DB21T 3785-2023 牛羊布魯氏菌病熒光偏振(FPA)檢測技術(shù)規(guī)程

ICS11.220CCSB4121IDB21/T3785—2023前言 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4縮略語 5生物安全要求 6技術(shù)原理 7設(shè)備試劑與材料 28樣品采集和處理 29操作前準(zhǔn)備工作 210試驗(yàn)操作 2附錄A（規(guī)范性）試劑配制 5DB21/T3785—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。本文件起草單位：遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心、錦州市疾病預(yù)防控制中心、哈爾濱平河生物技術(shù)有限公司、遼寧中科基因技術(shù)有限公司。本文件主要起草人：張雅為、于本良、顧貴波、蘭德松、朱江巍、王克才、陳瑤、段亞良、李井春、孫世宇、魏澍、張輝、劉坤洋、劉佳、白梅、張旭、李澤欽、張祎。本文件發(fā)布實(shí)施后，任何單位和個(gè)人如有問題和意見建議，均可以通過來電和來函等方式進(jìn)行反饋，我們將及時(shí)答復(fù)并認(rèn)真處理，根據(jù)實(shí)際情況依法進(jìn)行評估及復(fù)審。歸口管理部門通訊地址：遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳（沈陽市和平區(qū)太原北街2號(hào)聯(lián)系電話文件起草單位通訊地址:遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心（沈陽市沈北新區(qū)人和街95號(hào)），聯(lián)系電話1DB21/T3785—2023牛羊布魯氏菌病熒光偏振（FPA）檢測技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了牛、羊布魯氏菌病熒光偏振（FPA）檢測的生物安全要求、技術(shù)原理、設(shè)備試劑與材料、樣品采集和處理、操作前準(zhǔn)備、試驗(yàn)操作等技術(shù)內(nèi)容。本文件適用于牛、羊布魯氏菌抗體水平的初篩檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范NY/T1948獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全要求通則3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4縮略語下列縮略語適用于本文件。FPA:熒光偏振檢測（FluorescencePolarizationAssay）mP:熒光偏振值（MillipolarisationUnits）OPS:O-多糖（O-Polysaccharide）DEAE:二乙氨基乙基葡聚糖FITC:熒光素異硫氰酸酯5生物安全要求為了保護(hù)實(shí)驗(yàn)室檢測人員的安全，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在相應(yīng)級別的生物安全實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，嚴(yán)格按照GB19489和NY/T1948要求執(zhí)行。6技術(shù)原理溶液中的分子作隨機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)，分子的大小是影響轉(zhuǎn)動(dòng)速率的主要因素，與其成反比關(guān)系，因而小分子較大分子轉(zhuǎn)動(dòng)得快。如果給分子標(biāo)記上熒光色素，通過68.5o角度的轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)間，可以通過測量水平和垂直的偏振光強(qiáng)度來確定。2DB21/T3785—2023將試劑和樣品恢復(fù)至室溫(18℃~26℃),檢測操作應(yīng)在室溫(18℃~26℃)下進(jìn)行。10.1.1.6孵育至少2min,最長不超過5min。3DB21/T3785—202310.1.1.8對照結(jié)果：陰性對照牛血清的mP值低于90mP（通常在75mP左右）；陽性對照血清的mP值在200mP左右，則對照成立，可以進(jìn)行樣品檢測。否則，按照FPA儀器的操作軟件和操作程序，調(diào)試FPA檢測儀的參考因子值，使對照成立，才可進(jìn)行樣品的檢測。10.1.2樣品檢測10.1.2.1向每個(gè)10mm×75mm硼硅玻璃試管加入1mL的FPA樣品稀釋液，試管數(shù)量等于樣品數(shù)量。10.1.2.2在上述試管中加入待檢血清，用旋渦混合器振動(dòng)5s充分混合均勻。各畜種血清稀釋度具體如下：a)牛血清按10μL血清加到1.0mL樣品稀釋液中稀釋；b)綿羊血清按25μL血清加到1.0mL樣品稀釋液中稀釋；c)山羊血清按40μL血清加到1.0mL樣品稀釋液中稀釋。10.1.2.3使用試管型便攜式FPA儀讀取被檢樣品試管的空白密度值。10.1.2.4在上述試管中加入10μL的FPA標(biāo)記抗原，旋渦混合器振動(dòng)5s充分混合均勻。