以確保膠塊充分溶解。如果

還有未溶的膠塊，可再補加一些溶膠液或繼續(xù)放置幾分鐘，直至膠塊完全溶解

注意；1)當瓊脂糖凝膠濃度＞2%時，適當延長孵育時間。

2)膠塊完全溶解后最好將膠溶液溫度降至室溫再上柱，因為吸附柱在較高溫度時結(jié)合

DNA的能力較弱。

5、柱平衡：向已裝入收集管(CollectionTube)中的吸附柱(SpinColumnDM)中加入200

plBufferPS,17,900xg(-13,000rpm)離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重

新放回收集管中。

6、將步驟3或4所得溶液加入到己裝入收集管的吸附柱中，室溫放置2分鐘，17,900xg

(-13,000rpm)離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。

注意：吸附柱容積為700川，若樣品體積大「700川可分批加入。

7、向吸附柱中力口入5003BufferPG,17,900xg(-13,000rpm)離心1分鐘,倒掉收集管中

的廢液，將吸附柱放回收集管中。

8、向吸附柱中加入750plBufferPW(使用前請先檢杳是否已加入無水乙醇)，17,900xg

(-13,000rpm)離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。

9、17,900xg(-13,000rpm)離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置尸室溫數(shù)分鐘,

以徹底晾干。

注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶促反應(yīng)(酶

切、PCR等)。為確保下游實驗不受殘留乙醉的影響，建議將吸附柱開蓋，置于室溫放置

數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的乙醇。

10、將吸附柱放到一個新的1.5ml離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加353BufferEB

(pH8.5),室溫放置2分鐘。17,900xg(-13,000rpm)離心1分鐘,收集DNA溶液。-20℃

保存DNA。

注意：1）洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液，應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5

