生物學(xué)考研經(jīng)典復(fù)習(xí)題

基因組學(xué)

基因組學(xué)Genomics

?基因組(Genome：Gene+chromosome)細(xì)胞或生物體中一套完整的單倍體遺傳物

質(zhì)

?基因組學(xué)(Genomics)最早ThomasRoderick在1986年提出，包括基因組作圖、測(cè)

序和分析?？煞譃榻Y(jié)構(gòu)基因組學(xué)和功能基因組學(xué)。

一、結(jié)構(gòu)基因組學(xué)

1.遺傳圖(GeneticMappingGenomes):Basedonthecalculationofrecombinationfrequency

bylinkageanalysis.通過(guò)親本的雜交，分析后代的基因間重組率，并用重組率來(lái)表示兩個(gè)

基因之間距離的線形連鎖圖譜

每條染色體組成一個(gè)連鎖群，所有染色體的連鎖群組成的圖譜即構(gòu)成基因組遺傳圖。

重組率代表基因位點(diǎn)之間的相對(duì)距離。在遺傳作圖中，人們把一個(gè)作圖單位定義為1厘摩

(cM),lcM等于1%的重組率。

提高遺傳作圖的分辨率:選用不同的雜交群體;增加雜交群體的數(shù)目；增加分子標(biāo)記的數(shù)目；

擴(kuò)大分子標(biāo)記的來(lái)源

分子標(biāo)記:繪制基因組遺傳圖需要的坐標(biāo)點(diǎn)。

分子標(biāo)記的主要來(lái)源是染色體上存在的大量等位基因。在DNA水平上，兩個(gè)基因間一個(gè)堿

基的差異就足以形成等位基因。

2.物聯(lián)L(physicalmap)：指DNA序列上兩點(diǎn)的實(shí)際距離，它是以DNA的限制酶片段或

克隆的大片段的基因組UNA分子為基本單位，以連續(xù)的里疊群為基本框架，通過(guò)遺傳

標(biāo)記將重疊群或基因組DNA分子有序排列于染色體上。

物理圖的繪制：BasedonmolecularhybridizationanalysisandPCRtechniques

雜交法；指紋法；熒光原位雜交技術(shù)。

3.基因組序列測(cè)定：Sequencingmethods:thechainterminationprocedure;

Map-basedclonebyclonestrategy;

Wholegenomeshotgun(WGS)strategy;

Sequenceassembly;

?傳統(tǒng)基因組測(cè)序的方法：克隆步移法(BAC-bv-BACStrateRv)和全基因組鳥搶法(Whole

GenomeShotgunStrategy)<.

?基因組測(cè)序戰(zhàn)略：基于物理圖的克隆連克降法、隨機(jī)挑選BAC克隆測(cè)序、逐步步

移法(LeeHood)、全基因組鳥槍法(CraigVenter)

4.基因組序列解析(AnnotatingGenomeSequence)：其目標(biāo)是建立高密度的遺傳圖、高分

辨率的物理圖和轉(zhuǎn)錄圖，最終完成全基因組序列測(cè)定和注解，是功能基因組學(xué)的基礎(chǔ)

基因組注解異常梵雜，它是一個(gè)繁雜的復(fù)合體，既包含了進(jìn)化歷史上原封未動(dòng)的部分，

也有大量的進(jìn)化史上重要?dú)v史事件的遺跡。

基因組有它自身的規(guī)律，但是一些“不和諧的韻律〃，如從病毒或者原核生物感染或寄生

得到的基因組片段、轉(zhuǎn)座元件、假基因以及重兔序列的存在，構(gòu)成了理解基因組結(jié)構(gòu)的四大

陷阱。

AnnotatingaGenomeSequence

(1).Genepredictionbysoftware;

Genefiding:Findgenesancgenestructuresfromgenomicsequences

Problems

Findingtheparts:收集可靠的信息，并識(shí)別信號(hào)或傳感卷作為整個(gè)基因的一部分?？赡苁?/p>

一些程序的端點(diǎn)，例如SplicePredictor.MZEF用于找尋外顯子。

Puttingpartstogether:使用適當(dāng)和有效的算法將部分組合在一起，產(chǎn)生完整的基因模型。許

多程序目前可用于全基因預(yù)測(cè)(GenScan,GeneMark.hrrm,Grail,Glimmer等)，這些程序

基于動(dòng)態(tài)規(guī)劃和基于HMM(隱馬爾可夫算法)，將部分組合成整體。

Threetypesofinformation:

Signals(signalsensors):短子序列例如剪接位點(diǎn)，polyA信號(hào)和其他基序。信號(hào)傳感器可以

表示為模式或權(quán)重矩陣。它們可以通過(guò)序列比對(duì)，統(tǒng)計(jì)方法或神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)獲得。.

Contentstatistics(contentsensors):描述了編碼區(qū)的非隨機(jī)性質(zhì)，例如密碼子偏好和反密碼

子偏好性。

Similarity：與已知基因的相似性可有助于提高signalsensor和contenststatistics的準(zhǔn)確性。

(2).Geneidentification:

expressedsequencetags(ESTs),

homologyanalysis,

mutations,

直系同源物：由共同的祖先基因進(jìn)化而來(lái)的不同生物的同源基因

旁系同源物：一個(gè)物種中通過(guò)基因復(fù)制而演化形成的同源基因

(類似基因：非來(lái)自相同祖先的基因，但通過(guò)會(huì)聚進(jìn)化而具有相似的功能特征的一個(gè)實(shí)

例是糜蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶的類似催化位點(diǎn))

Howtomeasuresimilarity

Identity:Twoproteinsthathaveacertainnumberofamino-acidsincommonatalignedpositions

aresaidtobeidenticaltothatdegree,(i.e.iftheyhave43residuesoutofatotalof100in

commontheyare43%identical).

Similarity:Oftenanumberofresidueswillbereplacedbyonesofsimilarphysico-chemical

properties.Suchmutationsmaybetermedconservativeandonemaydefinevariousscoring

matricestoquantifyhowsimilarthetwosequencesare,takingintoaccountconservative

mutations.Suchscoreswillbemeasuresofsimilarity.

Homology:Ifandonlyif1\NOproteinsareevolutionarilyrelatedanddescendfromacommon

ancestor,theyarecalledhomologous.Similarityandhomologyaretwodifferentconceptsand

mustnotbeconfused.

comparativeanalysisbetweengenomes;

Pair-wisesequencealignmentisafoundationaloperationunitformuchofthebioinformatics

analysis

(3).Transcriptome&Proteome;

二、功能基因組學(xué)

1、定義：利用結(jié)構(gòu)基因組提供的信息，在基因組或系統(tǒng)水平上全面分析基因的功能，使生

物學(xué)研究從對(duì)單一基因或蛋白質(zhì)研究轉(zhuǎn)向?qū)Χ鄠€(gè)基因或蛋白質(zhì)同時(shí)進(jìn)行的系統(tǒng)研究，是在基

因組靜態(tài)（堿基序列）清楚后轉(zhuǎn)入對(duì)基因組動(dòng)態(tài)（生物學(xué)功能）的研究。應(yīng)用高通量的方法

來(lái)平行研究大量基因。

2、任務(wù)：進(jìn)行基因組功能注釋（Genomeannotation）,了解基因的功能，掌握基因的產(chǎn)物

及其在生命活動(dòng)中的作用，從基因組的整體水平上來(lái)理解基因的功能與進(jìn)化。

3、功能基因組研究?jī)?nèi)容：突變體庫(kù)的構(gòu)建、全長(zhǎng)cDNA克隆與測(cè)序、獲得DNA芯片等基因

轉(zhuǎn)錄圖譜、高通量測(cè)序（NGS）轉(zhuǎn)錄組、植物全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）

、高通量的遺傳轉(zhuǎn)化鑒定系統(tǒng)、生物信息技術(shù)平臺(tái)與相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建

