DB37T 3129.1-2018 鴨細(xì)小病毒感染診斷技術(shù) 第1部分：病毒分離鑒定　

DB37/T3129.1—2018鴨細(xì)小病毒感染診斷技術(shù)第1部分：病毒2018-02-02發(fā)布2018-03-02實(shí)施IDB37/T3129.1—2018本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧獸醫(yī)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)起草人：刁有祥、陳浩、唐熠、楊晶。1DB37/T3129.1—2018鴨細(xì)小病毒感染診斷技術(shù)第1部分：病毒分離鑒定本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了鴨細(xì)小病毒樣品的采集與保存、病毒的分離和鑒定等的技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的鴨細(xì)小病毒分離鑒定和PCR檢測(cè)方法適用于鴨組織、分泌物、排泄物和病毒培養(yǎng)物2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范動(dòng)物檢疫3術(shù)語和定義3.1也稱新型鵝細(xì)小病毒，是引起鴨短喙侏儒綜合征的病原，該病以生長(zhǎng)障礙，短喙、舌外露為特征。3.2用對(duì)應(yīng)某一種抗原的抗體(這里被稱為一抗)與細(xì)胞孵育結(jié)合，在采用對(duì)應(yīng)一抗(也就是抗一抗)的抗體(這里被稱為二抗，二抗上偶聯(lián)有熒光素分子)與細(xì)胞孵育結(jié)合后在熒光顯微鏡下觀察，出現(xiàn)綠色熒光3.3原代鴨胚肝細(xì)胞Duckembryolivercell(DEL)采用胰酶消化法，用15日齡~20日齡SPF鴨胚肝臟制備的原代細(xì)胞。4實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制2DB37/T3129.1—2018則，避免交叉污染。4.3注意個(gè)人防護(hù)和環(huán)境保護(hù)，電泳中用到的EB可誘發(fā)基因突變，試驗(yàn)中被EB污染的物品要有專用收集處，并通過適當(dāng)?shù)姆绞?如焚燒、或送有資質(zhì)的醫(yī)用垃圾處理公司)進(jìn)行無害化處理。垃圾處理公司做最終處理。4.5人員熟悉生物樣品處理、細(xì)胞培養(yǎng)、以及核酸提取、基因擴(kuò)增等分子生物學(xué)技術(shù)。b)PCR儀；c)CO?恒溫培養(yǎng)箱(37℃恒溫);d)臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(最大轉(zhuǎn)速12000r/min);f)電泳槽；h)2°C～8°C冰箱；j)微量移液器(最大量程分別為10μL、20μL、100μL、1000μL),帶濾芯的槍頭；k)孵化器(37℃恒溫);d)dNTPs(2.5mmol/L);h)核酸電泳加樣緩沖液，見A.4;i)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，要求在100bp～2000bp之間，有5條以上的指示條帶；3DB37/T3129.1—2018n)細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清的o)兔抗鴨細(xì)小病毒多克隆抗體；p)細(xì)胞維持液(含1%胎牛血清的q)SPF鴨胚；擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為661bp;引物濃度均為50μmol/L。5樣品的采集和處理5.1樣品的采集采集死亡鴨肝臟、脾和腦等組織，分別處理或混合后進(jìn)行處理；若是活鴨，則采集泄殖腔拭子。樣品置于在密閉容器中冷藏運(yùn)輸，儲(chǔ)藏溫度不超過4℃,時(shí)間不超過24h。5.2樣品的保存5.2.1室溫條件下樣品在1h~2h內(nèi)處理完畢，未能及時(shí)處理的樣本在4℃冰箱中存放，不超過24h;也可于-20℃低溫條件下保存，不超過30d;-70℃貯存最佳，不超過1年。5.2.2組織研磨液和泄殖腔拭子懸液置于-20℃低溫條件下保存，不超過2周；-70℃貯存不超過30d。5.3樣品的處理5.3.1在生物安全柜中，取10g~20g樣品放入滅菌的研缽中，無菌條件下磨碎。5.3.2用含有抗生素(青霉素(2000IU/mL)、鏈霉素(2mg/mL)、慶大霉素(50μg/mL)和制霉菌素(1000IU/mL))等滲磷酸鹽緩沖液(PBS,pH值7.0~7.4,附錄A.1)配成10%～20%(g/mL)的懸液；泄殖腔拭子懸液中抗生素濃度提高5倍。加入抗生素后pH調(diào)至7.0～7.4。