高三二輪復(fù)習(xí)生物【知識(shí)精研】《引物的設(shè)計(jì)與應(yīng)用》專題課件

一、引物的概念2017年，研究者利用現(xiàn)代人的DNA做了一個(gè)“魚(yú)餌”一般的引子，由于相似度高，這個(gè)引子會(huì)把所提取的DNA混合溶液里屬于古代人類本身的DNA吸附并釣取出來(lái)。“引子”是什么？怎么設(shè)計(jì)？引物的設(shè)計(jì)與應(yīng)用一、引物的概念多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種在體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。體內(nèi)DNA的復(fù)制時(shí)，引物酶將引物添加到子鏈的5’端。5′5′5′5′5′5′5′3′5′5′5′5′3′3′3′3′3′3′3′3′5′3′引物體內(nèi)DNA復(fù)制PCR技術(shù)（體外）引物的實(shí)質(zhì)一小段單鏈RNA一般用一小段單鏈____引物與DNA模板鏈的關(guān)系DNA復(fù)制時(shí)，DNA的_____條鏈作為模板，依據(jù)_____________原則，與目的基因的脫氧核苷酸序列配對(duì)引物的功能DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，只能從已有片段的____端延伸DNA鏈延伸方向從____端向____端延伸DNA2堿基互補(bǔ)配對(duì)3’5’3’一、引物的概念1.比較體內(nèi)與體外的引物2：找出幾個(gè)關(guān)鍵詞，嘗試概括引物是什么？引物:_______________________________________。一段能與母鏈DNA堿基互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸二、引物的設(shè)計(jì)1.小組討論：人為設(shè)計(jì)引物應(yīng)該注意些什么？1._________________2._________________3._________________4._________________引物之間不會(huì)自身配對(duì)或者相互配對(duì)引物與目的基因兩端互補(bǔ)配對(duì)兩引物的CG含量相當(dāng)，復(fù)性溫度相差小引物的長(zhǎng)度適宜（15-30bp)特異性高效性PCR過(guò)程中出現(xiàn)下列情況是由于引物設(shè)計(jì)中哪些問(wèn)題造成的，請(qǐng)配對(duì)三、引物的應(yīng)用資料1：亨廷頓舞蹈癥（簡(jiǎn)稱HD）是一種單基因的顯性遺傳病,由基因HTT的突變引起。HTT基因位于四號(hào)染色體,在其一號(hào)外顯子(exon1)區(qū)域有一段CAG重復(fù)序列。正常人群中這一重復(fù)序列的長(zhǎng)度為6~35個(gè)重復(fù),如果擴(kuò)增超過(guò)40個(gè)重復(fù)序列,則會(huì)導(dǎo)致發(fā)病,出現(xiàn)異常運(yùn)動(dòng)癥狀。HTTHtt1.亨廷頓舞蹈癥由哪一類可遺傳變異引起的疾??？能通過(guò)什么手段檢測(cè)？屬于基因突變引起的；需要通過(guò)基因檢測(cè)來(lái)判斷是否患病。5′CTTCGAAATTC——TCTCCCGATCGG——ATCCTTTGCTCT3′3′GAAGCTTTAAG——AGAGGGCTAGCC——TAGGAAACGAGA5′基因1基因2引物Ⅰ5′—CTTCGAAATTC—3′引物Ⅱ3′—AGAGGGCTAGCC—5′

3′—TAGGAAACGAGA—5′2.為了更好的檢測(cè)，醫(yī)生在提取小紅的DNA后首先進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，如果基因1是目的基因，應(yīng)該選擇哪一對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增？如果要擴(kuò)增基因2呢？5′—TCTCCCGATCGG—3′三、引物的應(yīng)用引物Ⅲ引物Ⅳ5′CTTCGAAATTC——TCTCCCGATCGG——ATCCTTTGCTCT3′3′GAAGCTTTAAG——AGAGGGCTAGCC——TAGGAAACGAGA5′基因1基因2三、引物的應(yīng)用引物Ⅰ5′—CTTCGAAATTC—3′3.根據(jù)引物設(shè)計(jì)的原則，這四個(gè)引物能夠同時(shí)在一個(gè)PCR體系下使用嗎？引物Ⅱ3′—AGAGGGCTAGCC—5′