（可以用NaOH將水的pH值調(diào)到此范圍）。

2）為了提高DNA的回收量，可將離心得到的溶液重新滴加到吸附柱中，重復(fù)步驟10,

3）洗脫體積不應(yīng)小于30pl,體積過少會影響回收效率。

4）如果使用TE洗脫，需要考慮其中含有的EDTA是否會影響后續(xù)的酶促反應(yīng)。

5）I可收大于10kb的DNA片段時，BufferEB應(yīng)在50℃水浴中預(yù)熱，適當延長吸附和洗脫時間，

可增加回收效率。

11、結(jié)果檢測：

1）濃度檢測：對回收后的PCR產(chǎn)物進行濃度測定。

2）電泳檢測：取43回收前的PCR產(chǎn)物、2.5川回收前的PCR產(chǎn)物及5川回收后的PCR產(chǎn)物進

行電泳檢測。

TA克隆

連接、轉(zhuǎn)化、涂板、鑒定

一、連接：

實驗材料：pUC-T載體、回收純化的DNA片段（750bp）

實驗儀器、耗材：移液器、PCR管、PCR儀

實驗步驟：

1.計算插入片段的體積；

1）在進行克隆時，載體pUC-T和插入片段的摩爾比一股為1:2-1:10,本實驗我們選擇1:3。

2）本實驗使用的載體pUC-T濃度為50ng/川，50ng的摩爾數(shù)約為0.03pmol,因此本實驗插

入片段的摩爾數(shù)為0.09pmol,插入片段為750bp,那么本實驗插入片段DNA的使用量（ng）

=0.09x10-3x660x750（插入片段bp數(shù)）=44.55ng。

3）插入片段的體積（3）=插入片段DNA的使用量（ng）/插入片段的濃度（ng/pl）

本次我們使用的插入片段為上次實驗中膠回收片段，因此膠回收片段的濃度為40.6ng//，那

么，插入片段的體枳（川）=44.55/40.6=1.097,即在反應(yīng)體系中加入13插入片段。

2.按以下體系配制反應(yīng)液：

每組做4個。

試劑體積

pUC-T(50ng/pl)1Ml

插入片段（750bp）Xpl

RNase-FreeWaterYpl

SolutionBuffer,2x5pl

Total103

3.混勻，22℃孵育30分鐘，或者16℃過夜連接。

二、轉(zhuǎn)化：

實驗材料：TOP10感受態(tài)細胞、自制感受態(tài)細胞、LB液體培養(yǎng)基

實驗儀器、耗材：移液器、超凈臺、浮漂、搖床、水浴鍋

實驗前準備：預(yù)熱水浴鍋至42度。

實驗步驟：

1.取TOP10感受態(tài)細胞置于冰浴中，待感受態(tài)細胞融化后，進行以下實驗。

2.實驗組：將103連接產(chǎn)物加入至1003Top10感受態(tài)細胞中，用移液器輕輕吹打混勻，

冰浴30分鐘。每組共做2個。

對照組：將10pl連接產(chǎn)物加入至1003自制感受態(tài)紐胞中，用移液器輕輕吹打混勻，冰浴

30分鐘。每組做2個。

3.將離心管置于42℃水浴，熱擊90秒，迅速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，冰上靜置2-3分鐘。

4.向離心管中加入900PL的LB液體培養(yǎng)基（不含抗生素）,混勻后置于37℃搖床，150rpm

振蕩培養(yǎng)45分鐘，使菌體復(fù)蘇。

三、涂板、培養(yǎng)：

實驗材料：LB固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、氨苦、IPTG、X-gal

實驗儀器、耗材：涂布棒、超凈臺、移液器、培養(yǎng)箱

實驗步驟：

1.倒板：

在LB固體培養(yǎng)基中加入氨節(jié)后，進行倒板。

將100mg/mL的氨節(jié)稀釋1000倍使用。（300ml培養(yǎng)基+300PL的100mg/mL氨葦）

注意！培養(yǎng)基溫度應(yīng)在50-60度時，再加入氨茉。

2.將40PL的20mg/mL的X-gal和20PL50mg/mL的IPTG涂布于含氨茉青霉素的LB平板上，

用無菌的涂布棒均勻涂開。

3.離心，倒掉上清，將沉淀中全部轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)物，加到平板上，用無菌的涂布棒將細

胞均勻涂開。

4.將平板置于室溫下至液體被完全吸收，倒置平板，37℃培養(yǎng)箱，過夜培養(yǎng)。

四、觀察、鑒定：

1.觀察藍色和白色菌落，計算白色和藍色菌落數(shù)。

2.菌落PCR鑒定

實驗材料：TaqMasterMix>菌液、M13ForwardPrimer>M13ReversePrimer>LB液體培

養(yǎng)基、氨茉

實驗耗材：超凈臺、15ml離心管、搖床、PCR儀、移液器、LB液體培養(yǎng)基

實驗步驟：

選擇平板，每個平板挑取白色菌落（4個）和藍色菌落（2個）,分另ij放入50plRNase-Free

Water中，取23進行菌落PCR鑒定。剩下的48川等待菌落PCR結(jié)果，選取陽性克隆，于當

日下午接種于5ml含氨節(jié)青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，置于37℃搖床，250rpm振蕩培養(yǎng)過夜，

用于第二日提取質(zhì)粒。

1）配制PCR反應(yīng)體系：

試劑203反應(yīng)體系

2xTaqMasterMix10pl

M13ForwardPrimer,10pM0.5pl

M13ReversePrimer,10pM0.5pl

菌液2Ml

RNase-FreeWater7Ml

Total20pl

2）配制除菌液外的預(yù)混體系，并分裝到PCR管中，每個管中加入183的預(yù)混體系。

3)模板加入：每個管中分別加入23菌液?；靹?，短暫離心。

4)PCR反應(yīng)條件：

步驟溫度時間

預(yù)變性94℃2min

變性94℃30s'

退火55℃30s>30個循環(huán)