5.3.3樣本組織懸液反復(fù)凍融3次，經(jīng)8000r/min離心10min,取上清并置4℃過夜，次日接種SPF鴨胚或原代鴨胚肝細(xì)胞。6病毒分離6.1鴨胚接種6.1.1將處理后的樣品上清，每份尿囊腔接種9日齡~11日齡SPF鴨胚3枚~5枚，0.2mL/胚，37℃孵化120h。6.1.2棄去24h內(nèi)死亡胚，24h~120h內(nèi)死亡和存活鴨胚置4℃冰箱過夜或-20℃冷凍1h,分別無菌收集尿囊液并進(jìn)行無菌檢查，無菌尿囊液盲傳三代。6.2細(xì)胞接種6.2.1將處理后的樣品上清接種80%生長(zhǎng)狀況良好的單層原代鴨胚肝細(xì)胞，5%CO?、37℃孵育1h,吸棄上清，用PBS緩沖液輕輕洗滌2次，吸棄后加入細(xì)胞維持液。6.2.2當(dāng)70%以上單層細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)物凍融后，轉(zhuǎn)移至2mL凍存管置于-70℃保存，不超過3年。4DB37/T3129.1—20187病毒鑒定7.1間接免疫熒光法(IFA)取接種病毒60h的鴨胚肝細(xì)胞(24孔細(xì)胞培養(yǎng)板),用PBS緩沖液輕輕洗滌3次～4次，吸棄液體。加入預(yù)冷(-20℃)的甲醇：丙酮(1:1)固定液150μL/孔沒過單層細(xì)胞，置于-20℃固定10min,吸于濕盒中37℃孵育1h。吸棄后用PBS洗滌3次。加入1:200(抗體稀釋液PBST)稀釋的FITC標(biāo)記鼠抗兔抗體(100μL/孔),置于濕盒中4℃孵育1h。加入數(shù)滴50%甘油鹽水封片(見附錄B.2),置于倒置熒光顯微鏡下，觀察是否有綠色熒光信號(hào)。7.2PCR檢測(cè)7.2.1DNA提取7.2.2PCR反應(yīng)7.2.2.3PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min;94℃30s、58℃45s、72℃30s,進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，7.2.3PCR產(chǎn)物電泳7.2.3.1取9μL樣品與1μL核酸電泳加樣緩沖液混勻后，于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，在位于凝膠7.2.3.2加樣后，按照5V/cm電壓，電泳20min~40min,當(dāng)加樣緩沖液中溴酚藍(lán)電泳過半至凝膠下2/5處時(shí)，可停止電泳。7.2.3.3置于凝膠成像儀下觀察，根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)判8結(jié)果判定8.1鴨胚肝細(xì)胞感染鴨細(xì)小病毒，細(xì)胞輕微聚集，IFA檢測(cè)出現(xiàn)綠色熒光信號(hào)。當(dāng)陽性對(duì)照IFA檢測(cè)5DB37/T3129.1—2018結(jié)果無效，不能進(jìn)行判斷。8.4在陽性對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增條帶，陰性對(duì)照無條帶出現(xiàn)(引物二聚體除外)時(shí)，試驗(yàn)成立。PCR檢測(cè)結(jié)果為陽性表明樣品中存在鴨細(xì)小病毒，檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)表明樣品中不存在鴨細(xì)小病毒，見資料性6DB37/T3129.1—2018試劑類型試劑含量瓊脂糖0.5×TAE電泳緩沖液加至微波爐中完全融化，待冷至50℃~60℃時(shí)加入溴化乙錠(EB)溶液5μL,搖勻。倒入電泳板上，A.2.1配制0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na?)溶液(pH8.0)試劑類型試劑含量乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na?·2H?O)滅菌雙蒸水80.0mL氫氧化鈉調(diào)pH至滅菌雙蒸水加至用于配制A.2.2中的50×TAE電泳緩沖液A.2.2配制50×TAE電泳緩沖液試劑類型試劑含量羥基甲基氨基甲烷(Tris)冰醋酸EDTA-Na2溶液(pH8.0)滅菌雙蒸水加至用于配制A.2.3中的1×TAEA.2.3配制1×TAE電泳緩沖液試劑類型試劑含量50×TAE電泳緩沖液滅菌雙蒸水加至試劑類型試劑含量溴化乙錠滅菌雙蒸水加至7DB37/T3129.1—2018試劑類型試劑含量聚蔗糖溴酚藍(lán)0.1g二甲苯青0.1g滅菌雙蒸水8DB37/T3129.1—2018(資料性附錄)試劑類型試劑含量雙蒸餾水加至B.250%甘油鹽水試劑類型試劑含量甘油NaCl蒸餾水加至B.3試劑類型試劑含量吐