（1）突變體庫(kù)的構(gòu)建

變異是功能分析的基礎(chǔ)。突變體是功能基因組學(xué)研究的重要材料。

植物突變可在分子、細(xì)胞、組織、器官和個(gè)體等不同的水平上表現(xiàn)。一般分3種方法：

1.按突變方法分自然突變、物理化學(xué)誘變、DNA插入突變；

2.按遺傳背景分為普通突變體庫(kù)、近等基因系突變體庫(kù)和等基因系突變體庫(kù)：

3.按引起突變的分子機(jī)制分功能喪失突變和功能獲得性突變

（2）基因克隆的一般方法

植物的生長(zhǎng)發(fā)育是在多個(gè)代謝和生理過(guò)程基礎(chǔ)上所發(fā)生的基因在時(shí)空上表達(dá)的綜合現(xiàn)

象，分離潛在的各種有價(jià)值的基因，對(duì)植物特別是作物品種改良具有重要意義。

因此，對(duì)基因的克隆并發(fā)展與之相關(guān)的技術(shù)非常重要。

（3）高通量測(cè)序轉(zhuǎn)錄組技術(shù)

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序亦稱RNA-Seq（RNASequencing）,是指利用第二代高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行

CDNA測(cè)序，全面快速地獲取某一物種特定器官或組織在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本

RNA-seq：雙鏈均能被隨機(jī)測(cè)序以致不能確定轉(zhuǎn)錄本方向

ssRNA-seq：通過(guò)消除雙鏈中的反向鏈來(lái)特異識(shí)別轉(zhuǎn)錄本方向

ssRNA-seq：通過(guò)給5'末端脫磷酸->3'末端加adapter->5'復(fù)磷酸->5'加adapter來(lái)識(shí)別

轉(zhuǎn)錄本方向

NGS在轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中應(yīng)用：轉(zhuǎn)錄組學(xué)：在整體水平上研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)

控規(guī)律的學(xué)科?，研究已知基因的SNP、Indel等，研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的有力工

具，通常川于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)或組蛋白特異性修飾位點(diǎn)的研究。將ChIP與第二代測(cè)序技

術(shù)相結(jié)合的ChlP-Seq技術(shù)，能夠高效地在全基因組范圉內(nèi)檢測(cè)與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作

的DNA區(qū)段。測(cè)量基因表達(dá)水平，檢測(cè)部分轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)新的基因和轉(zhuǎn)錄本，

檢測(cè)發(fā)生在外顯子部分的基因突變，發(fā)現(xiàn)基因融合等。綜合mRNA-IncRNA共表達(dá)分析以及

microRNA靶基因分析，可以有效的解析IncRNA參與生物過(guò)程的分子機(jī)制

方法：功能克隆法，同源序列法，轉(zhuǎn)座子或T-DNA標(biāo)簽法，表達(dá)序列標(biāo)簽法(EST)或全長(zhǎng)

CDNA文庫(kù)構(gòu)建法，差異表達(dá)基因分離技術(shù)以及最新的高通量測(cè)序轉(zhuǎn)錄組

(4)基因的圖位克隆

圖位克隆(map-basedcloning)：又稱定位克隆(positionalcloning),1986年由劍橋大學(xué)的

AlanCoulcon提出。

該方法分離基因是根據(jù)目的基因在染色體上的位置進(jìn)行基因克隆的一種方法。在利用分了?標(biāo)

記技術(shù)對(duì)目的基因進(jìn)行精確定位的基礎(chǔ)上，使用與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記篩選DNA

文庫(kù)，從而構(gòu)建目的基因區(qū)域的物理圖譜，再利用此物理圖譜通過(guò)染色體步行逼近目的基因

最終找到包含該目的基因的克隆，最后通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補(bǔ)驗(yàn)證最終確定目的基因的堿

基序列。

圖位克隆的特點(diǎn)：無(wú)需預(yù)先知道基因的DNA序列，也無(wú)需預(yù)先知道其表達(dá)產(chǎn)物的有美信息。

但應(yīng)有以下兩方面的基本情況：

1.有一個(gè)根據(jù)目的基因的有無(wú)建立起來(lái)的遺傳分離群體，如F2、DH等。

2.開展以下幾項(xiàng)工作：

找到與FI的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記；

遺傳作圖和物理作圖將目標(biāo)基因定位在染色體；

構(gòu)建含有大插入片斷的基因組文庫(kù)；

特定連鎖探針篩選基因組文庫(kù)；

用獲得陽(yáng)性克隆構(gòu)建目的基因區(qū)域的重疊群；

通過(guò)染色體步行、登陸或跳躍獲得帶有目標(biāo)基因的大片段克??；

亞克隆小片段克??；

通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補(bǔ)驗(yàn)證目的基因的堿基序列。

(5)植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展

定義：應(yīng)用DNA重組技術(shù)，將外源基因通過(guò)生物、物理或化學(xué)手段導(dǎo)入植物基因組，以獲

得外源基因穩(wěn)定遺傳和表達(dá)的植物遺傳改良體。

技術(shù)方法：

基因槍轟擊法；

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法；

PEG轉(zhuǎn)化法；

電激法(目前很少應(yīng)用)；

低能離子束介導(dǎo)法(該技術(shù)不成熟)。

4、在植物功能基因組研究中發(fā)揮重要作用的技術(shù)：

植物轉(zhuǎn)化(PlantTransformation)

增強(qiáng)子捕獲(Enhancertrapping)

插入突變(TransposonT-DNAInsertion)

基因敲除(GeneKnockout)

基因沉默(GeneSilencing)

異位表達(dá)(EctopicExpression)

5、水稻基因組學(xué)

目標(biāo)1：鑒定水稻基因組結(jié)構(gòu)、變異和群體遺傳學(xué)分析

目標(biāo)2：基因組變異與表型變異關(guān)聯(lián)(開發(fā)基因組學(xué)研究的新方法，系統(tǒng)鑒定和挖掘水稻品

種的遺傳多樣性，開展高效的水稻功能基因組研究)

目標(biāo)3：闡明水稻的馴化和遺傳育種改良史

具體研究工作：

1、水稻4號(hào)染色體精細(xì)測(cè)序、水稻高通量轉(zhuǎn)錄組分析和高通量基因型鑒定

2、建立水稻重要農(nóng)藝性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析研究體系和分析方法

3、運(yùn)用基因組學(xué)研究手段開展水稻馴化起源和相關(guān)性狀基因的克隆和功能研究

4、其它植物基因組相關(guān)研窕

水稻全基因組關(guān)聯(lián)分析分析框架

最后一張ppt老師留的思考題：

1、什么叫基因組學(xué)？

基因組學(xué)最早由ThomasRoderick在1986年提出，足研究生物基因組和如何利用基因的一

門學(xué)問(wèn)，包括基因組作圖、測(cè)序和分析工可分為結(jié)構(gòu)基因組學(xué)和功能基因組學(xué)，該學(xué)科提供

基因組信息以及相關(guān)數(shù)據(jù)系統(tǒng)利用，試圖解決生物，醫(yī)學(xué)，和工業(yè)領(lǐng)域的重大問(wèn)題。

2、基因組的研究?jī)?nèi)容？

基因組研究應(yīng)該包括兩方面的內(nèi)容：以全基因組測(cè)序?yàn)槟繕?biāo)的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(structural

genomics)和以基因功能鑒定為目標(biāo)的功能基因組學(xué)(functionalgenomics),又被稱為后基

因組(postgenome)研究，成為系統(tǒng)生物學(xué)的重要方法。

功能基因組學(xué)的研究?jī)?nèi)容：人類基因組DNA序列變異性研究、基因組表達(dá)調(diào)控的研究、模

式生物體的研究和生物信息學(xué)的研究等。

結(jié)構(gòu)基因組學(xué)：其目標(biāo)是建立高密度的遺傳圖、高分辨率的物理圖和轉(zhuǎn)錄圖，最終完成全基

因組序列測(cè)定和注解，是功能基因組學(xué)的基礎(chǔ)。

3、基因組學(xué)有哪些研究手段和方法？

通過(guò)建立高密度的遺傳圖、高分辨率的物理圖和轉(zhuǎn)錄圖，最終完成全基因組序列測(cè)定和注解

(包括DNA層次、蛋白質(zhì)層次和代謝調(diào)控過(guò)程層次)。測(cè)序技術(shù)有：全基因組鳥搶法、基于

物理圖的克隆連克隆法、生物芯片技術(shù)、第二代測(cè)序技術(shù)(454高通量測(cè)序、IlluminaSolexa

測(cè)序技術(shù)、Solid測(cè)序技術(shù))、第三代測(cè)序技術(shù)(單分子測(cè)序)