延伸72℃1minJ

終延伸72℃2min

5）結(jié)果檢測：反應(yīng)結(jié)束后，取53反應(yīng)產(chǎn)物直接電泳檢測結(jié)果。

3.高純質(zhì)粒提取鑒定

實驗材料：菌液，高純質(zhì)粒提取試劑盒，無水乙醇

實驗儀器、耗材：移液器、電泳儀

實驗前準備：

1）BufferP1中力「入RNaseA。

2）第一次使用前應(yīng)按照試劑瓶標簽的說明在BufferPW中加入無水乙醇。

實驗步驟：

1.取2nli（根據(jù)培養(yǎng)菌體的濃度選擇合適的量，建議最多不超過5ml）過夜培養(yǎng)的菌液，加

入離心管中，12,000rpm（~13,400xg）離心2-3分鐘收集細菌，盡量吸棄全部上清。

注意：質(zhì)?？截悢?shù)較低或＞10kb時，可以使用更多菌液通過二次離心將菌體沉淀收集到同

一個離心管中，同時后續(xù)所加試劑BufferP1、P2及N3的量需加倍。所加試劑的量

必須能夠充分裂解菌體，菌體過多、裂解不充分都會降低質(zhì)粒的提取效率。

2.向留有菌體沉淀的離心管中加入250ulBufferP1（請先檢查是否已加入RNaseA）,使用

移液器或渦旋振蕩器充分混勻，懸浮細菌沉淀。

注意：如果菌塊未徹底混勻，將會影響裂解效果，使提取量和純度偏低。

3.向離心管中加入250ulBufferP2,溫和地上下顛倒混勻6-8次，使菌體充分裂解，室溫放

置3-5分鐘。此時溶液應(yīng)變得清亮粘稠。

注意：不耍劇烈震蕩，以免造成所提質(zhì)粒中基因組DNA污染。如果溶液未變得清亮，提示

可能菌量過大，裂解不徹底，應(yīng)減少菌體量。

4.向離心管中加入350ulBufferN3,立即上下顛倒混勻6-8次，此時出現(xiàn)白色絮狀沉淀，室

溫放置5分鐘。12,000rpm離心10分鐘。

注意：BufferN3加入后應(yīng)立即混勻，避免產(chǎn)生局部沉淀。

5.柱平衡：向已裝入收集管（CollectionTube）的吸附柱（SpinColumnCM）中力口人2003

BufferPS,12,000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

6.將步驟4中所得的上消液轉(zhuǎn)移到吸附柱（已裝入收集管）中，12,000rpm離心1分鐘，倒掉

收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

注意：吸附柱的最大容枳為7003，所以第4步中所得溶液分2次過柱。

7.向吸附柱中加入500ulBufferPB,12,000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附

柱重新放回收集管中，

注意：如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5a,TOP10等），此步可省略。如果宿主菌是

endA+宿主菌（TG1,BL21,HB101,JM101,ET12567等），這些宿主菌含

有大量的核酸耐，易降解質(zhì)粒DNA.推薦采月此步，如果提取低搟貝質(zhì)粒推薦采用

此步。

8.向吸附柱中加入600川BufferPW（請先檢查是否已加入無水乙醇），12,000rpm離心1

分鐘，倒掉收集管中的廢液。

9.重復(fù)步驟8。

10.將吸附柱重新放回收集管中，12,000rpm離心2分鐘，倒掉廢液，將吸附柱置于室溫干燥5

分鐘。

注意；這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會影響后續(xù)的防促反應(yīng)（酶

切、PCR等）。

11.將吸附柱置于一個新的收集管中，向吸附膜的中間部位加入50-100ulBufferEB,室溫放

置2-5分鐘，12,000rpm離心2分鐘，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。-20。（:保存質(zhì)粒。

注意：1）為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重復(fù)步驟11。

2）BufferEB在65—70℃水浴預(yù)熱，適當延長吸附和洗脫的時間，可以增加提取效率。

3）洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液，應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5

范圍內(nèi)（可以用NaOH將水的pH值調(diào)到此范圍），pH值低于7.0會降低洗脫效率。

4）洗脫緩沖液體積不應(yīng)少「503，體積過小影響回收效率。

12.結(jié)果檢測：取53產(chǎn)物進行電泳檢測。

植物總RNA提取

材料:

植物樣本，超純RNA提取試劑盒，氯仿，75%乙醇(無RNase的水配制)