引物Ⅳ5′—TCTCCCGATCGG—3′引物Ⅲ3′—TAGGAAACGAGA—5′

三、引物的應(yīng)用資料2：隨著對(duì)突變的亨廷頓蛋白如何導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙和死亡的理解日益增多,可開(kāi)發(fā)的合理治療靶點(diǎn)也變得豐富。最近發(fā)展的另一種靶向HTTDNA的技術(shù)則使用了失活的鋅指核酸剪切酶(ZFN)結(jié)合至HTT啟動(dòng)子區(qū)域,達(dá)到抑制HTT基因表達(dá)的效果，科學(xué)家想獲得完整的非編碼區(qū)序列來(lái)研究。HTT基因編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動(dòng)子終止子HTT基因編碼區(qū)啟動(dòng)子終止子三、引物的應(yīng)用2.擴(kuò)增兩側(cè)非編碼區(qū)需要設(shè)計(jì)幾個(gè)引物？請(qǐng)?jiān)趫D上標(biāo)注。3.已知HTT基因編碼區(qū)序列，能夠設(shè)計(jì)出幾個(gè)引物？能擴(kuò)增出完整的非編碼區(qū)嗎？5'5'3'3'？？1.閱讀資料2并圈出關(guān)鍵詞，想一想科學(xué)家為什么想獲得非編碼區(qū)序列？非編碼區(qū)序列包含啟動(dòng)子和終止子，可以通過(guò)對(duì)非編碼區(qū)的修飾，抑制轉(zhuǎn)錄形成mRNA。需要4個(gè)引物只能設(shè)計(jì)出兩個(gè)，不能擴(kuò)增完整的非編碼區(qū)。引物2引物1引物3引物4三、引物的應(yīng)用5.HTT基因上有多個(gè)限制酶切位點(diǎn)（如表），可以實(shí)現(xiàn)DNA片段的環(huán)化，應(yīng)當(dāng)選擇____________酶進(jìn)行酶切處理。選擇哪一對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增？EcoRⅠBclⅠBamHⅠHindⅢ5'-G↓AATTC-3'5'-T↓GATCA-3'5'-G↓GATCC-3'5'-A↓AGCTT-3'BclⅠ和BamHⅠ4.為解決上述問(wèn)題，科學(xué)家對(duì)DNA片段進(jìn)行了如圖所示處理，這樣處理的有何作用？如何實(shí)現(xiàn)DNA片段的環(huán)化？引物1引物4引物2引物3BclⅠEcoRⅠHindⅢBamHⅠ三、引物的應(yīng)用限制性內(nèi)切核酸酶切割該DNA酶切產(chǎn)物_____已知序列兩側(cè)攜帶有未知序列的環(huán)狀DNA分子已知序列為模板設(shè)計(jì)一對(duì)方向____的特異性引物擴(kuò)增出未知序列環(huán)化相反四、總結(jié)堿基互補(bǔ)配對(duì)核酸特異高效擴(kuò)增目的基因擴(kuò)增目的基因兩側(cè)未知序列PCR擴(kuò)增時(shí)，加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。當(dāng)探針完整時(shí)，R發(fā)出的熒光信號(hào)被Q吸收而不發(fā)熒光。在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，當(dāng)Taq酶遇到探針時(shí)會(huì)使探針?biāo)舛尫懦鲇坞x的R和Q,R發(fā)出的熒光信號(hào)被相應(yīng)儀器檢測(cè)到。核酸檢測(cè)我國(guó)科學(xué)家領(lǐng)銜的團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9等技術(shù)，將的人亨廷頓舞蹈病致病基因（HTT基因）第1外顯子“敲入”豬基因組內(nèi)，獲得了人—豬“鑲嵌”HTT基因，利用胚胎工程技術(shù)成功地構(gòu)建了亨廷頓舞蹈病的動(dòng)物模型?；蚓庉嫹謩e利用引物1和2，引物3和4進(jìn)行PCR后，得到的DNA片段可以通過(guò)引物2和3互補(bǔ)的堿基雜交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成為一條完整的DNA片段。四、拓展延伸有科學(xué)家想用CAA替換HTT基因CAG重復(fù)序列，（圖中重疊延伸PCR過(guò)程中，引物a、b用來(lái)擴(kuò)增含有突變位點(diǎn)的上游DNA序列，引物c、d用來(lái)擴(kuò)增含突變位點(diǎn)的下游DNA序列)。具體的步驟如下：HTTHTT(1)研究發(fā)現(xiàn)，亨廷頓舞蹈病患者編碼亨廷頓蛋白出現(xiàn)異常增多的谷氨酰胺（可能用到的密碼子：GAC：天冬氨酸，CAG：谷氨酰胺，GUC：纈氨酸，CUG：亮氨酸），圖中HTT基因的上鏈的堿基序列是CAG，則mRNA是以_______（上/下）鏈作為模板鏈的。重疊延伸PCR示意圖中的黑點(diǎn)表示突變部位的堿基，引物b中該部位的堿基是_______，引物C中該部位的堿基是_______。下TA四、拓展延伸有科學(xué)家想用CAA替換HTT基因CAG重復(fù)序列，（圖中重疊延伸PCR過(guò)程中，引物a、b用來(lái)