4、水稻基因組學(xué)研究的主要進(jìn)展？

開發(fā)基于測(cè)序的基因分型技術(shù)及對(duì)重組群體的遺傳分析

建立水稻重要農(nóng)藝性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析研究體系和分析方法

水稻單倍體圖譜構(gòu)建&品質(zhì)、產(chǎn)量和抗性等復(fù)雜性狀關(guān)聯(lián)分析

水稻開花期等重要農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)分析及候選基因的精確定位

水稻基因鑒定和功能研究

文獻(xiàn)概括：

目標(biāo)1：鑒定水稻基因組結(jié)構(gòu)、變異和群體遺傳學(xué)分析

目標(biāo)2：基因組變異與表型變異關(guān)聯(lián)（開發(fā)基因組學(xué)研究的新方法，系統(tǒng)鑒定和挖掘水稻品

種的遺傳多樣性，開展高效的水稻功能基因組研究）

目標(biāo)3：闡明水稻的馴化和遺傳育種改良史

具體研究工作：

⑴水稻4號(hào)染色體精細(xì)物理圖的構(gòu)建及水稻基因組精確測(cè)序；

⑵通過(guò)比較基因組和功能基因組，發(fā)現(xiàn)了一系列在水稻抗熱，抗旱和抗鹽生理過(guò)程中起重要

作用的基因；

⑶以第二代測(cè)序儀為基礎(chǔ)的高通軟功能基因組研究平臺(tái)為大規(guī)模發(fā)現(xiàn)和利用水稻遺傳資源

開辟了有效的新途徑：

⑷利用基因組學(xué)和群體遺傳學(xué)的方法來(lái)揭示水稻馴化過(guò)程和栽培稻的起源。

3.周金秋chromosome>chromatinandtelomeres

ChromosomeandChromatin

染色體和染色質(zhì)的功能:

1.儲(chǔ)存基因信息

2.把復(fù)制的DNA精確復(fù)制到兩個(gè)后代染色體中

3.轉(zhuǎn)錄，復(fù)制，重組和修復(fù)的平臺(tái)

如何從染色體中獲得遺傳信息？

染色質(zhì)的兩種形式：常染色質(zhì)&異染色質(zhì)

染色質(zhì)活性態(tài)沉默態(tài)結(jié)構(gòu)域形成與維持，幾乎涉及所有組成分子：

1.DNA序列：異染色質(zhì)區(qū)含大量重復(fù)序列板塊；常染色質(zhì)順式元件對(duì)相鄰異染

色質(zhì)沉默高度敏感

2.組蛋白和非組蛋白：組蛋白變體；組蛋白尾區(qū)各種修飾位點(diǎn)；非組蛋白

3.RNA:ncRNA

常染色質(zhì)：易脆；活躍；在核內(nèi)

異染色質(zhì)：染色深；折疊致密；基因不活躍；在核邊緣

Constitutive異染色質(zhì)：固定的不可逆的異染包質(zhì)（例如著絲粒和端粒）

兼性異染色質(zhì)：能夠變成常染色質(zhì)（例如不活躍的X染色體）

染色體組成：DNA、組蛋白、非組蛋白、RNA和脂質(zhì)

染色質(zhì)的基本重復(fù)單位nucleosome

核小體定位（nucleosomepositioning）核心組蛋白DNA特異序列經(jīng)相互識(shí)

別與誘導(dǎo)契合，確定八聚體在DNA超螺旋中的結(jié)合部位以及兩者空間結(jié)構(gòu)關(guān)系。

核小體定位影響因素：1.偏好：基因上游啟動(dòng)子區(qū)；2.DNA構(gòu)象；3.八聚體藏性

氨基酸正電荷側(cè)鏈與DNA負(fù)電荷磷酸基靜電引力；4.非組蛋白，核酸酶，轉(zhuǎn)錄

調(diào)節(jié)因子的影響；5.八聚體各亞基間和組蛋白DNA間界面中，水分子和離子的

影響。

核小體由5種組蛋白構(gòu)成：H2A,H2B,H3,H4作為核心組蛋白，H1起連接作用；

核小體提供了核內(nèi)最低等級(jí)的DNA壓縮方式；核小體通常伴隨轉(zhuǎn)錄

染色質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)染色質(zhì)組裝

DNA(2nM)——核小體(10nm)——螺旋管solenoid(30nm)——染色質(zhì)樣纖維

chromoncmafibcr(60-100nm)loop玫瑰花結(jié)rosette染色質(zhì)有絲分

裂時(shí)壓縮為染色體

注：

1.組蛋白尾區(qū)和接頭H1,是壓縮陣列形成與穩(wěn)定的必需要素

2.染色體結(jié)構(gòu)維持蛋勺(SMCproteins)是一組高度保守的染色體ATPases,在

染色體組裝及動(dòng)態(tài)變化中發(fā)揮著基本作用：

三種核酸內(nèi)切酶敏感位點(diǎn)指示染色質(zhì)高轉(zhuǎn)錄活性

DNaseI,DNaseII,微球菌核酸酶

表觀遺傳標(biāo)志：

核定位，DNA甲基化，組蛋白修飾，非編碼RNA

各表觀遺傳機(jī)制共同調(diào)節(jié)基因的表達(dá)或沉默：

1.DNA甲基化：DNAmethyltransferase

去甲基化:兩種途徑：Tet酶orBERpathway

DNA甲基化DNA去甲基化

CpGIsland:aclusterofCpGresiduesoftenfoundneargenepromoters;?60%ofall

genesarcassociatedwithCpGislands;MostCpGislandsarcunmcthylatcdinnormal

cells;Itsmethylationisassociatedwithcancer（在基因啟動(dòng)子附近經(jīng)常發(fā)現(xiàn)一組CpG

殘留物;60%的基因與CpG島有關(guān);大多數(shù)CpG島在正常細(xì)胞中沒有甲基化花的

甲基化與癌癥有關(guān)）

2.組蛋白尾修飾

3.沉默染色質(zhì)個(gè)和異染色質(zhì)類似的概念

■基因沉默：genesilencingactsinaregionalmanner（ratherthanpromoter-or

sequence-specific%。generatelargedomainsorDNAthatareusuallyinaccessibleto

DNAbindingproteins（RNApolymerase,cellularrecombinationmachinary,

exogenousenzymes（dammethykransferaseandrestrictionendonuclease）（基因沉

默行為在一個(gè)地區(qū)的方式（而不是啟動(dòng)子或sequence-specific）生成大域或DNA

通常無(wú)法進(jìn)入DNA結(jié)合蛋白（RNA聚合酶、細(xì)胞重組機(jī)械，外源性酶（大壩甲

基轉(zhuǎn)移酶和限制性內(nèi)切核酸酶））

?Silentchromatindomain:Ttispersistentthroughmitoticandmcioticcelldivisions

suchthataparticularchromatinstructure（DNAanditsassociatedproteins）is

replicatedduringtheprocessofchromosomeduplication.Thismodeofinheritance,

commonlyreferredtoasepigeneticinheritance,isbelievedtounderliecellular

memor\Tmechanismsthatmaintaincellidentityandstablepatternsofgene

expressionineukaryotes.（沉默染色質(zhì)域:在染色體復(fù)制過(guò)程中，通過(guò)有絲分裂

和減數(shù)分裂的細(xì)胞分裂，使一種特殊的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)（DNA及其相關(guān)蛋白）復(fù)制。