實驗儀器、耗材：移液器、電泳儀、4度離心機、分光光度計、研缽、研缽棒、天平、

液氮

實驗前準備：

1.配制75%乙醇，用無RNase的水配制。

2.稱取植物樣本100mg。

3.在研磨植物材料前，向研缽中倒入酒精，放入剪刀、鑰匙高溫消毒。

4.研缽、剪刀、鑰匙冷卻后，將液氮加入在研缽中以預(yù)冷研缽。

實驗步驟：

注意：低溫冰上操作

1.樣品處理：稱取植物樣本100mg,將植物樣本剪碎后，放入研缽中，加入液氮，充分

研磨，研磨充分后，加入1mlBufferRLT,

注意：樣品體積不超過BufferRLT體積的10%。

2.樣品中加入BufferRLT后反更吹打幾次，使樣本充分裂解。室溫放置5分鐘，使蛋白核酸

復(fù)合物完全分離。

3.每1mlBufferRLT加入200山氯仿的比例加入氯仿,蓋好管蓋，劇烈振蕩15秒，室溫放

置2分鐘。

4.4℃12,000rpm(~13,400xg)離心10分鐘，此時樣品分為三層：紅色有機相，中間層和

上層無色水相，RNA主要在上層水相中,將上層水相移到一個新的RNase-Free離心管(自

備)中。

5.在得到的水相溶液中加入等體積的70%乙醇(無RNase的水配制)，顛倒混勻。

6.將上步所得溶液全部加入到已裝入收集管(CollectionTube2ml)的吸附柱(SpinColumn

RM)中。若一次不能加完溶液，可分多次轉(zhuǎn)入。12,000rpm離心20秒，倒掉收集管中的

廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

7.向吸附柱中加入/00JlBufferRW1,12,。。。rpm離心2U秒，倒掉收集管中的廢液，將吸

附柱重新放回收集管中。

8.向吸附柱中加入500HBufferRW2(使用前檢杳是否已加入無水乙醇)，12,000rpm離

心20秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

9.重復(fù)步驟8,,

10.12,000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘，以徹底晾干。

11.將吸附柱置于一個新的無RNase離心管(CollectionTube1.5ml)中，向吸附柱的中間部

位加入30-50ulRNase-FreeWater,室溫放置1分鐘，12,000rpm離心1分鐘，收集RNA

溶液，-70°C保存RNR,防止降解。

12.檢測：

1）電泳檢測。

2）RNA濃度和純度測定：

純度：OD260,，QD280=1.921<1.8蛋白質(zhì)或酚類污染>2.2RNA水解

濃度：RNA（且g/旦I）=40*OD26O乂稀釋倍數(shù)

逆轉(zhuǎn)錄CDNA合成

實驗材料：

HiFi-ScriptcDNA第一鏈合成試劑盒，RNA（植物RNA實驗提?。?/p>

實驗儀器、耗材：

PCR儀、PCR管、移液器

實驗步驟：

1.將RNA模板、PrimerMix.dNTPMix、DTT、RTBuffer>HiFi-ScriptRNase-FreeWater

溶解并置于冰上備用。

2.根據(jù)以下表格配置反應(yīng)體系，總體積為203。

RNA終濃度建議為印g,需要根據(jù)測定的RNA濃度，計算逆轉(zhuǎn)錄中需要的RNA體積。

試劑20pl反應(yīng)體系

dNTPMix,2.5mMEach4pl

PrimerMix2Ml

RNATemplateXpl(1|jg)

5xRTBuffer4pl

DTT,0.1M2Ml

HiFi-Script,200U/pl1pl

RNase-FreeWaterY

Total20pl

3.渦旋震蕩混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。

4.42℃孵育50分鐘，85'C孵育5分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心，置于冰上冷卻。

5.逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接用于PCR和熒光定量PCR,或置于-20℃長期保存。

熒光定量PCR

實驗材料:

UltraSYBRGreenMixture,cDNA,actinForwardPrimer、actinReversePrimer

實驗儀器、耗材：

熒光定量PCR儀、PCR管、1.5ml離心管、移液器、八連管離心機

實驗步驟：

1.模板稀釋：

注意：每稀釋一個倍數(shù)，需要將溶液混勻，并短暫離心。

編號模板稀釋倍數(shù)水用量模板用量

110倍90pl10pl（原液）

2100倍90pl10pl（從1號管?。?/p>

2.配制PCR預(yù)混反應(yīng)體系：

做8個樣本，配制10個樣本的預(yù)混體系，配制方式如下:

配制10個樣本的

試劑20pl反應(yīng)體系

預(yù)混體系

2xUltraSYBRMixture100pl10pl

ForwardPrimer,10pM4pl0.4pl

ReversePrmer,10pM4pl0.4pl

AcDNAOpl2Ml

RNase-FreeWater72pl7.2pl

Total18020

3.將配制的預(yù)混體系，分裝到八連管中。共8個孔，每個孔中加入183的預(yù)混體系。

4.模板加入：

每個孔中分別加入2「模板，加樣順序如下:

加樣孔12345678

樣品原原稀釋稀釋稀釋稀釋水水

液液10倍10倍100倍100倍

加入體積2pl2pl2pl2pl2pl2pl2Pl2Ml

5.混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。

6.熒光定量PCR反應(yīng)程序:

步驟溫度時間

預(yù)變性95℃10min

變性95℃10sI

40個循環(huán)

1min)

退火/延伸60℃

融解曲線分析

注意事項：

1.首先配制預(yù)混體系，再將預(yù)混體系分裝到八連管中。

2.稀釋模板時，需要混勻。

3.不要直接在八連管管壁或管蓋上做標記！

植物總蛋白提取

實驗材料：植物樣本、植物蛋自抽提試劑

實驗儀器、耗材：研缽、研缽棒、移液器、1.5ml離心管、4度離心機、天平、液氮

注意：低溫冰上操作

實驗前準備：

1.將蛋白酶抑制劑混合物加入植物蛋白抽提試劑中，按照1:99比例加入，使蛋白酶抗制劑

混合物在抽提試劑中成1x工作液。

配制方法：990川植物蛋白抽提試劑+10川蛋白能抑制劑混合物，冰上放置待用。

2.稱取植物樣本約100mg。

3.在研磨植物材料前，先將液氮加入在研缽中以預(yù)冷研缽。

實驗步驟：

1.稱量100mg植物組織，用剪刀將樣本剪碎，放入研缽，加入液氮充分研磨至粉末狀。

將粉末轉(zhuǎn)移到離心管中。

2.按照組織：抽提試劑=1：5(g/ml)的比例加入蛋白抽提試劑，100mg植物組織加入5003

蛋白抽提試劑。渦旋混勻，冰上孵育30分鐘，期間渦旋混勻3次。

3.4℃12,000rpm,離心20分鐘。

4.將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中。冰上放置，準備蛋臼定量，或?qū)⑻崛〉牡鞍?20℃保存。

蛋白定量

實驗材料：提取的植物蛋白、BCA定量試劑盒

實驗儀器、耗材：移液器、酶標儀/分光光度計、酶標條、酶標板、1.5ml離心管、PCR管

實驗步驟：

1.標準品稀釋（按照下表進行標準品稀釋）。

管號稀釋液用量（U1）標準品用雷（ul）最終濃度（ugml）

A01002000

B2002001000

C200200（從B管中?。?00

D200200（從C管中?。?50

E200200（從D管中?。?25

F400100（從E管中?。?5

G20000（空白）

3.配置BCA工作液：根據(jù)標準品和樣品的數(shù)量，將試劑A和試劑B以50：1的體枳比

混勻（6mlA液+120plB液）

微孔法：

1）將253稀釋好的樣品與稀釋好的標準品分別添加于96孔板的微孔中。

2）各孔中加入200plBCA工作液，充分混勻。

3）蓋上96孔板蓋，37℃孵育30分鐘。

4）冷卻至室溫。

5）用酹標儀測定562nm處的吸光值。

6）繪制標準曲線，計算樣品中的蛋白濃度。

試管法：

1）將1003稀釋好的樣品與稀釋好的BSA標準品分別加到作好標記的試管中。

2）各試管中各加入2mlBCA工作液，充分混勻。

3）37℃水浴中孵育30分鐘或室溫孵育2小時。

4）將各管冷卻至室溫。

5）用分光光度計測定562nm處的吸光值。

6）繪制標準曲線，計算樣品中的蛋白濃度。

注意事項：

標準品測定需在10min內(nèi)完成，否則會影響蛋白定量的準確度。

蛋白電泳(制膠、SDS-PAGE電泳)

實驗材料：

SDS凝膠制備試劑盒、電泳緩沖液、提取的蛋白或全細胞裂解液、廣譜彩虹預(yù)

染中分子量蛋白Marker、SDSLoadingBuffer:還原，5x)、G250蛋白快速染色

試劑、若干蒸儲水

實驗儀器、耗材：

蛋白電泳儀、制膠儀、水平搖床、15ml離心管、5ml移液器、微量移液器、1.5ml離心管

配制溶液：

?配制10%APS溶液：-20度保存

0.5gAPS+5ml蒸儲本、2.5gAPS+25ml蒸儲水

?配制200ml電泳緩沖液：CVV0045Tris-GlycineSDS(ph8.3,10X)