10.1.2.5孵育2min～5min。10.1.2.6使用試管型便攜式FPA儀讀取被檢樣品的mP值。試管的測量順序與讀取空白密度值時(shí)的順序一致。10.1.3結(jié)果判定10.1.3.1沒有接種布魯氏菌病疫苗的動(dòng)物：樣品mP值大于其閾值時(shí)，判為陽性；mP值小于閾值時(shí)，判為陰性；mP值等于閾值時(shí)，需重新檢測。牛、羊血清閾值如下：a)牛血清閾值為95mP；b)綿羊血清閾值為78mP；c)山羊血清閾值為88mP。10.1.3.2已經(jīng)接種A19疫苗12個(gè)月以后或接種S2疫苗6個(gè)月以后的動(dòng)物：a)牛血清＜95mP為陰性；95mP≤檢測值≤115mP為可疑；≥116mP為陽性；b)綿羊＜78mP為陰性；78mP≤檢測值≤88mP為可疑；＞88mP為陽性；c)山羊＜88mP為陰性；≥88mP為陽性。d)試驗(yàn)結(jié)果可疑牛、羊經(jīng)60d～90d后采血重檢，如果結(jié)果仍為可疑，判為陽性。微量法檢測10.2.1儀器校準(zhǔn)10.2.1.1每天第1次試驗(yàn)前或FPA檢測儀被移動(dòng)后，都要檢測對照血清。10.2.1.2在干凈的96孔黑色平底微量板的第1列中的6個(gè)孔中分別加入190μLFPA樣品稀釋液。復(fù)孔分別加入10μL的陽性（C++）、陰性（C-）的對照牛血清和樣品稀釋液（Cc）10.2.1.3振動(dòng)2min，充分混合均勻。使用臺(tái)式FPA儀讀取平板的空白密度值。10.2.1.4每孔加入10μLFPA標(biāo)記抗原，振動(dòng)2min，充分混合均勻。10.2.1.5孵育2min～5min。10.2.1.6使用臺(tái)式FPA分析儀讀取平板的檢測密度值mP值。檢測順序與讀取空白密度值時(shí)的順序一致。10.2.1.7對照結(jié)果：陰性對照血清的mP值低于90mP（通常在75mP左右）；陽性對照血清的mP值在200mP左右，則對照成立，可以進(jìn)行樣品檢測。否則，按照FPA儀器的操作軟件和操作程序，調(diào)試FPA檢測儀的參考因子值，使對照成立，才可進(jìn)行樣品的檢測。4DB21/T3785—202310.2.2樣品檢測10.2.2.1在干凈的96孔黑色平底微量板中每個(gè)孔加入190μLFPA樣品稀釋液。其中設(shè)置陽性對照和陰性對照孔各兩個(gè)。10.2.2.2向每個(gè)對照孔和樣品孔中分別加入10μL的陽性、陰性對照血清和被檢牛血清（1個(gè)孔檢測1個(gè)樣品），室溫下振動(dòng)2min，充分混合均勻。96孔黑色平底微量板置入熒光偏振檢測儀中進(jìn)行第一次讀數(shù)，得到對照血清和樣品的空白值。10.2.2.3從FPA檢測儀上取出96孔板向每個(gè)孔中分別加入10μL的FPA標(biāo)記抗原，室溫下振動(dòng)2min，充分混合均勻。10.2.2.4非自動(dòng)加樣的臺(tái)式FPA檢測儀，需要將96孔黑色平底微量板置入熒光偏振檢測儀中進(jìn)行第2次讀數(shù)，得到對照血清和樣品的mP值。平板的測量順序與讀取空白板時(shí)的順序一致。10.2.2.5自動(dòng)加樣的臺(tái)式FPA檢測儀，后續(xù)程序設(shè)置好后，儀器自動(dòng)加入10μL的FPA標(biāo)記抗原、然后振動(dòng)2min，充分混合均勻；再孵育至少2min；FPA檢測儀進(jìn)行第2次讀數(shù)，得到對照血清和樣品的mP值。10.2.3結(jié)果判定10.2.3.1陰性對照血清的讀值介于60mP～90mP之間，陽性對照血清的讀值介于140mP～300mP之間，試驗(yàn)成立。10.2.3.2沒有接種布魯氏菌病疫苗的牛、已經(jīng)接種A19疫苗12個(gè)月或接種S2疫苗6個(gè)月后的牛檢測，結(jié)果判定如下:a)牛血清＜95mP為陰性；95mP≤檢測值≤115mP為可疑；≥116mP為陽性；b)試驗(yàn)結(jié)果可疑牛經(jīng)60d～90d后采血重檢，如果結(jié)果仍為可疑，判為陽性。5DB21/T3785—2023（規(guī)范性）試劑配制A.1FPA標(biāo)記抗原制備制備OPS時(shí)，5g干重(或50g濕重)牛種產(chǎn)布魯氏菌S119-3株菌體懸液中加入400mL2%(V/V)醋酸，121℃高壓滅菌15min，于5℃±3℃10000g離心10min，去除菌體碎體。然后，上清液用20g的三氯醋酸沉淀任何蛋白質(zhì)和核酸,4℃1000g再離心10min去除沉淀。取上清液置100倍體積的蒸餾水透析，濃縮后凍干備用。將3mgOPS溶于0.6mL0.1M的氫氧化鈉(4克NaOH/升)中，37℃±2℃孵育1h，加入二甲亞砜配制的異硫氰酸熒光素異構(gòu)體-I(濃度為100mg/mL)0.3mL再于37℃±2℃溫育1h。結(jié)合的OPS加到1×10cm的用0.01MpH（7.4±0.2）磷酸緩沖液平衡的DEAE層析柱上。加10mL～15mL緩沖液后為亮綠色，然后換為pH（7.4±0.2）的0.1M的磷酸緩沖液，這將導(dǎo)致10mL～15mL的緩沖液洗脫后有25mL～40mL的綠色熒光物質(zhì)洗脫下來。將此物質(zhì)用作FPA中的抗原?？乖砂幢壤黾印Ｔ囼?yàn)所用抗