這種遺傳模式，通常被稱為表觀遺傳，被認(rèn)為是細(xì)胞記憶機(jī)制的基礎(chǔ)，這種

機(jī)制在其核生物中維持細(xì)胞的身份和穩(wěn)定的基因表達(dá)模式。）

?序列特征：重復(fù)DNA序列以及可能于穩(wěn)定這樣的結(jié)構(gòu)有關(guān)。

?沉默染色質(zhì)異染色質(zhì)的生化特征：H3K9甲基化的普遍性；賴氨酸殘基的低

乙?；?；DNA胞啥咤甲基化

?常染色質(zhì)和異染色質(zhì)的比較（染色、形態(tài)特征，序列，基因密度，減數(shù)分裂

重組頻率，復(fù)制時(shí)期，HSsite,核小體分布，核酸酶可接進(jìn)性，活性狀態(tài)，

特征性修飾）

II.Centromere著絲粒

著絲粒：

著絲粒是存在于真核生物染色體上，動(dòng)粒裝配的區(qū)域；

是有絲分裂過(guò)程中，紡錘體發(fā)出的紡錘絲附著于染色體的部位；

是細(xì)胞分裂過(guò)程中，姐妹染色單體相互黏著的部位；

是保證經(jīng)復(fù)制的染色體精確分配的一段染色質(zhì)區(qū)滋。

著絲粒的結(jié)構(gòu)：

?1個(gè)著絲粒，結(jié)構(gòu)復(fù)合體，動(dòng)粒-紡錘絲，一系列著絲粒特異相關(guān)蛋白(CENP)

?著絲粒序列：在多數(shù)真核生物中，著絲粒沒有明確的序列；典型的著絲粒由

大片范圍的重復(fù)DNA序列構(gòu)成，這些重復(fù)序列相似卻不完全相同。

?酵母著絲粒相對(duì)簡(jiǎn)單；人類著絲粒：高度重復(fù)的、隨機(jī)排布的衛(wèi)星DNA,

長(zhǎng)達(dá)300-5000kb

動(dòng)粒Kinetochore

動(dòng)粒是是真核細(xì)胞染色體中位于著絲粒兩側(cè)的兩層盤狀特化結(jié)構(gòu)，其化學(xué)本質(zhì)

為蛋白質(zhì)，是非染色體性質(zhì)物質(zhì)附加物。

動(dòng)粒與染色體的移動(dòng)有關(guān)。在細(xì)胞分裂的前、中、后期等幾個(gè)階段，紡錘體的

紡錘絲(或星射線)需附著在染色體的動(dòng)粒上，牽引染色體移動(dòng)、將染色體拉向

細(xì)胞兩極。

III.ChromosomeTerritory染色體領(lǐng)域

解釋了染色質(zhì)纖維纏繞成染色體時(shí)為何不會(huì)相互打結(jié)，andmoresignificance

Concept:Thenaturalhabitatofeukaryoticgenomesisthecellnucleus,whereeach

chromosomeisconfinedtoadiscreteregion,referredtoasachromosometerritory.

定位FISHanalysisofchromosome(greenorredorblue).熒光原位雜交技術(shù)。

TotalDNAisstainedwithDAPI(blue)

Highlights:

1.Eachchromosomeoccupiesadistinctnuclearsubvolumeintheformofa

chromosometerritory.染色體領(lǐng)域。

2.Thespatialpositioningofchromosomeswithintheinterphasenucleusisoften

nonrandom.染色體的空間定位通常是非隨機(jī)的。

3.Chromosomesexhibittissue-specificorganization.Chromosomesaredistributed

tissuc-spccifically(relativetothecenterofthenucleusandalsorelativetoeach

other)血織特異性°

4.Subsetsofchromosomesformdistincttypesofspatialclustersindifferenttissues

andtherelativedistancebetweenchromosomepairsvariesamongtissues.空訶簇。

5.Nonrandomspatialproximityisfunctionallyrelevant(genesilenceactivation,

translocationin).非隨機(jī)空間鄰近性在功能上是相關(guān)的(基因沉默激活，轉(zhuǎn)

位）。

現(xiàn)存問(wèn)題及未來(lái)方向：

到目前為止，這個(gè)領(lǐng)域的大部分工作都是描述性和相關(guān)的。

確定核空間內(nèi)單個(gè)基因、基因組區(qū)域和全染色體重新定位的分子機(jī)制。

確定這些機(jī)制如何反應(yīng)，并通過(guò)信號(hào)通路促進(jìn)生理信號(hào)，如刺激。

充分理解一維DNA序列是如何引起基因轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的多維復(fù)雜性的，它決定了

生命的所有方面。

IV.Telomere

1、端粒和端粒酶

?概述：端粒是存在于真核生物線性染色體末端的特化的功能復(fù)合體，是由重

復(fù)的DNA序列及端粒相關(guān)蛋白構(gòu)成，對(duì)于維持真核基因組完整性和穩(wěn)定性至

關(guān)重要。（端粒、著絲粒和復(fù)制原點(diǎn)是染色體保持完整和穩(wěn)定的三大要素。）

?功能：1.防止DNA修復(fù)系統(tǒng)錯(cuò)誤地將染色體末端識(shí)別為染色體斷口而將染色

體粘接起來(lái)；2.促進(jìn)末端染色體的復(fù)制；3.抑制端粒附近的基因轉(zhuǎn)錄。

即是保持線性染色體的穩(wěn)定，即不環(huán)化、不粘合、不被降解。

?端粒結(jié)構(gòu)（1著絲粒、2亞端粒區(qū)域，3端粒重復(fù)區(qū)）。

哺乳動(dòng)物端粒示意圖：注意到哺乳動(dòng)物端粒并不是過(guò)去認(rèn)為的線性結(jié)構(gòu)，而

是形成DNA環(huán)（T環(huán)）

?端粒的延伸——端粒的

歷史：最早提出了端粒延伸的兩種可能途徑：同源重組？酶？Grcidcr和

Blackburn證實(shí)了后者的正確性

人類端粒酶結(jié)構(gòu)：hTERT（humantelomerasereverse

trancriptase）+h^R（humantelomerasetemplateRNA）

端粒延伸的機(jī)制：G鏈由端粒酶合成，hTR是端粒合成的模板：C鏈通過(guò)常

規(guī)的RNA引發(fā)DNA復(fù)制的方式進(jìn)行合成。

注：應(yīng)當(dāng)注意到，端粒酶不是孤立作用的，它在染色體末端受到相關(guān)蛋白的

調(diào)節(jié)。以酵母為例：

2、端粒位置效應(yīng)：TelomerePositionEffect（TPE）

?概述：端粒是基因調(diào)控的特殊位點(diǎn)，常可抑制位于端粒附近基因的轉(zhuǎn)錄

活性，這樣的效應(yīng)稱端粒的位置效應(yīng)。

?TPE涉及眾多端粒結(jié)合蛋白的參與，如：酵母中的Sir234等

?端粒在細(xì)胞核中的定位亦受到一些蛋白的影響，如：yKu7080復(fù)合物和

Sir234特異影響端粒在分裂間期的核定位。

3、端粒和衰老

?幾個(gè)易混淆的重要概念：

Aging（老化）：theprogressivelossoffunctionaccompaniedbydecreasing

fertilityandincreasemortalitywithadvancingage

Senescence（衰老）:thestateorprocessofaging

ReplicativeSenescence（Cellularsenescence）（復(fù)制細(xì)胞衰老）:astatethatcells

arrestaftertheyundergoalimitednumberofcelldivision

Lifespan（壽命）:atimeperiodcells（ororganism）canlive

?衰老表型（senescentphenotypes）:

1.不可逆的細(xì)胞分裂阻滯（DNA含量保持G1期狀態(tài)，不能重新啟動(dòng)有絲

分裂）

2.對(duì)凋亡的抵抗（例如：人的成纖維細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞）

3.細(xì)胞形態(tài)和代謝的改變，分化功能的重排（例如：細(xì)胞變大，溶酶體活

性增強(qiáng)，B-半乳糖甘酶表達(dá)）

?衰老表型的誘導(dǎo)因素：端粒縮短，抑癌基因的活性，DNA損傷，癌基因有

絲分裂刺激，染色質(zhì)重構(gòu)……

?不可逆生長(zhǎng)捕獲，細(xì)胞凋亡抵抗，改變分化的功能，其他……

?端粒和衰老的聯(lián)系

培養(yǎng)正常的人類體細(xì)胞，在一定數(shù)量的分裂;50代）后，表現(xiàn)出有限的生命

期并進(jìn)入衰老。

在人體細(xì)胞中，端?？s短了5-20次，每個(gè)細(xì)胞分裂一次。

大多數(shù)體細(xì)胞都沒有可檢測(cè)的端粒酶活性。

端粒長(zhǎng)度隨著細(xì)胞的年齡而縮短，當(dāng)端粒變得太短時(shí)，細(xì)胞最終死亡。

?端粒丟失的衰老學(xué)說(shuō)（端粒長(zhǎng)度一一有絲分裂鐘）

在沒有端粒酶的情況下，端粒會(huì)隨著細(xì)胞分裂而縮短。當(dāng)端粒達(dá)到極短的長(zhǎng)

度時(shí)，正常細(xì)胞不可逆轉(zhuǎn)地阻止增殖，并獲得一個(gè)特征放大的形態(tài)和多種改變的

功能。這種反應(yīng)被稱為復(fù)制性或細(xì)胞衰老。

總結(jié)：端粒酶活性一一端粒穩(wěn)態(tài)一一抑制染色質(zhì)不穩(wěn)定性一一延長(zhǎng)壽命。

4、端粒和癌癥

1.腫瘤是由突變引起的，它能激活致癌基因并關(guān)閉腫瘤抑制基因。

2.很少有顯著的例外，沒有多少人的腫瘤細(xì)胞會(huì)使它成為成熟的臨床相關(guān)

腫瘤，而沒有克服端粒依賴性的復(fù)制衰老。

3.在人類中，許多類型的癌細(xì)胞中檢測(cè)到的端粒酶活性，在大多數(shù)體細(xì)胞

譜系中無(wú)法檢測(cè)到。

4.端粒酶在絕大多數(shù)腫瘤中呈高表達(dá)(85%),但少數(shù)(10-15%)的端粒

酶陰性腫瘤仍能維持端粒的穩(wěn)定長(zhǎng)度。

5.這些少數(shù)的腫瘤細(xì)胞是通過(guò)端粒的替代延長(zhǎng)途徑(ALT)維持端粒長(zhǎng)度

的。ALT的本質(zhì)是同源重組。

同源重組：由一個(gè)端粒退火的DNA鏈與另一個(gè)端粒的互補(bǔ)鏈，從而利

用互補(bǔ)鏈作為復(fù)制模板啟動(dòng)新的端粒DNA的合成。

RAD52是一種蛋白質(zhì)，在人類是由RAD52基因編碼的。由該基因編碼

的蛋白質(zhì)與酵母菌(S.ccrcvisiacRad52)相似，它是DNA雙鏈斷裂修復(fù)和同

源重組的重要蛋白。可以結(jié)合單鏈DNA末端，并介導(dǎo)DNA與DNA的相互

作用，以使互補(bǔ)DNA鏈的退火。它也被發(fā)現(xiàn)與DNA重組蛋RAD51相互作

用，這表明它在與RAD51相關(guān)的DNA重組和修復(fù)中的作用。

?靶向端粒酶——腫瘤治療的一個(gè)策略，包括靶向人端粒逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT

和靶向端粒模板hTR(TelomeraseRNA)

a)催化(hTERT)組件

a)反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑

b)hTERT啟動(dòng)子基因療法

c)顯性-陰性或shRNAhTERT基因治療

d)小分子抑制劑

b)模板(hTERC)功能RNA組件

a)錘頭核糖酶一一hTR模板

b)寡核甘酸一一端粒酶模板拮抗劑

展望：chromosome的未來(lái)研究趨

有機(jī)體應(yīng)對(duì)端粒縮短策略

細(xì)小病毒：通過(guò)DNA

腺病毒:蛋白質(zhì)啟動(dòng)

果蠅:逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座

一些植物和昆蟲：同源重組？

多數(shù)真核生物:端粒酶

未來(lái)的方向：

染色體隔離機(jī)制

染色體包裝機(jī)制

端粒的信號(hào)機(jī)制

與染色體染色質(zhì)生物學(xué)有關(guān)的疾病基因

治療策略

補(bǔ)充材料

染色體

染色體是細(xì)胞內(nèi)具有遺傳性質(zhì)的物體，易被堿性染粒染成深色,所以叫染色體（染色質(zhì)）;

其本質(zhì)是脫氯核甘酸，是細(xì)胞核內(nèi)由核蛋白組成、能用堿性染料染色、有結(jié)構(gòu)的線狀體，是

遺傳物質(zhì)基因的載體。

超微結(jié)構(gòu)

染色體的超微結(jié)構(gòu)顯示染色體是由直徑僅100埃的DNA-組蛋白高度螺旋化的纖維所組

成。每一條染色單體可看作一條雙螺旋的DNA分子。有絲分裂間期時(shí)，DNA解螺旋而形成

無(wú)限伸展的細(xì)絲，此時(shí)不易為染料所著色，光鏡下呈無(wú)定形物質(zhì)，稱之為染色質(zhì)。有絲分裂

時(shí)DNA高度螺旋化而呈現(xiàn)特定的形態(tài)，此時(shí)易為堿性染料著色，稱之為染色體。纖絲的結(jié)

構(gòu)單位是核小體，它是染色體結(jié)構(gòu)的最基本單位。核小體的核心是由4種組蛋白（H2A、H2B、

H3和H4）各兩個(gè)分子構(gòu)成的扁球狀8聚體?，F(xiàn)在我們知道，DNA分子具有典型的雙蟒旋結(jié)

構(gòu)，一個(gè)DNA分子就像是一條長(zhǎng)長(zhǎng)的雙螺旋的纖絲。一條染色體有一個(gè)DNA分子。DNA雙

螺旋依次在每個(gè)組蛋白8聚體分子的表面盤繞約1.75|卷，其長(zhǎng)度相當(dāng)于140個(gè)堿基對(duì)。組

蛋白8聚體與其表面上盤繞的DNA分子共同構(gòu)成核小體。在相鄰的兩個(gè)核小體之間，有長(zhǎng)

約50?60個(gè)堿基對(duì)的DNA連接線。在相鄰的連接線之間結(jié)合著一個(gè)第5種組蛋白（H1）的

分子。密集成串的核小體形成了核質(zhì)中的100埃左右的纖維，這就是染色體的“一級(jí)結(jié)構(gòu)”，

就像成串的珠子一樣，DNA為繩，組蛋白為珠，被稱作染色體的“繩珠模型”如圖一染色

體的“繩珠模型北

染色體復(fù)制時(shí)的形態(tài)