2()mlTris-GlycincSDS+180nil蒸儲水

?配制1mlloadingbuffer：

200ul5Xloadingbuffer+800ul蒸儲水

實驗步驟：

一.制膠：

1.參照凝膠模具說明書，裝配好凝膠模具。

2.根據(jù)分離蛋白的大小配制分離膠和濃縮膠。

SDS分離膠的濃度與最佳分離范圍

SDS分離膠濃度最佳分離范圍

6%膠50-150kD

8%膠30-90kD

10%膠20-80kD

12%膠12-60kD

15%膠10-40kD

3.配制10%分離膠：

將不同體積的30%Acr-Bis(29:1),分離膠緩沖液和雙蒸水在小燒杯或試管中混合。

加入10%APS和TEMED,輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。

配制SDS分離膠

分離所需各組分體積(單位：ml)

凝膠

膠濃30%Acr-分離膠緩汨液

體積雙蒸水10%APSTEMED

度Bis(29:1)(4x)

10%5ml2.081.671.250.050.002

10ml4.173.332.50.10.004

15ml6.255.03.750.150.006

20ml8.36.750.20.008

4.待膠濯至距離玻璉板頂端1.5cm的時候停止灌狡，加入蒸儲水水封。靜置40分鐘

至1小時。

5.待分離膠凝固后（水層膠層中間出現(xiàn)折線），倒掉蒸儲水，用濾紙將水溶液吸干。

6.配制5%濃縮膠:

配制5%SDS濃縮膠

所需各組分體積（單位：ml）

凝膠

30%Acr-Bis(濃縮膠緩沖液10%APTEME

體積雙蒸水

29:1)（4x）SD

2ml1.140.340.50.020.002

4ml2280.6810.040.004

6ml3.421.021.50.060.006

8ml4.561.362.00.080.008

7.將濃縮膠溶液加至分離膠的上面，直至凝膠溶液到達前玻璃板的頂端。

注意：灌膠速度要快，防止凝膠。

8.將梳子插入凝膠內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡。靜置20分鐘，等待濃縮膠聚合。

9.待凝膠聚合后，小心地拔出梳子，以免破壞加樣孔。趕走氣泡。

二.SDS電泳：

1.在電泳槽的內(nèi)外槽灌至電泳緩沖液。

2.制備樣品：

1）植物蛋白樣品：

根據(jù)植物蛋白定量結(jié)果，計算蛋白提取液加入量，制備上樣溶液。

蛋白提取液+5x上樣緩沖液+蒸儲水

制備的樣品，煮沸5分鐘，12,000rpm離心5分鐘，取上清，上樣。

2）全細胞裂解液：可以直接上樣，上樣203，約40ug.

3.上樣：K562全細胞裂解液上樣順序如下：

泳道12345678910

樣品1x上樣Marker樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品1x上樣

緩沖液1234567緩沖液

體積10pl5pl20320pl20pl20pl20川20320川10pl

4.電泳：濃縮膠80V,約20分鐘，分離膠100V,約1小時。

四、考馬斯亮藍染色

注：將提取的植物蛋白進行電泳，電泳后進行考馬斯亮藍染色。全細胞裂解液電泳后，進行

westernblot檢測。

1.將電泳后的PAGE膠取出放入容器中，加入適量蒸偏水（以充分覆蓋PAGE膠為

宜），加熱至沸騰后5分鐘，棄去蒸儲水：

2.加入適量考馬斯亮藍染色液（液面覆蓋凝膠即可）加熱至沸騰后5分鐘，棄染色液;

3.加入適量蒸儲水，加熱至沸騰后5分鐘，棄蒸儲水，重復(fù)此步驟至背景清晰。

4.觀察拍照。

WesternBlot

溶液配制：

?配制500ml1XTBST溶液：

50mlTBST（ph8.3,10X）+450ml蒸儲水

?配制100ml5%牛奶封閉液：4度保存

5克脫脂奶粉+100ml1XTBST

?配制100ml轉(zhuǎn)膜緩沖液（甲醇）：CW0044Tris-Glycine（ph8.3,10X）

1（）mlTris-Glycine+20ml甲醇+70ml蒸鏘水（4度保存）

一.轉(zhuǎn)膜及染色

實驗材料：NC膜、濾紙、轉(zhuǎn)膜緩沖液、麗春紅染色試劑

實驗儀器、耗材：轉(zhuǎn)膜儀

實驗步驟：

1.電泳完成后，小心打開玻璃板，去除濃縮膠，將分離膠剝離后，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡。

2.用剪刀剪相同大