DB37T 3129.1-2018 鴨細(xì)小病毒感染診斷技術(shù) 第1部分：病毒分離鑒定　

DB37/T3129.1—2018鴨細(xì)小病毒感染診斷技術(shù)第1部分：病毒2018-02-02發(fā)布2018-03-02實(shí)施IDB37/T3129.1—2018本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧獸醫(yī)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)起草人：刁有祥、陳浩、唐熠、楊晶。1DB37/T3129.1—2018鴨細(xì)小病毒感染診斷技術(shù)第1部分：病毒分離鑒定本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了鴨細(xì)小病毒樣品的采集與保存、病毒的分離和鑒定等的技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的鴨細(xì)小病毒分離鑒定和PCR檢測(cè)方法適用于鴨組織、分泌物、排泄物和病毒培養(yǎng)物2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范動(dòng)物檢疫3術(shù)語(yǔ)和定義3.1也稱(chēng)新型鵝細(xì)小病毒，是引起鴨短喙侏儒綜合征的病原，該病以生長(zhǎng)障礙，短喙、舌外露為特征。3.2用對(duì)應(yīng)某一種抗原的抗體(這里被稱(chēng)為一抗)與細(xì)胞孵育結(jié)合，在采用對(duì)應(yīng)一抗(也就是抗一抗)的抗體(這里被稱(chēng)為二抗，二抗上偶聯(lián)有熒光素分子)與細(xì)胞孵育結(jié)合后在熒光顯微鏡下觀察，出現(xiàn)綠色熒光3.3原代鴨胚肝細(xì)胞Duckembryolivercell(DEL)采用胰酶消化法，用15日齡~20日齡SPF鴨胚肝臟制備的原代細(xì)胞。4實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制2DB37/T3129.1—2018則，避免交叉污染。4.3注意個(gè)人防護(hù)和環(huán)境保護(hù)，電泳中用到的EB可誘發(fā)基因突變，試驗(yàn)中被EB污染的物品要有專(zhuān)用收集處，并通過(guò)適當(dāng)?shù)姆绞?如焚燒、或送有資質(zhì)的醫(yī)用垃圾處理公司)進(jìn)行無(wú)害化處理。垃圾處理公司做最終處理。4.5人員熟悉生物樣品處理、細(xì)胞培養(yǎng)、以及核酸提取、基因擴(kuò)增等分子生物學(xué)技術(shù)。b)PCR儀；c)CO?恒溫培養(yǎng)箱(37℃恒溫);d)臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(最大轉(zhuǎn)速12000r/min);f)電泳槽；h)2°C～8°C冰箱；j)微量移液器(最大量程分別為10μL、20μL、100μL、1000μL),帶濾芯的槍頭；k)孵化器(37℃恒溫);d)dNTPs(2.5mmol/L);h)核酸電泳加樣緩沖液，見(jiàn)A.4;i)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，要求在100bp～2000bp之間，有5條以上的指示條帶；3DB37/T3129.1—2018n)細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清的o)兔抗鴨細(xì)小病毒多克隆抗體；p)細(xì)胞維持液(含1%胎牛血清的q)SPF鴨胚；擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為661bp;引物濃度均為50μmol/L。5樣品的采集和處理5.1樣品的采集采集死亡鴨肝臟、脾和腦等組織，分別處理或混合后進(jìn)行處理；若是活鴨，則采集泄殖腔拭子。樣品置于在密閉容器中冷藏運(yùn)輸，儲(chǔ)藏溫度不超過(guò)4℃,時(shí)間不超過(guò)24h。5.2樣品的保存5.2.1室溫條件下樣品在1h~2h內(nèi)處理完畢，未能及時(shí)處理的樣本在4℃冰箱中存放，不超過(guò)24h;也可于-20℃低溫條件下保存，不超過(guò)30d;-70℃貯存最佳，不超過(guò)1年。5.2.2組織研磨液和泄殖腔拭子懸液置于-20℃低溫條件下保存，不超過(guò)2周；-70℃貯存不超過(guò)30d。5.3樣品的處理5.3.1在生物安全柜中，取10g~20g樣品放入滅菌的研缽中，無(wú)菌條件下磨碎。5.3.2用含有抗生素(青霉素(2000IU/mL)、鏈霉素(2mg/mL)、慶大霉素(50μg/mL)和制霉菌素(1000IU/mL))等滲磷酸鹽緩沖液(PBS,pH值7.0~7.4,附錄A.1)配成10%～20%(g/mL)的懸液；泄殖腔拭子懸液中抗生素濃度提高5倍。加入抗生素后pH調(diào)至7.0～7.4。