著絲粒的位置靠近染色體的一端時(shí)，根據(jù)著絲粒離開端部的遠(yuǎn)近，這著絲粒叫做近端部

著絲?；蚨瞬恐z粒。著絲粒所在的地方往往表現(xiàn)為一個(gè)縊痕，所以著絲粒乂稱初級(jí)縊痕,

有些染色體上除了初級(jí)縊痕以外，還有?個(gè)次級(jí)縊痕，連上?個(gè)叫做隨體的遠(yuǎn)端染色體小段。

次級(jí)縊痕的位置也是固定的。在細(xì)胞分裂將結(jié)束時(shí)，核內(nèi)出現(xiàn)一個(gè)到幾個(gè)核仁，核仁總是出

現(xiàn)在次級(jí)縊痕的地方，所以次級(jí)縊痕也叫做核仁形成區(qū)。著絲粒的220對(duì)堿基序列兩側(cè)是限

制性內(nèi)切核酸酶敏感位點(diǎn)，該位點(diǎn)的功能也許是促進(jìn)DNA的斷裂，有助于染色單體在后期

的相互分離。限制性內(nèi)切核酸酶是一種在核酸內(nèi)特殊位點(diǎn)進(jìn)行切割的酶類。

著絲粒DNA序列

著絲粒DNA序列與染色體的分離有關(guān)。著絲粒DNA序列能確保染色體在細(xì)胞分裂時(shí)能

被平均分配到2個(gè)子細(xì)胞中去。著絲粒DNA序列特點(diǎn)：（1）一方面在所有的真核生物中它

們的功能是高度保守的，另一方面即使在親緣關(guān)系非常相近的物種之間它們的序列也是多樣

的。（2）絕大多數(shù)生物的著絲粒都是由高度重復(fù)的串聯(lián)序列構(gòu)成的，然而，在著絲粒的核心

區(qū)域，重更序列的刪除，擴(kuò)增以及突變發(fā)生的非常頻繁，目前的種種研究表明，重復(fù)序列并

不是著絲?；钚运仨毜模?）有些科學(xué)家提出了可能是DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)甚至是高級(jí)結(jié)構(gòu)

是決定著絲粒位置和功能的因素，即功能的序列無(wú)關(guān)性。

端粒DNA序列

為一段短的正向重復(fù)序列，在人類為TTAGGG的高度重復(fù)序列。端粒DNA功能是保證

染色體的獨(dú)立性和遺傳穩(wěn)定性。染色體的分裂有二種；一是母鐘分裂，意思是按照母體藍(lán)圖

進(jìn)行子代分裂，被分裂的23對(duì)染色體分別可以造出各種組織器官，如果第一條是造肝的，

那么它上面的所有造肝的基因片段都被打開，相反其它器官的制造信息都被關(guān)閉，這個(gè)過(guò)程

母體藍(lán)圖染色體要分裂4次；二是子鐘分裂，按照母體藍(lán)圖分裂的23對(duì)人類染色體己經(jīng)在

“母鐘分裂”過(guò)程中分別被打開，它們各自按照各自的“子代藍(lán)圖”進(jìn)行卜.面造器官的分裂，

一個(gè)個(gè)有機(jī)的器官?gòu)拇吮辉斐?，并且開始發(fā)揮各自的功能，這個(gè)過(guò)程子體藍(lán)圖染色體要分裂

24次（個(gè)物種染色體的不同，其分裂的次數(shù)也不同，不過(guò)一個(gè)總的原則是按染色體數(shù)分裂），

在24次分裂后，一個(gè)完整的人體就被造出來(lái)；三是孫鐘分裂，一個(gè)獨(dú)立的人體，在生長(zhǎng)發(fā)

育的過(guò)程中，還有一些器質(zhì)性和功能性的東西沒有出現(xiàn)，所以必須再打開，進(jìn)行再分裂。比

如七歲兒童脫牙，十多歲少年具有生育能力，有些遺傳病到一定時(shí)候的發(fā)作，等等。對(duì)應(yīng)三

種分裂，必須有三種控制分裂發(fā)生的手段。母鐘分裂是“端點(diǎn)（又叫端粒）控制體系”，這

種分裂的原始觸發(fā)點(diǎn)在外界，比如飄蕩在空氣中的細(xì)菌，它只要沒有接觸食物或易感物，就

永遠(yuǎn)是不產(chǎn)生分裂的原命，一旦接觸，在端點(diǎn)的作用下就開始母鐘分裂。子鐘分裂是受制于

子鐘染色體的端點(diǎn)，與外界刺激無(wú)關(guān)。孫鐘染色體分裂受制于染色體外相對(duì)應(yīng)的一些蛋白質(zhì)，

它們的功能僅僅是到一定時(shí)間將這個(gè)包含某信息的片段打開。依此看來(lái)，染色體就是人體的

生物鐘。所以我們將第一條受精卵叫“母鐘”，將母鐘分裂出來(lái)的23對(duì)染色體叫子鐘，將

23對(duì)染色體造出的各種組織器官所包含的染色體叫“孫鐘”，改變子鐘孫鐘的染色體都不可

以改變遺傳，只有改變母鐘的基因才可以造成“變異”。染色體可以攜帶“遺傳基因”但是

不能傳遞“打開信息”，打開某個(gè)基因段的所有信息都是通過(guò)染色體端點(diǎn)或染色體外的蛋白

質(zhì)發(fā)揮作用才完成分裂或復(fù)制的。分裂是染色體整體的，復(fù)制是染色體某個(gè)基因片段的。

端粒

是染色體末端的DNA重復(fù)序列，作用是保持染色體的完整性。細(xì)胞分裂一次，由于DNA

復(fù)制時(shí)的方向必須從夕方向到3,方向，DNA每次復(fù)制端粒就縮短一點(diǎn)。一旦端粒消耗殆盡，

染色體則易于突變而導(dǎo)致動(dòng)脈硬化和某些癌癥。因此，端粒和細(xì)胞老化有明顯的關(guān)系。一直

以來(lái)都知道精、卵細(xì)胞的端粒比成年體細(xì)胞的都長(zhǎng)許多。

端粒是存在于真核細(xì)胞線狀染色體末端的一小段DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，它與端粒結(jié)合蛋

白一起構(gòu)成了特殊的“帽子”結(jié)構(gòu)，能夠維持染色體的完整。

端粒DNA是由簡(jiǎn)單的DNA高度重復(fù)序列組成的，染色體末端沿著5,到3I方向的鏈富

含GT。在酵母和人中，端粒序歹lj分別為C1-3ATG1-3和TTAGGGCCCTAA,并有許多蛋白

與端粒DNA結(jié)合。端粒DNA主要功能有：第一，保護(hù)染色體不被核酸酶降解；第二，防止

染色體相互融合；第三，為端粒酶提供底物，解決DNA復(fù)制的末端隱縮，保證染色體的完

全復(fù)制。端粒、著絲粒和復(fù)制原點(diǎn)是染色體保持完整和穩(wěn)定的三大要素。同時(shí)，端粒又是

基因調(diào)控的特殊位點(diǎn)，?？梢种莆挥诙肆８浇虻霓D(zhuǎn)錄活性(稱為端粒的位置效應(yīng)，TPE)。

在大多真核生物中，端粒的延長(zhǎng)是由端粒酶催化的，另外，重組機(jī)制也介導(dǎo)端粒的延長(zhǎng)。端

粒(telomere)是由許多成串短的重復(fù)序列所組成。該重復(fù)序列通常一條鏈上富含G(G-rich),

而其互補(bǔ)鏈上富含C(C-rich)。一個(gè)基因組內(nèi)的所有端粒都是由相同的重復(fù)序列組成，但不

同物種的端粒的重復(fù)序列是不同的。

端粒除了含有重復(fù)DNA序列外，還包含有特殊的非核小體蛋白，即端粒結(jié)合蛋白“根

據(jù)該蛋白的結(jié)合特性分為兩類，一類與端粒重復(fù)序列特異性結(jié)合，在維持端粒長(zhǎng)度方面起到

重要作用，并且對(duì)端粒具有保護(hù)和調(diào)節(jié)作用；另一類與3,末端的單鏈突出結(jié)合，用于合成

染色體末端的帽子結(jié)構(gòu)以及調(diào)節(jié)端粒酶活性。

端粒作用：染色體由于融合、降解、重排而形成不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)從而威脅到DNA的正確復(fù)制和

