DB37T 2995-2017 副豬嗜血桿菌熒光定量PCR檢測技術(shù)　　

DB37DB37/T2995—2017副豬嗜血桿菌熒光定量PCR檢測技術(shù)山東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB37/T2995—2017本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧獸醫(yī)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧業(yè)專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：吳家強、于江、郭立輝、張玉玉、杜以軍、李俊、陳蕾、陳智、孫文博、叢曉燕、時建立、王金寶。本標(biāo)準(zhǔn)為首次發(fā)布。1DB37/T2995—20171范圍件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法4縮略語HPS:副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis)5.3熒光定量PCR儀。5.4水浴鍋。5.6-20℃冰箱。5.10一次性無菌5mL注射器。2DB37/T2995—20175.120.2mLPCR薄壁管或八聯(lián)管。5.14SYBRGreenI核酸染料(含酶)。5.15蛋白酶K(見附錄A.1)。5.1610%SDS液(見附錄A.2)。5.1770%乙醇(見附錄A.3)。6方法6.1樣品采集6.1.3細(xì)菌培養(yǎng)物：37℃培養(yǎng)24h～48h的細(xì)菌培養(yǎng)物。6.2.1組織樣品處理：取肺臟組織3g~5g于研缽中，用滅菌剪刀剪碎，加入2mLPBS緩沖液，研6.2.2細(xì)菌培養(yǎng)物處理：挑取3~4個細(xì)菌單菌落加入100μL滅菌水中，煮沸10min后，再放置-20℃凍結(jié)。凍融后，10000r/min6.3.1取樣品500μL于1.5mL離心管中，加入50μg/mL的蛋白酶K5μL,加入10%的SDS溶液25μL,55℃水浴2h～3h。6.3.5取上清于一新離心管中，加入2倍體積的無水乙醇，-20℃靜止20min,10000r/min離心156.3.6加入70%的乙醇沖洗沉淀表面及管壁，棄乙醇，晾干。6.4熒光定量PCR反應(yīng)體系6.5熒光定量PCR程序設(shè)定7結(jié)果判定3DB37/T2995—20177.1.2陽性對照Ct值<30,并出現(xiàn)特定擴增曲線，否則，此試驗視為無效。7.2判定Ct值>35,表明樣品為陰性。4DB37/T2995—2017滅菌雙蒸水(資料性附錄)試劑的配制十二烷基硫酸鈉滅菌雙蒸水濃鹽酸滅菌雙蒸水無水乙醇滅菌雙蒸水70mL30mL5DB37/T2995—2017組分反應(yīng)體系SYBRGreenI核酸染料引物P1引物P2DNA模板2.0μL滅菌水8.5μL總量25.0μL表B.2