5.3.3樣本組織懸液反復(fù)凍融3次，經(jīng)8000r/min離心10min,取上清并置4℃過(guò)夜，次日接種SPF鴨胚或原代鴨胚肝細(xì)胞。6病毒分離6.1鴨胚接種6.1.1將處理后的樣品上清，每份尿囊腔接種9日齡~11日齡SPF鴨胚3枚~5枚，0.2mL/胚，37℃孵化120h。6.1.2棄去24h內(nèi)死亡胚，24h~120h內(nèi)死亡和存活鴨胚置4℃冰箱過(guò)夜或-20℃冷凍1h,分別無(wú)菌收集尿囊液并進(jìn)行無(wú)菌檢查，無(wú)菌尿囊液盲傳三代。6.2細(xì)胞接種6.2.1將處理后的樣品上清接種80%生長(zhǎng)狀況良好的單層原代鴨胚肝細(xì)胞，5%CO?、37℃孵育1h,吸棄上清，用PBS緩沖液輕輕洗滌2次，吸棄后加入細(xì)胞維持液。6.2.2當(dāng)70%以上單層細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)物凍融后，轉(zhuǎn)移至2mL凍存管置于-70℃保存，不超過(guò)3年。4DB37/T3129.1—20187病毒鑒定7.1間接免疫熒光法(IFA)取接種病毒60h的鴨胚肝細(xì)胞(24孔細(xì)胞培養(yǎng)板),用PBS緩沖液輕輕洗滌3次～4次，吸棄液體。加入預(yù)冷(-20℃)的甲醇：丙酮(1:1)固定液150μL/孔沒(méi)過(guò)單層細(xì)胞，置于-20℃固定10min,吸于濕盒中37℃孵育1h。吸棄后用PBS洗滌3次。加入1:200(抗體稀釋液PBST)稀釋的FITC標(biāo)記鼠抗兔抗體(100μL/孔),置于濕盒中4℃孵育1h。加入數(shù)滴50%甘油鹽水封片(見(jiàn)附錄B.2),置于倒置熒光顯微鏡下，觀察是否有綠色熒光信號(hào)。7.2PCR檢測(cè)7.2.1DNA提取7.2.2PCR反應(yīng)7.2.2.3PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min;94℃30s、58℃45s、72℃30s,進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，7.2.3PCR產(chǎn)物電泳7.2.3.1取9μL樣品與1μL核酸電泳加樣緩沖液混勻后，于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，在位于凝膠7.2.3.2加樣后，按照5V/cm電壓，電泳20min~40min,當(dāng)加樣緩沖液中溴酚藍(lán)電泳過(guò)半至凝膠下2/5處時(shí)，可停止電泳。7.2.3.3置于凝膠成像儀下觀察，根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)判8結(jié)果判定8.1鴨胚肝細(xì)胞感染鴨細(xì)小病毒，細(xì)胞輕微聚集，IFA檢測(cè)出現(xiàn)綠色熒光信號(hào)。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照IFA檢測(cè)5DB37/T3129.1—2018結(jié)果無(wú)效，不能進(jìn)行判斷。8.4在陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增條帶，陰性對(duì)照無(wú)條帶出現(xiàn)(引物二聚體除外)時(shí)，試驗(yàn)成立。PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性表明樣品中存在鴨細(xì)小病毒，檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)表明樣品中不存在鴨細(xì)小病毒，見(jiàn)資料性6DB37/T3129.1—2018試劑類(lèi)型試劑含量瓊脂糖0.5×TAE電泳緩沖液加至微波爐中完全融化，待冷至50℃~60℃時(shí)加入溴化乙錠(EB)溶液5μL,搖勻。倒入電泳板上，A.2.1配制0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na?)溶液(pH8.0)試劑類(lèi)型試劑含量乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na?·2H?O)滅菌雙蒸水80.0mL氫氧化鈉調(diào)pH至滅菌雙蒸水加至用于配制A.2.2中的50×TAE電泳緩沖液A.2.2配制50×TAE電泳緩沖液試劑類(lèi)型試劑含量羥基甲基氨基甲烷(Tris)冰醋酸EDTA-Na2溶液(pH8.0)滅菌雙蒸水加至用于配制A.2.3中的1×TAEA.2.3配制1×TAE電泳緩沖液試劑類(lèi)型試劑含量50×TAE電泳緩沖液滅菌雙蒸水加至試劑類(lèi)型試劑含量溴化乙錠滅菌雙蒸水加至7DB37/T3129.1—2018試劑類(lèi)型試劑含量聚蔗糖溴酚藍(lán)0.1g二甲苯青0.1g滅菌雙蒸水8DB37/T3129.1—2018(資料性附錄)試劑類(lèi)型試劑含量雙蒸餾水加至B.250%甘油鹽水試劑類(lèi)型試劑含量甘油NaCl蒸餾水加至B.3試劑類(lèi)型試劑含量吐