細(xì)胞生存，端粒的存在能夠保護(hù)染色體免于化學(xué)修飾、被核酸降解以及因端端作用而產(chǎn)生的

威脅。端粒使染色體末端區(qū)域形成異染色質(zhì)，在細(xì)胞進(jìn)行減數(shù)分裂的過(guò)程中結(jié)合到核膜-特

定區(qū)域，使得染色體尋找同源染色體啟動(dòng)和配對(duì)的過(guò)程更加容易，并且保證了染色體分離的

正確性。在細(xì)胞有絲分裂的過(guò)程中，端粒會(huì)隨著分裂次數(shù)的增加逐漸縮短，當(dāng)端?？s短到一

定程度時(shí)便無(wú)法繼續(xù)維持染色體的穩(wěn)定，細(xì)胞最終死亡，故而能夠根據(jù)端粒的長(zhǎng)度預(yù)測(cè)細(xì)胞

的壽命。但是在生殖細(xì)胞中，端粒的長(zhǎng)度不隨細(xì)胞分裂而縮短，推測(cè)是由于生殖細(xì)胞中富含

端粒酶的緣故。

端粒酶

端粒顫是一種由RNA和蛋白質(zhì)組成的核糖核蛋白復(fù)合體，屬于“逆轉(zhuǎn)錄酶'人類的端

粒酶亞單位基因已被復(fù)制出來(lái),分別是端粒酶RNA(hTR)、端粒酶結(jié)合蛋白(hTPl)、端粒

酶活性催化單位(hTERT),它以自身的RNA作為端粒DNA復(fù)制的模版，合成出富含脫氧單

磷酸鳥昔(dGMP)的DNA序列后添加到染色體的末端并與端粒蛋白質(zhì)結(jié)合，從而穩(wěn)定「染色

體的結(jié)構(gòu)。

端粒酶活性檢測(cè)方法端粒重復(fù)序列擴(kuò)增程序(TRAP)：苜先利用端粒酶活性延伸前導(dǎo)鏈

?o依據(jù)不同來(lái)源端粒酶的作用特性來(lái)設(shè)計(jì)前導(dǎo)鏈引物堿基序列；其次用于端粒重復(fù)序列互

補(bǔ)的反向引物通過(guò)PCR擴(kuò)增端粒酶延伸產(chǎn)物。

端粒酶活性調(diào)控機(jī)制：端粒酶在不同細(xì)胞中對(duì)端粒的調(diào)控機(jī)制具有特異性。細(xì)胞自我更

新和增殖調(diào)控能夠調(diào)節(jié)端粒解活性，如干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等端粒陋活性一般高于體細(xì)胞，外

援信號(hào)也能夠激活端粒酶活性使體細(xì)胞表現(xiàn)出癌細(xì)胞無(wú)限增殖的特性。對(duì)細(xì)胞周期中幾個(gè)調(diào)

節(jié)點(diǎn)的調(diào)控很可能是決定瑞粒酶活性的潛在因素。

在腫瘤治療中的應(yīng)用：由于端粒酶在正常體細(xì)胞中幾乎不表達(dá)而在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)量較大，

故將其作為腫瘤治療的靶點(diǎn)，直接抑制其活性或是從基因?qū)用孢M(jìn)行操作，來(lái)抑制癌細(xì)胞分

化，治療癌癥。研究表明，端粒能抑制劑比傳統(tǒng)的癌癥化學(xué)療法和基因療法有更高的特異性

和較少的副作用，并且有更廣的應(yīng)用范圍，很可能對(duì)晚期擴(kuò)散腫瘤也能起到抑制效果。

在癌癥的診斷和預(yù)后評(píng)估中的應(yīng)用：腫瘤診斷中，在早期腫瘤細(xì)胞中經(jīng)常能夠檢測(cè)到端粒酶

活性的變異，在有轉(zhuǎn)移傾向的癌細(xì)胞組織中更是能夠檢測(cè)到端粒酶的高表達(dá)，因而對(duì)于癌癥

的早期診斷有著重要意義。同時(shí)了解端粒酶的結(jié)構(gòu)功能及其活性調(diào)控因素也有助于提高對(duì)于

腫瘤發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識(shí)，提供治療癌癥的新思路。

端粒、端粒酸與細(xì)胞壽命

細(xì)胞衰老是細(xì)胞生命活動(dòng)的必然規(guī)律，hayflick等指出：細(xì)胞，至少是培養(yǎng)的細(xì)胞，不

是不死的，而是有?定的壽命的：它們的增殖能力不是無(wú)限的，而是有?定的極限。這就是

著名的“Hayflick極限二Hayflick等還發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的增殖能力與供體的年齡有關(guān)。如從胎兒

肺得到的成纖維細(xì)胞可在體外條件下傳代50次，而從成人肺得到的成纖維細(xì)胞只能傳代20

次，提示這可能與成人細(xì)抱的端粒長(zhǎng)度小于胎兒細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度有關(guān)。

說(shuō)明染色體末端重復(fù)序列TITFAGGG(端粒)在細(xì)胞衰老過(guò)程中特異地依賴DNA復(fù)制而

丟失。相反，精子中的端粒長(zhǎng)度與受試者的年齡無(wú)關(guān)。這是因?yàn)榫又杏卸肆Ｃ傅谋磉_(dá)，使

端粒保持恒定長(zhǎng)度的緣故，所以，端粒的長(zhǎng)度被認(rèn)為是人體細(xì)胞壽命的標(biāo)志。

理論上說(shuō)，細(xì)胞的壽命決定于端粒的長(zhǎng)度和端粒DNA在體內(nèi)的消減速度。但有資料表

明，有一些動(dòng)物有較長(zhǎng)的瑞粒而壽命不長(zhǎng)，如老鼠的端粒長(zhǎng)達(dá)50Kbp?150Kbp，而人只有

15Kbp,但人比老鼠壽命長(zhǎng)得多。在酵母細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)，酵母細(xì)胞分裂24代之后會(huì)死亡，

但老年細(xì)胞沒有發(fā)現(xiàn)端粒的明顯縮短。所以端粒對(duì)細(xì)胞壽命的影響有多大尚難定論。

PAPER

討論課paper相關(guān)內(nèi)容(1989)：

作者通過(guò)篩選端粒變短而表現(xiàn)出的特有性狀來(lái)篩選出與端粒酶的酵母突變體，最后發(fā)現(xiàn)

一種突變體的端粒急劇縮短，并且表現(xiàn)出染色體缺失頻率升高的表型，這種突變體揭示了一

種新的基因/「577(「orevershortertelomeres),一直變短的端粒?？?7的無(wú)義等位基因并

不表現(xiàn)立即死亡，而是表現(xiàn)出一種衰老的癥狀，正是由于縮短的序列影響了端粒酶的功能，

導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定性增加，細(xì)胞也不斷死亡。突變體的另一個(gè)表型足，在高溫下生長(zhǎng)受到

抑制，這個(gè)能夠促使新陳代謝其他方面的改變，可能導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。他們猜想，端粒影響

染色體的穩(wěn)定性是從影響了核酸前體的水平，從而導(dǎo)致了多種表型的發(fā)生。

這篇paper證實(shí)了前人所做的猜想，端粒酶能影響染色的穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋

亡。Paper還提出一種假設(shè)，端粒的變短能夠影響細(xì)胞的代謝發(fā)生變化，從而也導(dǎo)致其凋亡。

端粒是染色體末端的DNA重復(fù)序列，它保證了DNA復(fù)制的完成和染色體的完整性。研

究表明在植物和動(dòng)物的端粒都是由簡(jiǎn)單相似的重復(fù)序列組成的。但是在這篇文章之前還沒有

找到端粒酶，不知道它的作用機(jī)制。這篇文章的出發(fā)點(diǎn)是如果和端粒復(fù)制相關(guān)的酶發(fā)生突變,

則不會(huì)導(dǎo)致立即的死亡而是緩慢的死亡或衰老。

流程:

用到的主要技術(shù)：

Southern印跡雜交是進(jìn)行基因組DNA特定序列定位的通用方法。一般利用瓊脂糖凝膠

電泳分離經(jīng)限制性內(nèi)切醯消化的DNA片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段

轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再與相對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記

探針進(jìn)行雜交，用放射自顯影或酶反應(yīng)顯色，從而檢測(cè)特定DNA分子的含量。

Southern印跡雜交技術(shù)是分子生物學(xué)領(lǐng)域中最常用的具體方法之一。其基本原理是：

具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下，可按堿基互補(bǔ)的原則形成雙鏈，此雜交

過(guò)程是高度特異的。由于核酸分子的高度特異性及檢測(cè)方法的靈敏性，綜合凝膠電泳和核

酸內(nèi)切限制酶分析的結(jié)果，便可繪制出DNA分子的限制圖譜。

用途：檢測(cè)樣品中的DNA及其含量，了解基因的狀態(tài)，如是否有點(diǎn)突變、擴(kuò)增重排等。

人工染色體：(artificialchromosome)指人工構(gòu)建的含有天然染色體基本功能單位

的載體系統(tǒng)。包括酵母人工染色體(YAC)、細(xì)菌人工染色體(BAC)、P1派生人工染色

體(PAC)、哺乳動(dòng)物人工染色體(MAC)和人類游離人工染色體(HAEC)。人工染色體為

基因組圖譜制作、基因分離以及基因組序列分析提供了有用的工具。如：YAC是有酵

母的自主復(fù)制序列、著絲點(diǎn)、四膜蟲的端粒以及酵母選擇性標(biāo)記組成的酵母線性克隆載體。

端粒酶的作用機(jī)制

4.陳勇老師蛋白質(zhì)科學(xué)

ProteinScience陳勇

第一節(jié)概述

一、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)組成

一級(jí)結(jié)構(gòu)：氨基酸序列；

二級(jí)結(jié)構(gòu)：a螺旋、310螺旋、兀螺旋、*折疊、*轉(zhuǎn)角，超二級(jí)結(jié)構(gòu)是由兩個(gè)以上二級(jí)

結(jié)構(gòu)組成的motif：

三級(jí)結(jié)構(gòu)：指由一級(jí)結(jié)構(gòu)元件構(gòu)建成的總?cè)S結(jié)構(gòu)，包括一級(jí)結(jié)構(gòu)中相距較遠(yuǎn)肽段之間的兒

何相互關(guān)系和側(cè)鏈在三維空間中彼此間的相互關(guān)系；

四級(jí)結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)分子或復(fù)合物的多亞基結(jié)構(gòu)和分子聚合體。

二、蛋白質(zhì)特點(diǎn)總結(jié)：

蛋白質(zhì)是由氨基酸按照特定序列連接通而成的生物大分子；具有一定的分子質(zhì)晟和電荷,

復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能。

蛋白質(zhì)的生化特性分析方法：

1組成：酸水解，6MHCI,105℃,18h,打斷所有的肽健，HPLC分析；序列分析：Edman

降解，MASS

蛋白酶水解，將蛋白水解為多肽，用質(zhì)譜進(jìn)行分析

2質(zhì)量：絕對(duì)質(zhì)量：沉降分析，靜態(tài)光散射分析

相對(duì)質(zhì)量：SDS,凝膠過(guò)濾

蛋白濃度測(cè)定:Nitrogencontent(16%)Kjeldahltest凱氏定氮法

Regularlyusedmethods:

UVabsorptionat280nm(aromaticresidues:W&Y);205-22Cnm(peptidebond)

Dyebinding(Bradford)

Bis-cinchonicacid(BCA)reagent

Lowry-Folin-Ciocaleaureagent

Biuret-alkalinecopperreagent堿性銅試劑雙縮腺法

3電荷：等電點(diǎn)測(cè)定：等點(diǎn)聚焦法；

2D電泳法：一維先利用等點(diǎn)聚焦法分離(等電點(diǎn)分離)，二維采用SDSpage分離(質(zhì)量)

4結(jié)構(gòu)：

蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性：

Thermalshiftassay蛋白質(zhì)熱轉(zhuǎn)移技術(shù)

差示掃描量熱法(DSC)

差示掃描量熱法(differentialscanningcalorimetry,DSC),一種熱分析法。在程序控制

溫度下，測(cè)量輸入到試樣和參比物的功率差(如以熱的形式)與溫度的關(guān)系。差示掃描量熱

儀記錄到的曲線稱DSC曲線，它以樣品吸熱或放熱的速率，即熱流率dH出(單位亳焦秒)

為縱坐標(biāo)，以溫度T或時(shí)間t為橫坐標(biāo)，可以測(cè)定多種熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)參數(shù)，例如比熱容、

反應(yīng)熱、轉(zhuǎn)變熱、相圖、反應(yīng)速率、結(jié)晶速率、高聚物結(jié)晶度、樣品純度等。

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)：

circulardichroism(CD),圓二色

用于推斷非對(duì)稱分子的構(gòu)型和構(gòu)象的一種旋光光譜,是研究稀溶液中蛋白質(zhì)構(gòu)象的一種

快速、簡(jiǎn)單、較準(zhǔn)確的方法。它可以在溶液狀態(tài)下測(cè)定，較接近其生理狀態(tài)。而且測(cè)定方汰

快速簡(jiǎn)便，對(duì)構(gòu)象變化靈敏，所以它是目前研究蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要手段之并已廣泛

應(yīng)用于蛋白質(zhì)的構(gòu)象研究中。

結(jié)構(gòu)解析研究：

MaintechniquesinStructuralBiology

,X-raymacromolecularcrystallography

,Solutionnuclearmagneticresonance(NMR)

?Electroncryomicroscopy(Cryo-EM)

?Theoreticalmodeling

?Others:smallangleX-rayscattering,electrondiffraction,massspectrometryetc.

5功能：

蛋白質(zhì)修飾：乙酰化、泛素化、甲基化、磷酸化

利用質(zhì)譜分析探測(cè)蛋白質(zhì)修飾

第二節(jié)蛋白純化與相互作用研究

一、蛋白純化

1Differentsolubilities

鹽析:鹽或有機(jī)分子可逆沉淀。大多數(shù)蛋白質(zhì)在高鹽濃度下溶解性較差，這種效應(yīng)稱為鹽析。

蛋白質(zhì)沉淀的鹽濃度因蛋白質(zhì)而異。因此，鹽析可用于分離蛋白質(zhì)。透析可以用來(lái)去除鹽。

最常用，便宜，溶解度高，不會(huì)導(dǎo)致蛋白變性

(NH4)2SO4：

2Differentsizes

?Differentialcentrifugationasafirststepinproteinpurification

?Dialysis-Separationbasedonsize通常用于將蛋白與小分子分離

③SizeExclusion(gel-filtration)chromatography分子排阻色譜,主要根據(jù)凝膠孔隙的孔徑大

小，高分子樣品分子的線由尺寸間的相對(duì)關(guān)系而對(duì)溶質(zhì)進(jìn)行分離的分析的方法，大分子先出

峰，小分子后出峰

@SDS

3Differentcharges

Ion-ExchangeChromatography-SeparationBasedonCharge

以離子交換樹脂作為固定相，樹脂上具有固定離子基團(tuán)及可交換的離子基團(tuán)。當(dāng)流動(dòng)相

帶著組分電離生成的離子通過(guò)固定相時(shí)，組分離子與樹脂上可交換的離?子基團(tuán)進(jìn)行可逆變換。

根據(jù)組分離子對(duì)樹脂親介力不同而得到分離。進(jìn)而用遞增的鹽濃度梯度競(jìng)爭(zhēng)性洗脫分離的目

的蛋白。

4Differentligandbindings

Affinitychromatography親和色譜

將一-對(duì)能可逆結(jié)合和解離生物分子的一方作為配基(也稱為配體)，與具有大孔徑、親

水性的固相載體相偶聯(lián)、制成專一的親和吸附劑，再用血親和吸附劑填充色譜柱，當(dāng)含有被

分離物質(zhì)的混合物隨著流